9.7 分子荧光与分子磷光分析法 分子荧光与分子磷光分析法
1575年，西班牙医生N.Monardes发现。 发现。 1852年，Sir George Stokes对荧光产生的机 理作了解释， 理作了解释，并提出了“荧光”。 1867年，首次用于分析测定。 首次用于分析测定。 1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。 提出第一台光电荧光计。 1952年，商品荧光分光光度计出现。 商品荧光分光光度计出现。
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9.7.1 发光机理(Jablonski Diagram)
荧光寿命: 10－9～10－7 s 磷光寿命: 10－4～10 s
分子吸光与发光示意图
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蒽的激发光谱 吸收光谱）和发射光谱（ 荧光光谱） 蒽的激发光谱（ 激发光谱（吸收光谱） 发射光谱（荧光光谱）
吸收光谱 发射光谱
激发光谱:Excitation Spectrum, 激发波长:λex 发射光谱 Emission Spectrum, 发射波长:λem
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镁-Oxine的激发光谱和发射光谱
λ/
荧光分析法测定血清中的镁
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荧光光谱的特点
Stokes位移 Stokes位移： 位移：分子荧光的发射峰相对于吸收 峰位移到较长的波长. 峰位移到较长的波长. 荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关. 荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关. 镜像规则： 镜像规则：荧光发射光谱和它的吸收光谱呈 镜像对称关系. 镜像对称关系.
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9.7.2 定量分析的基础
—荧光强度(F )与物质浓度(c)的关系 在稀溶液中 稀溶液中： F＝2.3Kφεb cI0＝2.3KφAI0
φ —荧光物质的荧光效率(量子产率)： 发射荧光的量子数 φ= 吸收激发光的量子数 ε—荧光物质的吸光系数
b—液层厚度 I0—入射光强度 K—检测效率（ 检测效率（由仪器决定） 由仪器决定）
当b，I0一定时： 一定时： F＝Kc
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高浓度时 高浓度时，荧光物质发生自熄灭 荧光物质发生自熄灭和 自熄灭和 自吸收现象 自吸收现象， 现象，使F与c不呈线性关系
F F
cc 一般当εb c ≤ 0.05 时, F 与c呈线性关系
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9.7.3 荧光与分子结构的关系
1.共轭效应 1.共轭效应 π →π* 跃迁
五元杂环上取代苯基. 芳香族化合物、 芳香族化合物、五元杂环上取代苯基. 共轭体系越大, 共轭体系越大,越易产生荧光, 越易产生荧光,荧光效率也增大. 荧光效率也增大.
─(CH=CH)2─
φ=0.28 φ=0.68
8
─(CH=CH)3─
2. 刚性结构和共平面效应
-O C COOO -O O C COOO
酚酞(无荧光)
荧光黄
O N Mg N O
N O-
8－羟基喹啉(弱荧光)
红色荧光
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联二苯 φ= 0.2
芴 φ= 1.0 C H 2
3,4-苯并芘
( 强荧光物质)
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3. 取代基的作用
给电子基增强荧光： 给电子基增强荧光： －OH,－OR,－NH2,－NHR,－NR2,－C≡N 吸电子基减弱荧光： 吸电子基减弱荧光： －COOH,－C=O,－NO2,－N＝N,－Cl,－Br,－I 与π体系作用小的取代基影响不明显： 体系作用小的取代基影响不明显： －SO3R,－NH3＋,－SH,－F,－R。
NH2 OH
比
COOH NO2
I
荧光强50倍
无荧光
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取代基之间若发生氢键， ，增强分子平面性和刚 取代基之间若发生氢键 性会加强荧光:
COOH COOH
水杨酸
O C OH OH 中性、 中性、碱性 均有荧光
OH OH 无荧光 碱性 有荧光
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9.7.4 影响荧光强度的主要因素 1. 浓度 浓度： ：稀溶液， (εbc≤0.05) 稀溶液，F∝c 2. 光源： 稳定。 光源： F∝I0 ， 应强度大， 应强度大，稳定。 3. 温度： 温度：T 低，φ增加。 增加。 荧光素钠的乙醇溶液, T<0℃时,每降低 10℃, φ增加3%, -80 ℃时φ=100% . 4. 酸度：
OH O—
无荧光
有荧光
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9.7.5 荧光光度计及荧光测定方法
I0 It
氙灯(或高压汞灯） 或高压汞灯） （200-800 nm)
F
光电倍增管
荧光光度计示意图
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荧光仪部件
激发光源: 能够在紫外-可见光区连续发光， 可见光区连续发光，
常用氙灯 常用氙灯、 氙灯、高压汞灯或 高压汞灯或激光光源.
样品池: 石英池, 四壁透明. 单色器: 两个光栅单色器 两个光栅单色器, 分置于样品池前后. 检测器: 光电池或光电倍增管 光电池或光电倍增管, 与激发光成直角的 与激发光成直角的
方向检测荧光 方向检测荧光.
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荧光光度计光路图
电源 光度计 记录仪 光电倍增管 光源 试样液池
光栅
反 射 镜
栅 光
镜 器 射 色 反 单 射 发
激 发 单 色 器
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测定方法—标准曲线法
1. 确定λex和λem (激发光谱和发射光谱)； 2. 确定适宜的 确定适宜的条件 条件: 试剂浓度、 试剂浓度、pH、T、t 等； 3. 以标准溶液做工作曲线 以标准溶液做工作曲线； 工作曲线； 4. 测未知样的荧光强度 测未知样的荧光强度(F), 根据工作曲线 计算荧光物质的浓度.
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9.7.6 荧光分析法的特点和应用
灵敏度高： ：测定下限0.1～0.001 μg/mL, 灵敏度高
比分光光度法高2～4个数量级。 个数量级。 （在黑背景下检测； 在黑背景下检测；光源的强度大） 光源的强度大）
： 选择性高： 选择性高
适当选择激发光的波长和荧光测定的波 长； 应用荧光寿命的差别 –时间分辨技术。 时间分辨技术。
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荧光测定的选择性
蒽
蒽的激发和发射光谱
菲
菲在360 nm以上无吸收， 以上无吸收，用 365 nm激发光时， 激发光时，菲无荧光， 菲无荧光， 可以在400 nm测定蒽的荧光。 测定蒽的荧光。 在265 nm, 蒽和菲均有吸收， 蒽和菲均有吸收， 以此波长的光激发， 以此波长的光激发，在350 nm 只有菲有荧光， 只有菲有荧光，故可测定菲。 故可测定菲。
菲和蒽的荧光光谱 （激发波长 265 nm)
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MFS与UV/Vis 法比较： 法比较：
原理 UV/Vis 吸收 MFS 发射
灵敏度, 选择性 10-5～10-6mol·L-1 10-7～10-9 mol·L-1
I0 F
测定方法
I0 F It
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第五章分子发光分析法 2、简述影响荧光效率的主要因素 答：荧光效率（Ψ?）＝发荧光的分子数/激发态分子总数。荧光效率越高，辐射跃迁概率越大，物质发射的荧光也就越强，则Ψ?＝K?/( K?+∑Ki)， 一般来说，K?主要取决于物质的化学结构，而∑Ki则主要取决于化学环 境，同时也与化学结构有关，其影响因素有： ①分子结构：发荧光的物质分子中必须含有共轭双键这样的强吸收基 团，且共轭体系越大，л电子的离域性越强，越易被激发而产生荧光。 随着共轭芳环增大，荧光效率提高，荧光峰向长波方向移动。 ②a其次，分子的刚性平面结构有利于荧光的产生，有些有机配位剂与金属离子 形成螯合物后荧光大大增强；b给电子取代基如－OH、－NH 2、－NR 2 和-OR等可 使共轭体系增大，导致荧光增强；吸电子基如－COOH、－NO和－NO 2 等使荧光减弱，c随着卤素取代基中卤素原子序数的增加，物质的荧光减弱，而磷光增强。 ③环境a溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大；b对于大多数荧光物质，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低；c大多数含酸性或碱性取代基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液PH的影响很大；d溶液中表面活性剂的存在减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率；e溶液中溶解氧的存在，使激发态单重态分子向三重态的体系间窜跃速率加大，会使荧光效率减低。 3、试从原理和仪器两方面比较吸光光度法和荧光分析法的异同，并说明为什么 荧光法的检出能力优于吸光光度法 答：原理：紫外－可见吸收光谱法是根据溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的吸收来研究物质的组成和结构的方法，而荧光分析法是由于处于第一激发单重态最低能级的分子以辐射跃迁的形成返回基态各振动能级时产生的荧光的分析方法，两者的区别在于前者研究的是吸收光谱，且电子跃迁为激发态的振动能级到基态的振动能级间的跃迁。 仪器：荧光分析仪器与分光光度计的主要差别有：a 荧光分析仪器采用垂直测量方式，即在与激发光相垂直的方向测量荧光，以消除透射光的影响；b 荧光分析器有两个单色器，分别用于获得单色器较好的激发光和用于分出某一波长的荧光，消除其它杂散光干扰。 因为荧光分析法的灵敏度高，其检出限通常比分光光度法低2～4个数量级，选择性也比分光光度法好，这是由于：a 荧光分析仪器在与激发光相垂直的方向测量荧光，与分光光度在一直线上测量相比，消除了透射光的影响，测量更为准确，灵敏度高；b 吸光光度法只采用一个单色器，而荧光分析仪器有两个单色器，
第七章分子发光分析 一．教学内容 1．荧光和磷光分析法的基本原理（光谱的产生、各种光谱的特征、光谱与化合物结构的关系、强度及影响因素等） 2．荧光和磷光仪器 3．荧光、磷光分析法的特点及大致应用 4．化学发光的基本原理、发光类型、仪器及大致应用 二．重点与难点 1．分子的去激发过程及荧光、磷光的发射 2．荧光、磷光的发射与物质结构的关系 3．各种光谱的特征、区别与联系 4．荧光（磷光）强度表达式的意义及影响因素 三．教学要求 1．基本掌握荧光和磷光发射的原理及与物质结构的关系 2．了解各种光谱的绘制方法、特征与联系 3．掌握强度表达式的意义、影响因素及适应性 4．掌握荧光、磷光仪器的组件、工作流程及异同点 5．基本了解化学发光分析法的原理、发光类型、仪器、特点及大致应用 6．了解荧光、磷光分析的大致应用 第一节分子荧光和磷光分析 一、基本原理 （一）荧光和磷光的产生
在电磁辐射基础中，已经简单地讨论过荧光及磷光的产生机理。这里将根据分子结构理论，将进一步讨论。 处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4~ 1s以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫（VR）、内部转移（IR）、系间窜跃（IX）及外部转移（EC）等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。 下面结合荧光和磷光的产生过程，进一步说明各种能量传递方式在其中所起的作用。设处于基态单重态中的电子吸收波长为λ1和λ2的辐射光之后，分别激发至第二单重态S2及第一单重态S1。
1 荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2 荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3 光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态， 用S i 表示，由此可推出，S 即为基态的单重态，S 1 为第一跃迁能级激发态的单重 态，S 2 为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子 在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T 1 即为第一激发态中 的三重态，T 2 即为第二激发态中的三重态，以此类推。
分子荧光分析法基本原理 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即 ?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”； “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。 （二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
紫外可见吸收光谱 一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱，是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 二紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征（即物质分子的能量具有不连续的特征）。一个分子有一系列能级，其中包括许多电子能级，分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱 分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，从化学键的性质上考虑，与电子光谱有关的主要是三种电子：（1）形成单键的σ电子；（2）形成双键的π电子；（3）分子中非键电子即n 电子。 化合物不同，所含的价电子类型不同，所产生的电子跃迁类型不同，根据分子轨道理论，分子中这三种电子能级的高低次序大致是：（σ）＜（π）＜（n）＜（π*）＜（σ* ）σ,π是成键轨道，n 是非键轨道，σ* ,π* 是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。 二紫外光谱的表示方法
紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的。 横坐标表示吸收光的波长，用nm（纳米）为单位。 纵坐标表示吸收光的吸收强度，可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、 (吸收系数) 中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置，纵坐标为它的吸收强度。
四、紫外光谱中常用的几个术语 1.发色基团和助色基团 发色基团：是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团，不论是否显示颜色都称为发色基团。一般不饱和的基团都是发色基团（C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等） 助色基团：指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团，但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波，同时使吸收强度增加。助色基团通常是由含有孤对电子的元素所组成（-NH2, -NR2, -OH , -OR , -Cl等），这些基团借助P-π共轭使发色基团增加共轭程度，从而使电子跃迁的能量下降。 2．红移、蓝移、增色效应和减色效应 由于有机化合物分子中引入了助色基团或其他发色基团而产生
1．荧光和磷光的产生过程？ 荧光：处于基态的分子吸收光子能量，跃迁至电子激发态，然后通过内转换和振动弛豫回到第一激发单重态的最低振动能级，最后跃迁回基态时发射的光 S0激发态振动弛豫内转换振动弛豫发射荧光 磷光：处于基态的分子吸收光子能量，跃迁至电子激发态，然后通过内转换和振动弛豫和系间窜越到了第一激发三重态，最后回到基态时发射的光 S0激发态振动弛豫内转换系间跨越振动弛豫发射荧光 2.激发光谱和发射光谱概念，有何异同？ （1）激发光谱：固定发射光的波长，测量激发光的波长与发射光强度之间的关系（选择最佳激发波长） （2）发射光谱：固定激发波的波长，测定发射光强度与发射光波长的关系（选择最佳发射波长） 同：都是给样品能量使之发光测量发光强度 异：控制的变量不同。 3.化合物荧光与结构的关系？ a．具有一定的荧光量子产率 b．具有合适的结构 如：大的共轭π键、刚性平面结构、最低的单重电子激发态为S1 为π* π型、取代基为给电子基团 4.荧光量子产率、荧光猝灭、系间跨越、振动弛豫？ A．荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。 B．荧光猝灭：指荧光物质分子与溶剂分子之间相互作用，导致荧光强度下降的现象，荧光猝灭分为静态猝灭、动态猝灭等。 C．系间跨越：处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程；分子由激发单重态跨越到激发三重态。 D．振动弛豫：同一电子能级内异热交换形式由高振动能级至地振动能级间的跃迁。 时间为10-12s 5.实时定量PCR与普通PCR的区别？ 所谓实时荧光定量PCR技术[1]，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 实时荧光定量PCR技术是起点检测，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。具有重现性，误差小的特点。 传统PCR技术是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的
分子荧光分析法 发光光谱：物质分子或原子吸收辐射被激发后，电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级，再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为荧光、磷光。 根据物质接受的辐射能量的大小及与辐射作用的质点不同，荧光分析法可分为以下几种： 1. X射线荧光分析法 用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X 射线范围内的荧光。 2. 原子荧光分析法： 待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。 荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。 荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。 3. 分子荧光分析法： 有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。
基本原理 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂， 称“单线态”； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1 其多重性：M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”； “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。（二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能
简述荧光与磷光的产生原理及应用，并说明有机物结构是如何影响荧光的。 具有荧光性的分子吸收入射光的能量后，其中的电子从基态（通常为自旋单重态）跃迁至具有相同自旋多重度的激发态。处于各激发态的电子通过振动驰豫、内转移等无辐射跃迁过程回到第一电子激发单重态的最低振动能级。然后再由这个最低振动能级跃迁回到基态时，发出荧光。 由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光。 荧光与磷光的根本区别：荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的；而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。 荧光主要用于元素及有机化合物的荧光测定，照明，印刷防伪技术，生化和医药方面等。 磷光分析主要用于测定有机化合物，如石油产品、多环芳烃、农药、药物等方面。 有机物结构对荧光的影响主要有以下方面：（1）跃迁类型：相对于n→π*跃迁，π→π* 跃迁能发出较强的荧光（较大的量子产率）。（2）共轭效应：增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大。(3) 刚性平面结构：多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。（4）取代基效应：给电子基团使荧光增强，吸电子基团，会减弱甚至会猝灭荧光；卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低；取代基的空间障碍对荧光也有影响；立体异构现象对荧光强度有显著的影响。 电镜题目 1、从电子显微镜可以得到哪些信息？ 答：形貌、高分辨像、电子衍射图象、X射线能谱分析. 2、透射电子显微镜和扫描电子显微镜有何不同？它们分别适合什么样的样品？ 答：TEM采用透过薄样品的电子束成像来显示样品内部组织形态与结构，可同时观察微观组织形态及分析材料的结构与成分；而SEM利用电子束在样品表面扫描激发出来的代表样品表面特征的信号成像，可观察样品表面形貌及做成分分析、成分分布. TEM适用于薄样品，SEM适用于厚样品. 3、为取高分辨真实像的TEM相片，制备试样应主意哪些问题？ 答：TEM的试样制备是获取高分辨率真实像的前提，为了避免或减少电子穿透试样时的能量损失，从而减少色差，试样要制作得足够薄，一般需小于100 nm ；但又要尽可能保持试样原来状态.
1．荧光和磷光的产生过程 荧光：处于基态的分子吸收光子能量，跃迁至电子激发态，然后通过内转换和振动弛豫回到第一激发单重态的最低振动能级，最后跃迁回基态时发射的光 S0 激发态振动弛豫内转换振动弛豫发射荧光 磷光：处于基态的分子吸收光子能量，跃迁至电子激发态，然后通过内转换和振动弛豫和系间窜越到了第一激发三重态，最后回到基态时发射的光 S0 激发态振动弛豫内转换系间跨越振动弛豫发射荧光 2.激发光谱和发射光谱概念，有何异同 （1）激发光谱：固定发射光的波长，测量激发光的波长与发射光强度之间的关系（选择最佳激发波长） （2）发射光谱：固定激发波的波长，测定发射光强度与发射光波长的关系（选择最佳发射波长） 同：都是给样品能量使之发光测量发光强度 异：控制的变量不同。 3.化合物荧光与结构的关系 a．具有一定的荧光量子产率 b．具有合适的结构 如：大的共轭π键、刚性平面结构、最低的单重电子激发态为S1 为π* π型、取代基为给电子基团 4.荧光量子产率、荧光猝灭、系间跨越、振动弛豫 A．荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。 B．荧光猝灭：指荧光物质分子与溶剂分子之间相互作用，导致荧光强度下降的现象，荧光猝灭分为静态猝灭、动态猝灭等。 C．系间跨越：处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过
程；分子由激发单重态跨越到激发三重态。 D．振动弛豫：同一电子能级内异热交换形式由高振动能级至地振动能级间的跃迁。 时间为10-12s 5.实时定量PCR与普通PCR的区别 所谓实时荧光定量PCR技术[1]，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 实时荧光定量PCR技术是起点检测，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。具有重现性，误差小的特点。 传统PCR技术是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。 6.简述影响荧光效率的主要因素 1.
分子荧光分析法基本原理 发布日期：2005-10-07 浏览次数：9297 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂， 称―单线态‖； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即?S=0，则激发态仍是单线态，即―单线(重)激发态‖； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1 其多重性：M=2S+1=3
即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为―三线(重)激发态‖； ―三线激发态‖ 比―单线激发态‖ 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。 （二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为―去活化过程‖，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
9.7 分子荧光与分子磷光分析法 分子荧光与分子磷光分析法
1575年，西班牙医生N.Monardes发现。 发现。 1852年，Sir George Stokes对荧光产生的机 理作了解释， 理作了解释，并提出了“荧光”。 1867年，首次用于分析测定。 首次用于分析测定。 1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。 提出第一台光电荧光计。 1952年，商品荧光分光光度计出现。 商品荧光分光光度计出现。
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9.7.1 发光机理(Jablonski Diagram)
荧光寿命: 10－9～10－7 s 磷光寿命: 10－4～10 s
分子吸光与发光示意图
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蒽的激发光谱 吸收光谱）和发射光谱（ 荧光光谱） 蒽的激发光谱（ 激发光谱（吸收光谱） 发射光谱（荧光光谱）
吸收光谱 发射光谱
激发光谱:Excitation Spectrum, 激发波长:λex 发射光谱 Emission Spectrum, 发射波长:λem
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镁-Oxine的激发光谱和发射光谱
λ/
荧光分析法测定血清中的镁
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荧光光谱的特点
Stokes位移 Stokes位移： 位移：分子荧光的发射峰相对于吸收 峰位移到较长的波长. 峰位移到较长的波长. 荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关. 荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关. 镜像规则： 镜像规则：荧光发射光谱和它的吸收光谱呈 镜像对称关系. 镜像对称关系.
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