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第五章 分子发光分析法(讲义)

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五章分子发光分析法

五章分子发光分析法


第一章 绪论
二、磷光分析法
4、 室 温 磷 光 固 胶 体 束 表 增 面 稳 磷 室 光 温 磷 光 5、 磷 光 分 析 仪 器 磷 试 光 样 镜 室 → 消 除 荧 光 的 干 扰
6、应用：与荧光分析法相互补充。
化学与化学工程学院分析化学精品课程组制
第一章 绪论
三、化学发光分析法
强
度
的
因
素
化
学
环
境
溶 剂 的 极 性 (大
温度( pH值
低
)
，↑
表
面
活
性
剂
，↑
顺 磁 性 物 质 ，↓
) If ↑，
λ f↑
化学与化学工程学院分析化学精品课程组制
第一章 绪论
一、荧光分析法
6、荧光分析仪器：
⑴2个单色器(激发光、荧光) ⑵吸收池(四面透明) ⑶检测器方向与激发光成直角
②间接化学发光：
C* +F → C+F*， F*→F+hv
③气相化学发光：
2O3+C2H4 →2HCHO*+2O2 ↓CH2O+hv(435nm)
化学与化学工程学院分析化学精品课程组制
第一章 绪论
三、化学发光分析法
④液相化学发光：
a、鲁米诺(发光效率0.01～0.5)
3-氨基苯二甲酸肼测 测H生 2O 物2物 质 拓 宽 ( 有 机 金物 属)离子 鲁米诺+H2O2 金 属 离子 催化 产物+hv(425nm) 氨基酸+O2 氨 基 酸氧 化酶 酮酸+NH3+H2O2
化学发光是由化学反应激发物质所产 生的光辐射。 1、产生条件：
第五章 分子发光分析法PPT课件

第五章 分子发光分析法PPT课件


菏泽学院化学与化工系
9
(二) 荧光效率及其影响因素 1. 荧光效率 发射荧光的分子数目与激发态分子总数的比值。
荧光效率（f）=
发荧光的分子数 激发态分子总数
也可以各种跃迁的速率常数表示
f
Kf K f Ki
式中：Kf为荧光发射过程的速率常数，∑Ki为非辐射跃迁的 速率常数之和。一般来说，Kf决定于物质的化学结构；∑Ki 主要决定于化学环境，同时也与化学结构相关，有分析应用
长；
‘ 2
>
2
>
1
；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（
T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～100 s 。
光照停止后，可持续一段时间。
2020/10/31
的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。
外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转
移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”
。
系间跨越(intersystem conversion)：不同多重态,有重叠的转动
能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋
—轨道耦合进行。
2020/10/31
❖ 直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度 计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种 现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是 由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念， 他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。
2020/10/31
分子发光光谱法

分子发光光谱法


振动驰豫
S2
S1 系
间
内转换
跨 跃
T1
外转换
S0 λ1 吸光
λ2 λ3 吸光 荧光
S0 λ4 磷光
荧光发射：当分子处在单重态的最低振动能层时， 去激发过程是以10-7～10-9s左右的时间内发射一个 光子回到基态。
磷光发射：激发态分子经过系间跨跃到激发三重态 后，并经过迅速的振动驰豫到达第一激发三重态 （T1）的最低振动能级上，从T1态分子经发射光子 返回基态。 磷光的寿命比荧光的要长得多
• 从图中看出 • 磷＞ 荧＞ 激 * 易产生荧光 n * 易产生磷光
二、激发光谱和发射光谱
固定荧光的最大发射波长，然后改变激发光的波 长，根据所测得的荧光强度与激发光波长的关系作图， 得到激发光谱曲线。
选择最大激发波长作为激发光波长，然后测定不 同发射波长时所发射的荧光或磷光强度，得到荧光或 磷光光谱曲线。
碰撞熄灭将随温度的升高而增加；将随溶液黏度的减小而增大。
（ⅱ）能量转移 它是指处于激发单重态的荧光分子M*与熄灭 剂相互作用后，发生能量转移，使熄灭剂得到激发，其反应如下
(ⅲ) 组成化合物的熄灭 它是指熄灭剂和荧光分子在基态时发生 配合反应，生成不发荧光的配合物。
(ⅳ) 自熄灭和自吸收 当荧光物质浓度较大时，常会发生自 熄灭现象，这可能由于激发态分子之间的碰撞引起能量损 失。假如荧光物质的吸收光谱和发射光谱有较大的重叠， 由荧光物质发射的荧光，有一部分可能会被它自身的基态 分子所吸收，这种现象称为自吸收。随荧光物质浓度的增 加，自吸收现象将会加剧。
荧光—荧光分析法
光致发光：以光源来激发而发光 磷光—磷光分析法
化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析
法
分子发光分析法

分子发光分析法

第五章 分子发光分析法: 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。

第一节 荧光分析法一、概 述 :分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。

与分光光度法相比，荧光分析法的最大优点是灵敏度高和选择性高。

二、荧光产生的基本原理（一）分子荧光的产生（二）荧光效率及其影响因素1.荧光效率2.荧光与分子结构的关系（1）产生荧光的条件①必须含有共轭双键这样的强吸收基团，并且体系越大， 电子的离域性越强，越容易被激发产生荧光；大部分荧光物质都含有一个以上的芳香环，且随共轭芳环的增大，荧光效率越高，荧光波长越长。

②分子的刚性平面结构有利于荧光的产生③.取代基对荧光物质的荧光特征和强度的影响 给电子基团：-OH 、-NH2、-NR2和-OR 等可使共轭体系增大，导致荧光增强。

吸电子基团：-COOH 、-NO 和-NO2等使荧光减弱。

随着卤素取代基中卤原子序数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。

3.环境因素对荧光强度的影响（1）溶剂极性对荧光强度的影响: 一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。

溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大. 奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。

（2）温度荧光强度的影响: 一般情况下，辐射跃迁的速率基本不随温度而改变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。

对大多数的荧光物质而言，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。

由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光的影响比荧光更大。

（3）pH 对荧光强度的影响:共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。

另外，溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。

第五章分子发光分析法

第五章分子发光分析法


AMP·LH2 ·E + O2 [氧化荧光素]* + AMP+CO2 + H2O [氧化荧光素]* 氧化荧光素 + h
最大发射波长562nm；
2019/5/29
生物发光分析应用 2
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用 下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应 ：
2019/5/29
2.化学发光效率
发射光子的分子数
cl 参加反应的分子数 ce em
化学效率：
激发态分子数
ce 参加反应分子数
发光效率：
产生光子数
em 激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
I
cl
t



cl

dc dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
第五章
一、基本原理
分子发光分析法 principle 二、化学发光分析的特点
molecular luminescence characteristics
analysis
三 装置与技术
第三节 化学发光分析法
instrument and technology
chemiluminescence analysis
结束
2019/5/29
氨基酸 +
氨基酸氧化酶
O2
酮酸 +NH3 + H2O2
葡萄糖氧化酶
葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2
通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。
2019/5/29
草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接 受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光 ，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光( 冷光源)。
第五章分子发光分析法讲义

第五章分子发光分析法讲义

⑵、内转换（ic）
指相同多重态的两个电子态之间（S2 S1，S1 S0） 的非辐射跃迁。当两个电子能级非常靠近以至其振动能 级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转 移至低能级。如图中S2的较低振动层与S1的较高振动层 相重叠，分子无论在哪一个激发单重态，都能通过振动 驰豫和内转化跃回到第一激发单重态的最低振动能级。
例: 区别谱图中的 三个峰，说明判断
原则。
（三）、荧光效率及其影响因素：
1、分子产生荧光必须具备的条件：
⑴、分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的 结构，才能吸收激发光；
⑵、吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光量子产率（荧光效率）
2、荧光效率 ⑴、荧光效率
发荧光的分子数
f 激发态分子总数
在溶液中存在如氧分子等顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生，因而使荧光减弱。
4）、荧光发射（Fluorescence） 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活
化过程的一种形式是以10-9~10-6s左右的短时间发射一 个光子返回基态。这一过程称为荧光发射。 （单重— 单重，停10-9——10-6s ）
2
S2 1
V=0
2
S1 1
V=0
VR
ic
F
S0
3 2
1
V=0
λ1 λ2 λ3
isc
2 1
T1
V=0
VR
P
ic
isc
F P
（二）荧光的激发光谱和发射光谱
1、激发光谱：荧光和磷光都是光致发光，因此必须选择 合适的激发光波长，这可从他们的激发光谱曲线来确定
以荧光（磷光）的最大发射波长为测量波长，改变 激发光的波长，测量荧光强度的变化，以激发光波长为 横座标，荧光强度为纵座标作图，即可得到激发光谱。
第五章_分子发光分析法(好)

第五章_分子发光分析法(好)

固定待观测的发射波长，改变激发光（入射光）波长， 根据化合物发射的荧光(磷光)强度与激发光波长的关系得激 发光谱曲线 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大。
2.荧光发射光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长 ( 选 最大激发波长),扫描发射 光波长，根据化合物发射 的荧光(或磷光)强度与发 射光波长关系得到的曲线 (图中曲线II或III)。
使荧光减弱。如：硝基苯为非荧光物质。
（iii）卤素取代基随原子序数的增加，物质的荧光减弱， 而磷光增强 （重原子效应：重原子取代促进了荧光体中的电子自旋 -轨道的偶合作用，系间窜越S1—T1概率大）。
三、影响分子发光的环境因素
1．溶剂的影响
荧光体的基态与激发态的偶极矩不同，与溶剂分子的 偶极之间存在的静电相互作用也不同； 激发时发生π→π ＊ 跃迁，激发态的极性更大，若溶
S1 磷光发射 T1
S2
Phosphorescence
S0 l2 l1 l3
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为
S1→ S0跃迁），发射波长为 l ′2的荧光 10-8～10
> l > l ；
-10
s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；l ′2
l2
l 2
l3
2.电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1： 当S＝0时，即M=2S＋1＝1，称为单重态 当S＝1时，即M=2S＋1＝3，称为叁重态 大多数基态分子处于单重态，表示为S0（基态单重态）
S0→T1 为 禁 阻 跃 迁
；必须通过其他途 径(系间窜越)进入 ，进入的几率小； 根据洪特规则，平行自旋比成对自旋稳定；而三 重态能级比相应单重态能级低，所以平均寿命长。
第五章分子发光分析法

第五章分子发光分析法

二 分子发光分析法：
以分子发光现象建立起来的分析方法称为分子发光分析 法。
三 分子发光的类型:
光致发光: 物质因吸收光能而激发发光的现象。 电致发光：吸收电能后的发光现象。 化学发光：吸收化学反应能激发发光。 生物发光：发生在生物体内有酶类物质参与的化学发光
2019/10/10
第七章
分子发光分析法 一 分子荧光和磷光的产
200
2019/10/10
250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
（2） 荧光强度与浓度的关系： 当荧光物质浓度很小时，荧光强度If与荧光物质浓度c之间 的关系式为
If=Kc
即荧光强度与荧光物质的浓度c成正比。该式为荧光定量 分析的基本依据。 荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀的溶液。对 于较浓溶液，会产生浓度猝灭现象。
荧光猝灭：指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间的 相互作用引起荧光强度下降的物理或化学作用过程。
2019/10/10
第七章 分子发光分析法
一 基本装置及主要构件 二 荧光分光光度计
第三节 荧光分析仪器
2019/10/10
一 基本装置及主要构件：
荧光分析仪器（荧光计和荧光分光光度计）由光源、 单色器、样品池、狭缝和光电倍增管等构件组成。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 1 光源： 高压汞灯 ：常使用365nm、 405nm 和 4 3 6 nm 三 条 谱 线 ， 平均寿命是1500-3000h 氙弧灯：波长范围是250800nm，寿命大约为2000h
分子发光分析法 一 工作曲线法
二 比较法
第四节
三 多组分混合物的荧光
分子荧光定量 分析
分析方法
第五章分子发光分析法(化学师范、应化)

第五章分子发光分析法(化学师范、应化)


34
35
I F F Ia I a I 0 I 0 10klc I 0 (1 e 2.303klc )
x2 xn ex 1 x 2! n! e 2.303klc ( 2.303klc) 2 ( 2.303klc) 3 1 2.303klc 2! 3!
H C C H
1-二甲胺基-8-磺酸盐 ΦF=0.03
C H
C H
27
取代基效应 芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合 物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。 给电子基团，如−OH、−OR、−CN、−NH2 、 −NR2等，使 荧光增强。因为产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度， 使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。 吸电子基团，如−COOH、−NO、−C=O、卤素等，会减弱 甚至会猝灭荧光。 卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。如氟苯、氯苯、 溴苯、碘苯的荧光效率分别为0.16、0.05、0.01，碘苯则无荧 光。
23
能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少(仅少数高度共轭 体系化合物除外)。
24
共轭效应使荧光增强的原因 ： 主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生 更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生。 刚性平面结构 实验发现，多数具有刚性平面结构的有机 分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动， 使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了 碰撞去活的可能性。
19
20
荧光物质的最大激发波长( ex，excitation)和最大荧光波长 (em，emission)是鉴定物质的根据，也是定量测定时最灵敏的 条件。
21
(三)荧光效率及其影响因素 1、荧光效率
分子产生荧光必须具备两个条件： ① 分子必须具有能吸收一定频率紫外光的特定结构； ② 吸收了特征频率的辐射能之后，必须具有较高的荧光效率 (ΦF)。
第05章分子发光分析

第05章分子发光分析

一、概述 分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行
定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
荧光分析的特点： 灵敏度高：视不同物质，检测下限在
0.10.001g/mL之间。可见比UV-Vis的灵敏度高得多。 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光 强、荧光量子效率、荧光寿命等。 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍 性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率 影响大、干扰测量的因素较多。
10-9s内完成。
4)系间窜跃 指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是
一种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的 较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。有时，通 过热激发，有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。 这是产生延迟荧光的机理。
5)外转换(External Conversion，EC) 受激分子与溶剂或其它溶质分子相互作用发生能
荧光分析 法 磷光 分 析
化 学 发光分 析 法
分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、 化学和光能等)被激发至激发态，然后从不稳定的激 发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。 发光分析 包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。 物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。
第一节 荧光分析法
吸电子基团，如-COOH、-NO、-C O、卤素 等，会减弱甚至会猝灭荧光。
（5）重原子效应 卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。
这可能是由所谓“重原子效应”使系间窜跃速率增 加所致。在重原子中，能级之间的交叉现象比较严 重，因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加了由 单重态转化为三重态的概率。 取代基的空间障碍 对荧光也有影响。 立体异构现象对荧光强度有显 著的影响。
分析化学-分子发光分析法

分析化学-分子发光分析法


3. 流式细胞术（FCM） 对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测
标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量 分析和分选的技术。
§4 化学发光分析法
Chemiluminescence Analysis
基本原理 化学发光反应类型 化学发光测量仪器 化学发光分析法的应用
一、基本原理
化学发光是由于化学反应而导致的光发射。 发生于生命体系的化学发光称为生物发光。 生物发光均有酶（荧光素酶）参加。
最大化学发光强度与发光物质浓度成正 比： Icl max = Kc
化学发光的积分值与发光物质浓度成正 比： Icl = Kc
二、化学发光反应的类型
直接化学发光
A 十 B C＊ ， C＊ C 十 hν
间接（敏化）化学发光 A 十 B C＊ + D ， C＊+ F C 十 F＊
F＊ F 十 hν
三、New technique of fluorescence analysis
1. 激光荧光分析 F 与 I0 成正比，激光的强度大，可提高
荧光法的灵敏度。
2.时间分辨荧光分析
由于不同分子的荧光寿命不同，在激发 和检测之间延缓一段时间，使不同荧光寿命 的物质达到分别检测的目的。
时间分辨荧光免疫法 将稀土元素的螯合物标记抗体，与体液中 的抗原结合。当加入一种增效剂时，稀土 元素被释放出来，形成新的螯合物，能产生 长寿命的 荧光（10 ~1000 μs)。待样品中 蛋白质等物质所发荧光完全衰减后进行测定， 可有效消除背景干扰。 已用于测定甲胎蛋白、促性腺绒毛激素、 皮质醇等体内微量物质的测定。
2.化学发光免疫分析仪
化学发光免疫分析是将化学发光分析和 免疫分析相结合而建立的一种超微量分析 技术。兼具发光分析的高灵敏性和抗原抗 体反应的高特异性的特点。

第五章分子发光分析分解


S0 通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态
的最低振动能级。
l3
l1
l 2 l ?2
(二)荧光效率及其影响因素
1、荧光效率：又称荧光量子产率， 就是指激发
态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光 的光子数之比，常用 ? f表示， ? f为0~1，即
发射的光量子数
发荧光的分子数
? f ? 吸收的光量子数 ? 激发态分子总数
单重态与三重态的区别
? 电子的自旋方向不同
? 三重态的能量稍低于单重 态
2.荧光的产生
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和非辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
非辐射跃迁
荧光
磷光
系间窜越 内转移 外转移 振动弛豫
激发态 →基态：多种途径和方式 (见下页能级图 )；速度 最 快、激发态寿命最短的途径占优势；
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间窜越
S1
能 量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
T1 T2
发
射
磷 光
振动弛豫
S0
l3
l1
l 2 l ?2
磷荧外光光转发发换射射：：：电激电子发子由由分第第子一一与激激溶发发剂三单重或重态其态的他的最最分低低子振振之动动间能能产级级→生→基基态
态（相（T互1多→作为S用0S跃而1→迁转S）内0移跃转；换能迁）量，的发非射辐波射振长动跃为弛豫迁l ；‘2的荧内光转换； 10-7～ 1荧S发S02 光0-光9→的s速电激。外发度子发由转射很由→图波换慢SS振可长01使：进动见比荧入1弛，吸0T光-豫发41收～的→或射波1可0内荧磷长s能转光光。要过移的长减光程→能；弱照：系量停l（或间比‘止“S跨分2系0后>猝越→子间l，窜→吸灭2T可跃>1振收禁”l持动的阻1。续；弛能跃一豫量迁段→小）时，T间1

第5章仪器分析ppt分子发光分析法

一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
从分子结构理论，讨论荧光及磷光的产生机理。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频 率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、 激发态寿命最短的途径占优势；
导致荧光猝灭的主要类型： ① 碰撞猝灭（主要类型之一）
碰撞猝灭是指处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子 相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式回到 基态，产生猝灭作用。
2024/8/7
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生
成非荧光的配合物而产生的。此过程往往还 会引起溶液吸收光谱的改变。 ③ 转入三重态的猝灭
3.药物分析和临床分析
见表
2024/8/7
2024/8/7
2024/8/7
分子发光分析法教学要求
• 掌握分子荧光、磷光的产生机理； • 掌握激发光谱和发射光谱特征。 • 掌握荧光与分子结构的关系以及溶液荧光（磷
光）强度的影响因素。 • 了解荧光（磷光）分析法的特点。 • 了解荧光（磷光）分析仪器的结构。
2024/8/7
五、荧光光谱仪
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器；检测器与激发光方向成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：氙灯和高压汞灯， 染料激光器(可见紫外区) 检测器：光电倍增管等。

第5章-分子发光分析法(新


样品室
样品池
光检测器
放大器
信号 处理系统
稳压电源
5.3 3.4 化学发光分析技术的应用 2．气相化学发光体系
3．固相化学发光体系
液相化学发光体系分为两类：
(1)经典化学发光体系，如鲁米诺、光泽精、过氧化草酸 酯、洛粉碱萤火虫荧光素等化学发光体系；
(2)无机氧化剂直接氧化一些物质产生化学发光的新体系， 如高锰酸钾、铈(IV)、过氧化氢、高碘酸钾、次氯酸 盐和铁氰化钾等。
5.2 荧光分析 5.2.1 基本原理
1. 分子荧光光谱的产生 2. 荧光的产生 3. 激发光谱与发射光谱 4. 分子结构与荧光的关系
③ 外部条件对荧光强度的影响
320 448
强 度
激发320nm 硫酸奎宁
350
448
激发350nm 硫酸奎宁
(a)
λ/nm
强
320 激发320nm
度
0.1mol/LH2SO4
蒽的激发光谱和荧光光谱
5.2 荧光分析 5.2.1 基本原理
1. 分子荧光光谱的产生 2. 荧光的产生 3. 激发光谱与发射光谱 4. 分子结构与荧光的关系
溶液荧光的特征： ① 斯托克斯位移 ② 荧光发射光谱的形状与激发光波长无关 ③ 荧光光谱的形状与激发光光谱呈镜像关系
/nm
蒽乙醇溶液激发光谱和不同激发波长下的荧光发射光谱
5.2 荧光分析 5.2.1 基本原理
1. 分子荧光光谱的产生 2. 荧光的产生 3. 激发光谱与发射光谱 4. 分子结构与荧光的关系
分子能级与电子的多重性：基态、单重态、多重态
图5-1 单重态和三重态的电子分布 A基态；B激发单重态；C激发三重态
5.2 荧光分析 5.2.1 基本原理

第五章分子发光分析法.


（4）表面活性剂：有利于荧光发射。 （5）O2的存在：O2为顺磁性分子，溶液中溶解氧的 存在，常常导致荧光降低，甚至熄灭，这可能是处于
单重激发态的荧光物质的分子相互作用，加速系间窜
跃（几率增大）所致。
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三、荧光强度与溶液浓度的关系
以If表示荧光强度，以Ia表示吸收光的强度，根据荧光
(CH CH)3
Ff: 0.68
共轭体系增加，荧光效率增大！
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（ 3）荧光物质的刚性和共平面性增加，可使分子与溶 剂或其它溶质分子的相互作用减小（即外转移能量损失 减小），有利于荧光发射。
例如：
Fluorene（芴） Ff: 1.0
Ff: 0.20
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l2
l1
l3
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l2 l3> l1 > l2
Only l3 l1 l3
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S2
Intersystem Crossing 系间窜跃
S1 T1
磷光发射 Phosphorescence S0
l2
l1
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级数展开
If ＝ Ff× I0 （2.3A－(-2.3A)2/2! － (-2.3A)3/3! －…） 若溶液的浓度很稀，A<0.05，则高次项可忽略： If ＝ Ff× I0 ×2.3A ＝2.3 Ff I0A＝ 2.3 Ff I0 ebc
当I0一定时：
If ＝ KC
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（2） 荧光光谱和激发光谱成镜像关系 从图可看出激发光谱同荧光光 谱大致成镜像对称 a. 荧光光谱(发射光谱）形状
与基态S0振动能级的分布情况
（即能量间隔情况）有关 b. 激发光谱(吸收谱)形状与 激发态S1振动能级的分布有关
c. S0 、 、 S1 态中振动能级的分布是相似的 ( 说明峰形状相
Photoluminescent
荧光Fluorescence 磷光Phosphorescence
热致发光 场致发光 化学发光 Chemiluminescence
§5-1 荧光分析法
分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定 性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。 一、基本原理： （一）、分子荧光（磷光）的产生： 室温下，大多数分子处在基态的最低振动能层。 处于基态的分子吸收能量（电能、热能、化学能或光 能）后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快衰变 到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现 象称为“发光”。
4）、荧光发射（Fluorescence） 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活 化过程的一种形式是以10-9~10-6s左右的短时间发射一 个光子返回基态。这一过程称为荧光发射。 （单重— 单重，停10-9——10-6s ） 发射荧光的能量比分子所吸收的能量要小，即荧 光的特征波长比它所吸收的特征波长要长。 注意：基态中也有振动驰豫跃迁。λ3＞λ1或λ2 ，不 论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波 长为λ3的荧光。
P——磷光（三重—单重，停10-4-10s） F——荧光（单重—单重，停10-9- 10-6s ）
去活化过程： ⑴、振动驰豫（VR） 在同一能级中，分子由较高振动能级向该电子态的 最低振动能级的非辐射跃迁。其速率极大，10-14~10-12s 内即可完成。 ⑵、内转换（ic） 指相同多重态的两个电子态之间（S2 S1，S1 S0） 的非辐射跃迁。当两个电子能级非常靠近以至其振动能 级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转 移至低能级。如图中S2的较低振动层与S1的较高振动层 相重叠，分子无论在哪一个激发单重态，都能通过振动 驰豫和内转化跃回到第一激发单重态的最低振动能级。
似）
d. 根据Frankcondon原理，电子跃迁过程中核的相对位置 不变（近似的），若吸收光谱中某一振动带的跃迁几 率最大，则在荧光发射光谱中，其相反跃迁的几率也 应最大(说明高峰对高峰，低峰对低峰） 非镜像对称的峰出现，则表示有散射光或杂质存 在。
2、激发光谱和荧光光谱的特点： （1）荧光光谱的形状与激发光波长无关 荧光物质吸收不同波长的激 发光可被激发到不同能态，通过 振动驰豫和内部转换最终都将达 到第一激发单重态的最低振动能 级，然后再发射荧光。故蒽的激 发光谱虽在250nm和350nm有两 个峰，不论用哪一个峰的波长作 激发光源，所得荧光光谱的形状 和峰的位置都是相同的。
相 对 强 度
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
萘的激发光谱Ⅰ
荧光光谱Ⅱ 磷光光谱Ⅲ
200
300
400
500
λ
荧光或磷光光谱曲线: 固定激发光波长为其最 大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或 磷光强度，将荧光的光波长为横座标，荧光强度为纵 座标作图便可得到荧光光谱（发射光谱）。
E磷 E荧 E激
磷 荧 激
（5）、磷光发射（Phosphorescence）
从单重态到三重态的分子体系间窜跃发生后，接着发生 快速的振动驰豫而到达三重态的最低能层上，此时可能由 两种途径返回基态： ①体系间窜跃 ②在10-4~10s左右时间内辐射跃迁回基态而发生磷光.这种 跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间。 （三重—单重，停10-4-10s，液氮冷冻试样，才可见磷光） 荧光和磷光的根本区别:
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仪器分析
Instrumental Analysis
第五章 分子发光分析法
（Molecular luminescence analysis) §5-1 概述 §5-2 荧光分析法
§5-3 磷光分析法
§5-4 化学发光分析法
基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态。当 激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时， 便产生分子发光。 光致发光
单重态，激发单重态，三重态：
去活化过程：处于激发态的分子是不稳定的，它可 能通过辐射跃迁和非辐射跃迁等去活化过程返回基态。 由较高能态到较低能态的过程( E* E0 ) 其中，以速度最快、激发态寿命最短的途径占优势。
去活化过程
发射光子
非辐射跃迁
化学反应Βιβλιοθήκη 荧光磷光振动驰豫 VR
内转换 ic
外转换
体系间窜跃 isc
碰撞去活化和振动偶合去活化降至最低限度
S2
2 1 V=0
VR
ic
S1
2 1 V=0
isc F
2 T1 1 V=0
P
VR
ic
S0
3 2 1 V=0
isc
λ1
λ2
λ3
F P
（二）荧光的激发光谱和发射光谱 1、激发光谱：荧光和磷光都是光致发光，因此必须选择 合适的激发光波长，这可从他们的激发光谱曲线来确定 以荧光（磷光）的最大发射波长为测量波长，改变 激发光的波长，测量荧光强度的变化，以激发光波长为 横座标，荧光强度为纵座标作图，即可得到激发光谱。
荧光是由单重-单重跃迁引起的，
磷光则由三重-单重跃迁产生的。
观察磷光现象时，试样要用液氮冷冻
a.三重态与基态之间的能量差要比最低激发态和 基态之间的能量差小，这使三重态与基态之间的振动 偶合增强，因而增强了内部转换； b.激发三重态的寿命比激发单重态的寿命长，因 而同溶剂分子碰撞而失去激发能的可能性增大，以致 在室温条件下不能观察到溶液的磷光。 因此，观察磷光现象时，试样要用液氮冷冻以使
S2
2 1 V=0
VR
ic
S1
2 1 V=0
isc F
2 T1 1 V=0
P
VR
ic
S0
3 2 1 V=0
isc
λ1
λ2
λ3
F P
（3）、体系间窜跃（isc） 指不同多重态的两个电子之间的非辐射跃迁。 它涉及受激发电子自旋状态的改变，如S1 T1，使原 来两个自旋配对的电子不再配对，这种跃迁是禁阻跃 迁。 含有重原子（碘、溴等）的分子中，体系间跨越 跃迁最为常见。 在溶液中存在如氧分子等顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生，因而使荧光减弱。