哺乳动物雷帕霉素靶蛋白：神经系统治疗的新靶点 美国神经科学细胞及分子信号研究实验室Kenneth Maiese博士，在《中国神经再生研究》（英文版）杂志2015年10卷第4期探讨了如何通过生长因子、Wnt信号及WISP1和干细胞组织防止糖尿病神经系统并发症的问题。营养因子，如胰岛素样生长因子-1、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和促红细胞生成素，可以通过控制氧化应激和糖尿病中葡萄糖稳态防止神经元死亡。有趣的是最近的研究也表明，细胞因子和生长因子促红细胞生成素通过Wnt信号保护间充质干细胞防止血管损伤死亡有关的途径，促进神经系统免疫细胞起到保护作用。通过独立的途径，Wnt信号和WISP1通过促进干细胞的生长和迁移，增加胰细胞增殖，从而导致新的血管生长，修复糖尿病伤口，并控制关键的程序性细胞死亡途径促进糖尿病期间保护神经系统中的细胞凋亡和自噬。在下游区，Wnt信号和WISP1通过雷帕霉素和AMP途径维持葡萄糖稳态和正常代谢活化的蛋白激酶。 Maiese博士还强调了通过注意“这些生物系统的活化程度是通过设计是营养因子、Wnt 信号、WISP1治疗糖尿病保护神经系统时所必须考虑的。例如，Wnt信号、WISP1和生长因子可导致如血管渗漏的视网膜和视力损害甚至癌症。总之，神经系统生长因子、Wnt信号和WISP1具有治疗糖尿病的并发症的广阔前景，然而，如何精确应用这些途径的靶点成功的保护 修复神经系统及神经元的功能仍值得探讨。 Article: "Novel applications of trophic factors, Wnt and WISP for neuronal repair and regeneration in metabolic disease" by Kenneth Maiese (Cellular and Molecular Signaling, Newark, New Jersey 07101, USA) Maiese K (2015) Novel applications of trophic factors, Wnt and WISP for neuronal repair and regeneration in metabolic disease. Neural Regen Res 10(4):518-528. 欲获更多资讯：文章全文请见：Neural Regen Res New Prospects for Targeting Diabetes Mellitus with Trophic Factors, Wnt, and WISP SUMMARY Diabetes mellitus (DM) affects almost 350 million individuals throughout the world and leads to significant disability in the nervous system involving dementia, stroke, neuropathy, and retinal disease. To combat these detrimental effects of DM, new avenues of discovery are being pursued that target novel growth factors and specific cellular pathways of Wnt signaling, Wnt1 inducible signaling pathway protein 1 (WISP1), and stem cells to block neuronal death and potentially lead to reparative processes in the nervous system. NEWS RELEASE Dr. Kenneth Maiese, an expert in cellular signaling and a physician scientist, explores in the journal Neural Regeneration Research(Vol. 10, No. 4, 2015) how novel targeting with growth factors, Wnt, WISP1, and stem cell tissue regeneration may offer new strategies to prevent the complications of DM in the nervous system. Trophic factors that include insulin-like growth factor-1 (IGF-1), fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF), and
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用 杨彩荣 魏延昌张 岩郑可佳 李 宁严云勤* (东北农业大学动物细胞与发育生物学教研室，哈尔滨150030) 摘要哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin ，mTOR)是一种Ser/Thr 激酶，属于PIKK 超家族，对调节细 胞周期、蛋白质合成等具有重要作用，是细胞生长、增殖、分化、凋亡的中心调控器，但在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道．以小鼠卵母细胞为研究对象，采用免疫荧光为主要研究方法，对mTOR 在小鼠卵母细胞中的表达进行研究，并通过mTOR 的特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin ，RAPA )对卵母细胞进行处理，对mTOR 在卵母细胞成熟过程中的作用进行研究．结果显示：小鼠卵母细胞成熟过程中，生发泡(germinal vesicle ，GV )期mTOR 主要集中在核膜处表达，生发泡破裂(germinal vesicle breakdown ，GVBD )后mTOR 伴随染色体分布，第二次减数分裂中期(second metaphase ，M Ⅱ期)mTOR 伴随纺锤体分布；雷帕霉素处理后，小鼠卵母细胞的成熟受到抑制，且这种抑制作用具有浓度依赖性，同时其mTOR 的表达部位和形态也发生变化．研究表明，在小鼠卵母细胞成熟过程中，mTOR 在各个时期的表达及分布具有阶段特异性，并对小鼠卵母细胞GVBD 的发生和第一极体的排放都具有重要作用． 关键词雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，小鼠卵母细胞，雷帕霉素，免疫荧光学科分类号 Q2 DOI:10.3724/SP.J.1206.2009.00446 生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biophysics 2009,36(10):1334~1339 https://www.doczj.com/doc/e014957315.html, 研究报告 Research Papers *通讯联系人. Tel:0451-********,E-mail:yanyunqin@https://www.doczj.com/doc/e014957315.html, 收稿日期：2009-07-23，接受日期：2009-09-04 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)结构与功能上高度保守，是一种存在于哺乳动物细胞中的Ser/Thr 激酶，属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinase ，PIKK)家族成员．mTOR 信号通路可以汇聚和整合来自于营养、生长因子、能量和环境胁迫对细胞的刺激信号[1～3]，通过其下游的靶蛋白核糖体蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6kinase 1，S6K1)和蛋白质翻译起始因子eIF4E 结合蛋白1(eIF4E binding protein 1,4EBP1)调控蛋白质的翻译，加快细胞G1期/S 期的转换，促进细胞生长和增殖，抑制细胞凋亡[4～6]．mTOR 信号通路紊乱与肿瘤的形成及细胞的恶性转化密切相关[7]． 雷帕霉素(rapamycin ，RAPA ，RPM)是一种大环内酯类抗生素和免疫抑制剂，它进入体内后与胞浆受体FKBP12结合形成复合物，此复合物能够结合在mTOR 蛋白羧基端的FRB 结构域内，形成三元复合物，使得mTOR 的激酶催化域失去接近并磷酸化下游靶蛋白的能力，从而抑制mTOR 的生物学功能[8～10]． mTOR 在卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的研究较少，且大多集中在海星、海胆等动物中[11,12]， 而在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道．以往的研究表明，mTOR 与一些蛋白质的合成有关[12]，而特定蛋白质的合成对卵母细胞成熟具有重要的作用，因此我们推测，mTOR 可能在哺乳动物卵母细胞成熟过程中有重要作用．所以本研究以小鼠卵母细胞为研究对象，观察了mTOR 在卵母细胞成熟各个阶段的表达及分布情况，同时通过雷帕霉素的处理观察mTOR 对卵母细胞成熟的重要作用，为进一步探索mTOR 在小鼠卵母细胞成熟过程中的分子机制提供实验依据． 1材料与方法 1．1 实验材料 本实验选用昆明白品系6～8周龄性成熟雌鼠，购自哈尔滨肿瘤医院实验动物中心． 1．2 主要试剂 α-MEM 购自Gibco 公司；雷帕霉素购自江苏碧云天生物技术研究所；孕马血清(pregnant mare
中科院研究发现细胞“返老还童”关键机制 2015年05月21日08:16来源：《中国科学报》 原标题：研究发现细胞“返老还童”关键机制 （记者朱汉斌、丁佳通讯员黄博纯）记者从中科院广州生物医药与健康研究院获悉，该院裴端卿和秦宝明实验组发现了细胞在结构上“返老还童”的关键机制，有望为寻找新的治疗手段提供有力依据。5月18日，相关成果在线发表于《自然·细胞生物学》杂志。 据裴端卿介绍，细胞在饥饿等胁迫条件下会主动降解自身细胞质组分，这一过程被称为“自噬”。此前有研究认为，自噬在重编程早期发挥关键作用。但最新研究发现，自噬对重编程非但不是必须，反而起阻碍作用。重编程在自噬缺失的细胞中不仅效率更高，而且获得的诱导多能干细胞（iPS细胞）具有正常的多能性。 据了解，2006年，日本科学家建立的iPS细胞技术，实现了成体细胞逆转为具有多种分化潜能的类似胚胎干细胞状态的iPS细胞，从而叩开了再生医学的大门。不过，该技术在获得大规模应用前仍存在很多问题。 什么是细胞重塑？科研人员介绍说，成体细胞犹如一个具有特定功用的房间，房间里的器具构造决定了它是居家、办公还是商铺；而胚胎干细胞更像是一个空房间，根据需要可把它改造做任何用途。成体细胞重编程为胚胎干细胞的过程，如同把原有房间里的器具构造清空，只留下一些水电等最基本的设施。这就是细胞在结构上“返老还童”的关键过程。 最新发现将拓展对糖尿病、癌症以及神经退行性疾病等代谢疾病中细胞重塑如何影响细胞命运的认识，从而为寻找新的治疗手段提供有力依据。研究人员进一步发现，细胞重塑的发生实际上来自雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）的关闭，其持续开启则阻断细胞重塑、线粒体代谢转变以及重编程的发生。
中国肾移植受者哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂临床应用专家共识 （最全版） 一、前言 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂(mammalian target of rapamycin inhibitors，mTORi)作为免疫抑制剂在临床应用已经有10多年的历史，目前用于移植后免疫抑制治疗的mTORi主要包括西罗莫司(sirolimus，SRL)和依维莫司(everolimus，EVL)，其他mTORi，如坦西莫司等仅用于抗肿瘤治疗。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是参与细胞内多个信号通路的重要物质，影响细胞生长、增殖、代谢、自噬、血管生成等诸多重要过程。mTORi进入细胞后，在胞浆内与FK结合蛋白12(FK binding protein-12，FKBP-12)结合形成复合物，进而与mTOR结合，抑制mTOR活性，使p70S6激酶脱磷酸化而失活，从而抑制蛋白质的合成及细胞周期循环。因此，mTORi可抑制T淋巴细胞、B 淋巴细胞的增殖、分化及抗体的形成，同时也可抑制非免疫细胞(成纤维细胞、内皮细胞、肝细胞和平滑肌细胞)的增殖[1]。 mTORi可以作为肾移植受者的初始治疗药物，也可以作为其他治疗方案的转换药物。按照转换时间可将转换治疗分为早期转换(术后2～6个月)和晚期转换(术后6个月以后)；按照转换原因分为主动转换(pre-emptive/proactive)和被动转换(reactive)，主动转换用于避免可预期的钙调磷酸酶抑制剂(calcineur ininhibitors，CNI)的不良反应或用于肿
瘤、病毒感染等高危人群，被动转换是指在CNI的不良反应出现后进行转换。 二、mTORi作为初始治疗药物 初始给药时，可以采用CNI(慢撤除或低剂量长期合用)＋SRL＋糖皮质激素(glucocorticoid，GC)方案，其中慢撤除指CNI在4～6周内逐渐停药。研究证明，当SRL浓度达到8～12 μg/L，撤除或联合应用低剂量CNI 将减轻CNI肾毒性，并改善移植受者的肾功能，同时不增加排斥反应风险，有助于提高移植肾长期存活率。 建议1：免疫低、中危受者和高危受者采用mTORi作为初始治疗药物时，应联合CNI类药物。 建议2：慎用于切口不易愈合的受者，包括体重指数(body mass index，BMI)>30 kg/m2、2型糖尿病、既往有广泛盆腔手术史或放疗史、既往由于前次移植或自身免疫性疾病服用GC的肾移植受者。 建议3：避免用于因局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomurular sclerosis，FSGS)、膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MPGN)等易于复发的肾脏疾病而行肾移植治疗的受者[2]。 建议4：初始治疗采用CNI(慢撤除或低剂量长期合用)＋SRL＋GC方案具有较好的临床疗效，且相对安全。 早期研究证明，相对于环孢素A(CsA)＋霉酚酸类(mycophenolic acid，MPA)＋GC方案，SRL＋MPA[或硫唑嘌呤(azathioprine，Aza)]＋GC(CNI-free)方案能显著提高肾移植受者的肾小球滤过率(glomerular
mTOR抑制剂的筛选方法 【摘要】雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是是丝氨酸/苏氨酸激酶分子靶位。mTOR是细胞生长增生的中心调控者，直接或间接参与细胞生长增生有关环节的调控。人体多种肿瘤细胞中可见mTOR通路的失调。近年来，有关mTOR抑制剂的专利申请不断增加，设计、合成、筛选结构新颖的mTOR抑制剂已经成为抗肿瘤药物研发的重大课题。本文就mTOR的结构功能、信号转导通路及mTOR抑制剂的筛选方法进行简单的介绍。 【关键词】雷帕霉素靶蛋白雷帕霉素靶蛋白抑制剂药物筛选 TOR(target of rapamycin，雷帕霉素靶蛋白)是一类进化上非常保守的蛋白激酶家族，广泛存在于各种生物细胞中。 1994年，Brown等证实并克隆了哺乳动物TOR基因，其产物只有一种蛋白，即mTOR(mammalian target of rapamycin，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)。mTOR属P13K蛋白激酶类家族，是P13K／PKB信号通路下游的一个效应蛋白，其底物主要控制与细胞生长和增殖密切相关的蛋白质的合成。mTOR控制细胞内mRNA的翻译，参与膜蛋白转运，蛋白质降解，蛋白激酶C信号转导和核糖体合成等一系列生理病理过程。 1.mTOR的分子结构 mTOR分子结构复杂，由2 549个氨基酸残基组成，分子中有数个各自独立而保守的结构域，类似于酵母中TOR的结构。mToR分子的氨基端存在20个串联重复序列，每一个重复序列包含2个分别由40个氨基酸残基组成的α螺旋，每个螺旋都有一个亲水基团和一个疏水基团。这种重复结构介导蛋白质之间的相互作用，并有利于mTOR定位于浆膜。 mTOR分子羧基端的中部是蛋白激酶域，结构和P13K激酶的催
1 mtor概述 mtor（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)是蛋白激酶家族中新的一员，这类蛋白激酶又属于磷酯酰肌醇激酶相关激酶(pikk)［1-3］。mtor是在研究免疫抑制剂雷帕霉素的过程中发现的，科学家在研究中发现结构相似的免疫抑制剂fk506和雷帕霉素能够与相同的靶蛋白fkbp12 (fk506结合蛋白)结合发挥其免疫抑制作用，但是它却与fk506的免疫抑制机制不同，雷帕霉素与fkbp12结合形成的复合物不能与钙调素结合，并且雷帕霉素也不能抑制t细胞的早期激活或直接减少细胞因子的合成，它是通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断t淋巴细胞及其它细胞由g1期至s期的进程，而fk506则是抑制t淋巴细胞由g0期至g1期的增殖［4］。 由于mtor在细胞增殖、分化、转移和存活中的重要地位，mtor已经成为癌症治疗中的一个新靶点。mtor抑制剂的抗癌机制都是通过首先与fkbp-12蛋白生成复合物，此复合物再与mtor的frb区域结合由此抑制mtor的功能，从而抑制了下游的相关因子的功能，将肿瘤细胞阻滞于g1期(前dna合成期)从而使肿瘤细胞的生长受抑制并最终阻滞细胞的增殖甚至使细胞凋亡。 2 mtor抑制剂 2.1 雷帕霉素及其衍生物雷帕霉素(rapamycin,sirolimus,rapa,1)属大环内酯类抗生素，与fk506结构相似。早在1975年，从们已从吸水链霉菌(steoptomyces hyproscopicus)的代谢产物中分离出雷帕霉素，但由于其过低的抗菌活性而遭冷遇，直至1977年由于其结构与免疫抑制剂fk506相似而被发现同样具有免疫抑制活性，但令人惊奇的是雷帕霉素与fk506却有着非常不同的免疫抑制机制，这也加深了人们对t细胞活化的理解。1989年雷帕霉素作为抗移植的排斥反应的新药进入临床，现已上市。在上世纪90年代中期，由于雷帕霉素对t 淋巴细胞增殖的抑制又引导人们将其用于抗肿瘤细胞治疗，并发现其同样具有较好的抗肿瘤活性，此药作为抗癌药已由美国惠氏公司开发即将进入临床［5］。 雷帕霉素的抗肿瘤活性虽强，但它有两个严重的缺点：稳定性差及溶解性差。雷帕霉素对酸或碱都不稳定，即使在生理ph条件下雷帕霉素也会发生β-消除形成α,β-不饱和酮和发生内酯环的水解形成β-羟基酮而活性下降。所以曾有研究者尝试将内酯环附近引入较大位阻的基团以及将32位的羰基还原以阻止雷帕霉素的降解。其修饰的结果表明在1位引入烷基可以延长雷帕霉素衍生物的半衰期，并且烷基的体积增大使得雷帕霉素衍生物的稳定性增加但其fkbp结合活性也随之剧降从而使得mtor抑制活性降低；而将32位的羰基还原成羟基对稳定性和抑制活性的影响都较小［6-7］。 雷帕霉素溶解性差的问题则导致了很难得到其盖仑制剂或口服剂型，一直以来雷帕霉素的使用都是通过非肠道给药系统。为了解决口服给药生物利用度过低的问题，研究者试图在雷帕霉素的结构上引人亲水性的基团。将16位的甲氧基的甲基脱去或者将甲氧基替换成炔氧基可以增加雷帕霉素衍生物的稳定性和生物利用度。而在40位的羟基上的修饰显然对改善雷帕霉素的理化性质更为有利。 everolimus［certican,rad001,sdz rad,43-o-(2-hydroxethyl)-rapamycin］everolimus（其结构如图1所示）是novartis公司研发的水溶性比雷帕霉素好的半合成衍生物，可以口服给药。体外免疫抑制活性比雷帕霉素低3倍，但在体内与雷帕霉素相当。作为免疫抑制剂与环孢素有协同作用，目前处于肾移植的ⅲ期临床试验中；evero-limus有抑制血管内皮细胞增殖的作用，已批准作为药物支架的涂层药物；everolimus也是mtor抑制剂，
1.mtor概述 mtor（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)是蛋白激酶家族中新的一员，这类蛋白激酶又属于磷酯酰肌醇激酶相关激酶(pikk)［1-3］。mtor是在研究免疫抑制剂雷帕霉素的过程中发现的，科学家在研究中发现结构相似的免疫抑制剂fk506和雷帕霉素能够与相同的靶蛋白fkbp12 (fk506结合蛋白)结合发挥其免疫抑制作用，但是它却与fk506的免疫抑制机制不同，雷帕霉素与fkbp12结合形成的复合物不能与钙调素结合，并且雷帕霉素也不能抑制t细胞的早期激活或直接减少细胞因子的合成，它是通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断t淋巴细胞及其它细胞由g1期至s期的进程，而fk506则是抑制t淋巴细胞由g0期至g1期的增殖［4］。 由于mtor在细胞增殖、分化、转移和存活中的重要地位，mtor已经成为癌症治疗中的一个新靶点。mtor抑制剂的抗癌机制都是通过首先与fkbp-12蛋白生成复合物，此复合物再与mtor的frb区域结合由此抑制mtor的功能，从而抑制了下游的相关因子的功能，将肿瘤细胞阻滞于g1期(前dna合成期)从而使肿瘤细胞的生长受抑制并最终阻滞细胞的增殖甚至使细胞凋亡。 2 mtor抑制剂 2.1 雷帕霉素及其衍生物雷帕霉素(rapamycin,sirolimus,rapa,1)属大环内酯类抗生素，与fk506结构相似。早在1975年，从们已从吸水链霉菌(steoptomyces hyproscopicus)的代谢产物中分离出雷帕霉素，但由于其过低的抗菌活性而遭冷遇，直至1977年由于其结构与免疫抑制剂fk506相似而被发现同样具有免疫抑制活性，但令人惊奇的是雷帕霉素与fk506却有着非常不同的免疫抑制机制，这也加深了人们对t细胞活化的理解。1989年雷帕霉素作为抗移植的排斥反应的新药进入临床，现已上市。在上世纪90年代中期，由于雷帕霉素对t 淋巴细胞增殖的抑制又引导人们将其用于抗肿瘤细胞治疗，并发现其同样具有较好的抗肿瘤活性，此药作为抗癌药已由美国惠氏公司开发即将进入临床［5］。 雷帕霉素的抗肿瘤活性虽强，但它有两个严重的缺点：稳定性差及溶解性差。雷帕霉素对酸或碱都不稳定，即使在生理ph条件下雷帕霉素也会发生β-消除形成α,β-不饱和酮和发生内酯环的水解形成β-羟基酮而活性下降。所以曾有研究者尝试将内酯环附近引入较大位阻的基团以及将32位的羰基还原以阻止雷帕霉素的降解。其修饰的结果表明在1位引入烷基可以延长雷帕霉素衍生物的半衰期，并且烷基的体积增大使得雷帕霉素衍生物的稳定性增加但其fkbp结合活性也随之剧降从而使得mtor抑制活性降低；而将32位的羰基还原成羟基对稳定性和抑制活性的影响都较小［6-7］。 雷帕霉素溶解性差的问题则导致了很难得到其盖仑制剂或口服剂型，一直以来雷帕霉素的使用都是通过非肠道给药系统。为了解决口服给药生物利用度过低的问题，研究者试图在雷帕霉素的结构上引人亲水性的基团。将16位的甲氧基的甲基脱去或者将甲氧基替换成炔氧基可以增加雷帕霉素衍生物的稳定性和生物利用度。而在40位的羟基上的修饰显然对改善雷帕霉素的理化性质更为有利。 everolimus［certican,rad001,sdz rad,43-o-(2-hydroxethyl)-rapamycin］everolimus（其结构如图1所示）是novartis公司研发的水溶性比雷帕霉素好的半合成衍生物，可以口服给药。体外免疫抑制活性比雷帕霉素低3倍，但在体内与雷帕霉素相当。作为免疫抑制剂与环孢素有协同作用，目前处于肾移植的ⅲ期临床试验中；evero-limus有抑制血管内皮细胞增殖的作用，已批准作为药物支架的涂层药物；everolimus也是mtor抑制剂，是作用于mtor靶位的抗肿瘤药物，它能与细胞毒抗肿瘤药物联合使用，对非小细胞肺癌有实质性的效果，处在i期临床。对黑色素瘤、直肠癌、胰腺癌有作用，口服剂量2.5 mg/ （kg•d）［8］。