作者单位:200003上海,第二军医大学附属长征医院实验诊断科・继续教育园地・
AmpCβ内酰胺酶的检测赵虎 孔宪涛
AmpCβ内酰胺酶(简称AmpC酶)是由肠杆菌科细菌或/和绿脓假单胞菌的染色体或质粒介导产生的一类β内酰胺酶,属β内酰胺酶Ambler分子结构分类法中的C类和Bush2 Jacoby2Medeiros功能分类法中第一群,即作用于头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制的β内酰胺酶。故AmpC酶又称作为头孢菌素酶[1,2]。
AmpC酶按其产生的方式分为3类:诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶[2,3]。(1)诱导高产酶:AmpC酶的合成往往与β2内酰胺类抗生素的存在有关。绝大部分肠杆菌科细菌和绿脓假单胞菌在正常条件下(即无β内酰胺类抗生素存在的条件下)只产生少量的AmpC酶。而当有诱导作用的β内酰胺类抗生素存在的条件下,AmpC酶的产量明显增加,增加的范围在100～1000倍之间。(2)持续高产酶:另有一部分产AmpC酶的菌株不论在有无β内酰胺类抗生素存在的条件下均可持续高水平产生AmpC酶,其原因为去阻遏突变,即调控基因之一的ampD基因发生突变,产生的有缺陷的AmpD蛋白,不能与另一种调控蛋白—AmpR蛋白结合形成复合物,AmpR蛋白即以激活子状态发挥激活作用,引起AmpC酶的大量表达。质粒介导的AmpC酶往往都属于此类AmpC酶。产生这种AmpC酶的细菌对临床的危害最大,是临床微生物实验室检测的重点。(3)持续低产酶:还有极少部分产AmpC酶的菌株,不论在有无β内酰胺类抗生素的存在的条件下均持续低水平的产生AmpC酶,其原因可能是另一种调节基因—ampR基因发生突变,产生有缺陷的AmpR蛋白,不能在无β内酰胺类抗生素存在的条件下起到抑制子的作用,也不能在有β内酰胺类抗生素存在的条件下起到激活子的作用,故AmpC酶得以持续低水平地表达。检测不同类型的AmpC酶或检测产不同类型AmpC酶的菌株,其方法也有所不同。
近年来,随着β内酰胺类抗生素、尤其是头孢菌素的广泛应用,产AmpC酶的革兰阴性杆菌越来越多见,尤其是出现了(去阻遏)持续高产AmpC酶和质粒介导的AmpC酶,导致耐药菌株广泛传播和临床对该类细菌感染的治疗困难,已引起临床的高度重视,故检测AmpC酶具有非常重要的临床意义。
目前已陆续报道了多种检测AmpC酶的方法,除改良的三维试验较为经典外,其他的检测方法还不成熟,尚在摸索、试验阶段,检测的结果也各不相同。现讲述如下。
一、头孢西丁敏感试验[4]
AmpC酶可以水解头孢西丁(FOX),即产AmpC酶的菌株对头孢西丁耐药。而ESBLs等其他β内酰胺酶一般不能分解头孢西丁,即产ESBLs的菌株对头孢西丁敏感。利用AmpC酶的这一特性,可以对产AmpC酶的菌株进行初步筛选。
具体操作方法:(1)纸片扩散法:按美国临床实验室标准化委员会(NCCL S)的纸片扩散(K2B)法进行。FOX纸片的含量为30μg。判断标准为抑菌环<18mm,表示待检菌株对FOX耐药。(2)稀释法:手工的(微量)肉汤稀释方法参照NCCL S的方法进行;也可用MicroScan等微生物分析仪进行分析,操作方法按其操作规程进行。判断标准为MIC>16μg/ml,表示待检菌株对FOX耐药。对FOX耐药的菌株,应怀疑产AmpC酶可能。当然,不是所有对头孢西丁耐药的菌株都是产AmpC酶的菌株(目前产ESBLs菌株对头孢西丁的耐药率已超过30%)。故此方法仅仅作为初步筛选。需做三维试验或纸片协同试验等试验,进行进一步的确定。
二、AmpC酶表型筛选试验[5]
根据AmpC酶对大部分头孢菌素、尤其是三代头孢菌素耐药的特性,选用多种头孢菌素纸片对产AmpC酶的菌株进行表型筛选。可选用亚胺培南(IP)、头孢吡肟(FEP)、头孢他啶/克拉维酸(CTD/Cla)、头孢噻肟(CTX)和头孢噻肟/克拉维酸(CTX/Cla)5种抗生素纸片进行筛选试验。
具体操作方法按NCCL S的K2B法进行。
判断标准:(1)IP、FEP敏感,而CTX、CTD/Cla和CTX/ Cla耐药;(2)IP、FEP敏感,而在CTX、CTD/Cla和CTX/Cla 的抑菌环内存在散在的菌落;(3)IP敏感,而FEP、CTD/Cla 和CTX/Cla耐药。以上3种结果提示,待检菌株产AmpC 酶。最后一种表型提示,待检菌株产AmpC酶的同时,产生其他β内酰胺酶,如产ESBLs。
此方法操作简便、快速省时,较三维试验简单得多,结果基本可靠,与三维试验的符合率达89158%。可以在各临床微生物实验室推广应用。
三、氟氯西林(FCC)双抑制剂扩散协同试验[6,7]
氟氯西林(FCC)可抑制AmpC酶的活性,使产AmpC酶的菌株不能及时水解和破坏头孢菌素,保留了这些抗生素的抗菌活性。利用这一特性,可选用FCC与其他超广谱头孢菌素(ESC)进行双抑制剂扩散协同试验(double inhibitors diffuse synergy test,DIDST),观察其有无协同作用。因FCC 在琼脂中扩散能力较差,故试验过程中不直接选用FCC纸片,而是将FCC药液直接加在空白纸片上进行扩散,这样才
能观察到协同试验的效果。
具体操作方法:在M2H平板上均匀涂布待检菌株,中央贴一空白纸片,并在其周围20～25mm处贴上CTD、头孢曲松(CRO)、头孢哌酮(CFP)、氨曲南(A TN)、CTX和CPI纸片,再在空白纸片上滴加10mg/ml FCC20μl,35℃孵育18～24h,观察纸片之间的抑菌环情况。
FCC与任何一种头孢菌素协同为阳性,提示产AmpC 酶。
此方法与AmpC酶表型筛选试验相仿,即采用纸片扩散方法即可快速检测AmpC酶,操作简便、快速省时。结果基本可靠,可以在各临床微生物实验室推广应用。
四、三维试验[4,5,7,9]
三维试验也是利用AmpC酶可以水解头孢西丁的原理,先用冻融法或超声粉碎法将待检菌株中的β内酰胺酶提取出来(粗提),观察这种酶的粗提物对头孢西丁的抑制情况。如果粗提物中有AmpC酶存在,即可抑制头孢西丁的活性,使其周围对头孢西丁敏感的大肠埃希菌得以生长;反之,大肠埃希菌受头孢西丁的抑制则不能生长。
具体操作方法:(1)制备β内酰胺酶的粗提物:将待检菌株接种在M2H肉汤或胰蛋白大豆胨水中增菌,离心收集细菌,用0101mol/L的磷酸盐缓冲液或PBS(p H710)冲洗后制成一定浓度的细菌悬液,再用冻融法(-70℃快速冷冻、室温或37℃水浴快速解冻,反复5次)或超声粉碎法(4℃,超声粉碎)破碎菌细胞,使其菌体内的酶释放出来,再离心(12,000r/min,1h)去除细菌碎片,收集上清液即为β内酰胺酶的粗提物。取部分上清液接种M2H平板常规培养,证实无活菌存在。再用头孢硝噻吩纸片确定有β内酰胺酶的存在。(2)三维试验:将大肠埃希菌标准菌株A TCC25922按NCCL S的K2B法涂布在M2H平板上,在平板的中央贴一张FOX纸片,从距离纸片5mm处用无菌刀片在平板的琼脂上向外缘方向(离心方向)切一裂隙(一块平板可切4～5条裂隙),每一裂隙中加入25～30μl的一种待检菌株的β内酰胺酶粗提物(注意β内酰胺酶粗提物不可溢出裂隙),35℃培养18～24h,观察裂隙的内侧端(头孢西丁纸片的抑菌环内)周围有无细菌生长。
判断标准:裂隙的内侧端周围有细菌生长、导致头孢西丁纸片的抑菌环有缺失者为阳性,表明该裂隙内的β内酰胺酶为AmpC酶,也就是说这种待检细菌产AmpC酶。
因利用酶的粗提物而不是活菌做检测,不受抗生素的诱导影响,故三维试验是目前公认的、较为经典的检测(去阻遏)持续高产AmpC酶的方法,也是目前检测质粒AmpC酶最好的方法。但缺点是需增菌、破碎菌细胞并提取酶的粗提物,操作繁琐、费时,难以在临床微生物实验室常规应用。
五、等电聚焦及氟氯西林抑制试验[5,9,10]
AmpC酶的等电点相对集中,为610～1010,且大多≥910,故可用物理方法先将其从待检菌细胞中释放出来,制成酶的粗提物,再用等电聚焦的方法在琼脂糖凝胶板上将其与其他β内酰胺酶或其他蛋白成分分开。头孢硝噻吩(nitrocephin)是一种标记有硝基环的头孢菌素,溶于水后呈黄色,被β内酰胺酶(包括AmpC酶)水解后呈红色。氟氯西林可以抑制AmpC酶的活性,而对其他β内酰胺酶的活性则无明显的抑制作用。若先用氟氯西林对凝胶板上的酶进行抑制,再用头孢硝噻吩进行显色反应,被抑制掉的条带即可能为AmpC酶条带。
具体操作方法:用超声粉碎法制备待检细菌中的β内酰胺酶粗提物,再用Phastsystem电泳法进行等电聚焦(用两份同种β内酰胺酶粗提物跑出两块凝胶板,电泳的条件完全相同)。将一用氟氯西林(1mmol/L)浸润的滤纸条覆盖在第一块凝胶板(A板)上,而第二块凝胶板(B板)上仅覆盖用无菌蒸馏水浸润的滤纸条,30s后去除两块凝胶板上的滤纸,再分别覆盖上浸润头孢硝噻吩(500μg/ml)的滤纸条,1min 后揭去滤纸条,观察凝胶板上各条带的显色情况。
结果判断:如果A、B两块凝胶板上的条带颜色不同,即在B板上变色(由黄变红者)、而在A板上不变色(仍为黄色)的条带,即为AmpC酶,表明待检菌株产AmpC酶。
与三维试验相同,该方法也是利用酶的粗提物而不是活菌作检测,不受抗生素的诱导影响,也是用来检测(去阻遏)持续高产AmpC酶的方法,也可检测质粒AmpC酶。但缺点较三维试验更繁琐、费时,不宜在临床微生物实验室推广应用。
六、AmpC酶的基因检测
AmpC酶的基因组是由一种结构基因—amp C和4种调控基因———ampR、ampD、amp E和amp G所组成[2,3]。AmpC 酶基因存在于阴沟肠杆菌、黏质沙雷菌、拘橼酸杆菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、普通变形杆菌及肺炎克雷伯菌等产AmpC酶的细菌的染色体远端或质粒中。存在于不同细菌中的AmpC酶基因其特定的核苷酸序列都是相同的,即不论是结构基因ampC还是各种调控基因,都有其特定的核苷酸序列。故通过查找待检细菌中有无特定的AmpC酶的基因片段(通过特异性的基因引物,扩增待检细菌中特定的AmpC酶的基因片段,分析其特定的核苷酸序列),即可确定待检细菌能否产AmpC酶。
目前有报道可以检测的AmpC酶的基因有ampC基因和ampD基因[5,11,12]。
具体操作方法:用煮沸法提取待检细菌DNA或质粒DNA,再用PCR法进行扩增(94℃1min,56℃1min,72℃3 min,共35个循环)。扩增ampC基因的引物分别为:引物1 (5′2CTG A TG AAA GCCCA GTCTGT23′)和引物2(5′2 TTCGCG A GCA TCACAA TACC23′),扩增ampD基因的引物分别为:引物3(5′2CCG A GTAACA GCACCA TA G A23′)和引物4(5′2TA TTGCGCA TCGGTGTAA GG23′)。收集扩增产物(110%的琼脂糖凝胶电泳),经DNA自动测序仪测定其核苷酸序列,并与基因库中AmpC酶的ampC基因或ampD基因序列进行分析、比较,最终得出结果。
判断标准:待检细菌中找出AmpC酶特定的基因片段(ampC基因或ampD基因片段),表明该菌含有AmpC酶的
