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ESBLs与AmpC酶的检测及意义24论着?ChineseJournalofCurrelltPracticalMedicineOctober2008.Vl7.No10ESBLs与AmpC酶的检测及意义张益新【摘要】目的对近年耐三代头孢的阴沟肠杆菌进行p一内酰酶(主要是ESBLs与AmpC酶)监测以进行流行病学调查,同时作相关统计以指导实验室检测及临床用药.方法收集来自各种标本对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌33例,进行表型筛选试验及三维试验双重检测ESBLs与AmpC酶.结果表型筛选试验结果有24株产ESBLs,占72.73%;三维试验结果有32株产ESBLs,占96.97%,两者符合率为71.88%(23/32).表型筛选试验结果产AmpC酶10株,占30.30%;三维试验结果产AmpC酶8株,占24.24%,两者符合率为80.00%(8/10).其中表型筛选试验结果两种酶均产的有1株,三维试验结果两种酶均产的有8株.结论对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌主要产ESBLs,体外实验对亚胺培南敏感率为97.66%,对其它抗菌药物敏感性差.【关键词】阴沟肠杆菌超广谱p一内酰酶(ESBLs)AmpC酶表型筛选三维试验Serveillanceonp-laetamaProducedbyEnterobacterCloacae.ZhangYixin.Departmentofh ematological,TheCentralHospitalofYiwu,Zhejiang,322000China.[Abstract]ObjectiveToservei13-lactama(mainlytheextendedspectruml3一lactamaandAmpCenzyme1producedbyenterobactercloacaeresistanttothethirdgenuscephalosporinsinordertoproces sepidemiologiicalinvestigation,andtoprovidelaboratoryandphysicianswiththestatisticalanalysisofantibiot icssusceptibility.MethodsWecollected33strainsofenterobactercloacaeresistanttothethirdgenuscephalosp orinSfromallkindsofspecimens,thendetectESBLsandAmpCenzymewiththephenotypescreeningtestandthr ee-dimensiontest.ResultsAmong33strainsofenterobactercloacae,therewere24strains(72.73%)and32s trains(96.97%) producingESBLsinphenotypescreeningtestandthree—dimensionaltestrespectively,andthecoincidencewas71.88%.Buttherewere10strains(30.30%)and8strains(24.24%)producingtheAmpCenzy meinthetwotestsrespectively,andtherewasacoincidenceof80.00%.Therewere1strainsproducingthetwoty pesofenzymesinphenotypescreeningtest,but8strainsinthelattertest.ConclusionEnterobactercloacaeresist anttothethethirdgenuscephalosporinsproducesESBLsmaily.Thereisasusceptibilityrateof97.66%toimipe nemforitinvitro,butitiSlesssusceptivetootherantibiotics.[Keywords]EnterobactercloacaeExtendedspectrum~-lactamaAmpCenzymePhenotype screeningtestThree.dimensiontest中图分类号:1t.969.3文献标识码:B文章编号:1726.619X(2oo8)10.0024.04随着广谱抗菌药的广泛使用,多重耐药细菌感染日益增多,已成为临床治疗细菌感染的一大难点.自p一内酰胺类抗生素的应用于临床以来,细菌产p.内酰酶种类也越来越多.革兰阴性菌的耐药问题主要是由于产生了ESBLs与AmpC酶,这两种酶于20 世纪80年代相继有报道,随后产酶株的检出越来越【作者单位】:浙江省义乌市中心医院输血科(322000) 【作者简介】:张益新,女,27岁,检验师.多,主要导致了耐药菌的交叉感染,成为严重的耐药问题.阴沟肠杆菌作为一种两类酶均能产生的细菌,已倍受重视.阴沟肠杆菌是人体的条件致病菌,主要存在于呼吸道与消化道,随着院内广谱抗菌药的广泛应用及患者基础疾病的存在,免疫抑制剂,激素类药物的使用导致患者免疫力低下而出现阴沟肠杆菌的异位定植或引起茵群失调,出现的感染以长期,反复,多部位,多重耐药为特征且不易治愈,中国现代实用医学杂志,2008年10月,第7卷,第10期这无疑升高了院内感染率.现国内外对阴沟肠杆菌的研究甚多,从耐药性分析,检测方法及其比较,到临床应用及对策都有报道.现ESBLs与AmpC酶的检测方法已基本成熟,本研究通过对阴沟肠杆菌产B-内酰胺酶(主要是ESBLs与AmpC酶)的监测,了解临床上耐三代头孢的阴沟肠杆菌耐药的主要原因及ESBLs与AmpC酶于此类耐药中出现频率,即其流行情况,并同时统计这些耐药菌对其它抗生素的耐药情况,现报道如下.1材料1.1菌株收集2006年1月~2007年2月我院来自各种标本对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌33例.大肠埃希菌标准菌株ATCC25922一株.质控株为经VITEK确认产ESBLs的肺炎克雷伯菌一株.1.2药敏纸片头孢他啶(CZA),头孢噻肟(CTX),亚胺培南(IPM),氨苄青霉素/舒巴坦(AMS),头孢西丁(FOX),头孢ⅡfB肟(FEP).1.3其它生理盐水,克拉维酸粉剂,氯唑西林粉剂,血平板,MH平板等.2方法本实验先采用纸片扩散法进行初筛,后用改良的三维试验进一步确认,具体方法如下.2.1表型筛选试验¨2.1.1实验方法按照K-B法的要求,新分离的纯菌种配成0.5McFarland密涂于MH琼脂平板(~=90mm) 上,两对角分别贴上CZA,CTX和IPM,AMS.CZA,CTX与IPM间距25mm为佳,而与AMS间距20mm为佳,35~C培养24h后,判断结果.2.1.2结果判断(1)ESBLs阳性:CZA,CTX与AMS之间协同受AMS影响侧抑菌环直径一不受AMS影响侧2>5ram;(2)AmpC酶阳性:CZA,CTX与IPM之间拮抗&受IPM影响侧抑菌环直径一不受影响侧>5ram;(3)ESBLs阳性+AmpC酶阳性(1)+(2);(4)突变高产AmpC酶:三代头孢无抑菌圈而对IPM敏感.2.2改良三维实验2.2.1粗提酶(冻融裂解法)新分离的纯菌种配成0.5McFarland密涂于1/4MH琼脂平板(cl~=90mm)上, 35~C培养24h后用无菌棉签取下全部菌苔于1ml灭菌生理盐水中(用】.5ml离心管),一80℃冻融数次,培养无菌生长后4℃1O000r/min离心20min,取上清液头孢硝噻吩纸片确定p一内酰胺酶存在后一20℃保存待用.2.2.2改良三维实验【J将大肠埃希菌标准株ATCC25922配成0.5McFarland密涂于两块MH琼脂(qb=90mm)1Omin后于平板中央分别贴1片30ggFOX 纸片和一片30ggFEP纸片,距纸片5mm处纸片两边分别垂直打两个lmm宽10mm长的槽,FOX纸片平板的两槽内分别加酶粗提液+1Op.g/ml氯唑西林(9:1)25~40gl和酶粗提液25~40pl而FEP纸片平板上的两槽内分别加酶粗提液25~40pl和酶粗提液+l0~tg/ml克拉维酸(9:1)25~401.tl,35~C培养24h后判断结果.2.2.3结果判断(1)抑菌圈均完整光滑表示为阴性结果,即两种酶均不产(如图1);(2)ESBLs阳性:加酶粗提液的槽与FEP纸片交界处出现扩大生长而其它处抑菌圈完整光滑(如图2);(3)AmpC酶阳性:加酶粗提液的槽与FOX纸片交界处出现扩大生长区而其它处抑菌圈完整光滑(如图2);(4)ESBLs+AmpC酶:加酶粗提液的槽与FEP纸片和FOX纸片交界处均有扩大生长区而其它处抑菌圈光滑完整(两个平板均如图2所示);(5)纸片与两槽交界处均出现扩大生长区表示抑制酶的抗生素量不足或产ESBLs与AmpC酶之外的酶(如图3).3结果3.1表型筛选试验结果33株阴沟肠杆菌中表现为单产ESBLs的有23株,占69.70%;表现为单产AmpC 酶的有1株,占3.03%;同时产两种酶的有l株,占3.03%;而表现突变高产AmpC酶的有8株,占24.24%.3.2三维试验结果33株阴沟肠杆菌中表现为单产ESBLs的有24株,占72.73%;没有单产AmpC酶;表现为同时产两种酶的有8株,占24.24%;结果阴性即不产这两种酶的有1株(头孢硝噻吩纸片确定13-内酰胺酶试验阳性),占3.03%.3.3两种方法结果比较33株阴沟肠杆菌表型筛选试验结果ESBLs阳性共有24株,占72.73%;三维试验结果ESBLs阳性的共有32株,占96.97%,两者符合率为71.88.00%(23/32),其中一株表型筛选试验结果产ESBLs而三维试验结果表现阴性即两类酶均不产.表型筛选试验结果33株阴沟巾AmpC酶阳性的共有10株,占30.30%;三维试验结果AmpC酶阳性的共有8株,占24.24%,两者符合率为80.00%(s/10.图1阴性结果图2阳性结果图3酶抑制物浓度不足或产另类酶,需重测注:图1中上槽和2,3中左槽内加酶粗提液酶抑制剂;图1t}下槽和图2,3巾右槽内加酶粗提液.3.4药敏统计结果统计本院检出阴沟肠杆菌有254株,其中对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌有171株,占67.32%.这171株对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌耐药谱广泛,体外实验对亚胺培南敏感率为97.66%,头孢替坦敏感率为27.49%,复方新诺明为22.81%,其余氨基糖甙类,喹诺酮类等抗生索均高度耐药,而对氨苄西林与头孢唑啉呈全部耐药.而本实验的33株三代头孢耐药的阴沟肠杆菌的药敏情况,基本与总的统计结果符合,这些阴沟肠杆菌体外实验对亚胺培南敏感率为100.00%,而其他均呈现高度耐药甚至全部耐药.4讨论ESBLs是一种丝氨酸蛋白酶,Bush分类属Group2,而Ambler分类属ClassA,主要由质粒介导少数由染色体介导,往往具有多重耐药性,常见于肺克,大肠,阴沟等菌中.能灭活三代头孢菌素等p-内酰类抗生素和氨曲南,不能水解头霉素类,能被克拉维酸等酶抑制剂抑制,但不能被氯唑西林所抑制.VITEK对产ESBLs细菌检出率敏感性为99.5%, 特异性为100%【jJ.本研究表型筛选试验结果33株阴沟中产ESBLs24株,占72.73%;三维试验结果33株阴沟肠杆菌中表现为产ESBLs32株,占96.97%,两者符合率为71.88%(23/32),其中一株表型筛选试验结果产ESBLs而三维试验结果表现阴性即两类酶均不产.AmpC酶Bush分类属Groupl,而Ambler分类属ClassC,主要由染色体介导少数由质粒介导,常见于阴沟,产气肠杆菌等菌.AmpC酶能被I3一内酰类抗生素诱导,属诱导酶,它不能被克拉维酸等酶抑制剂抑制,但能被氯唑西林所抑制.本研究表型筛选试验结果33株阴沟中产AmpC酶l0株,占30.30%;三维试验结果33株阴沟肠杆菌中表现为产AmpC酶8株,占24.24%,两者符合率为80.00%(8/10) 与文献…89.58%较为相符.本实验利用表型筛选和三维试验相结合,以取长补短.表型筛选检测方便且快速,为NCCLS所推荐,此方法为检测ESBLs的可靠方法,但检测AmpC 酶结果易受多种因素影响,比如细菌本身对亚胺培南的诱导的敏感性(有报道显示29.2%为组成性高产AmpC酶而64.2%为诱导性高产AmpC酶)等使结果不易判读;而三维试验由ThornasonSander创立,为公认的AmpC酶检测方法,虽操作繁琐费时但准确度高,结果清晰易判读,是检测ESBLs和AmpC酶的经典方法.根据实验结果显示我院对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌主要产ESBLs,这与文阴沟肠杆菌以产AmpC酶为主不符,可能存在地区差异.我院对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌占67.32%,较文献阴沟肠杆菌对三代头孢耐药率为40%～60%稍高.本实验对三代头孢耐药菌株进行了常规药敏结果统计示此类菌对亚胺培南敏感率为97.66%,与1994~2001年中国ICUG耐药性监测研究发现对阴沟肠杆菌体外活性最好的是亚胺培南(95%)相符, 中国现代实用医学杂志,2008年10月,第7卷,第10期而头孢替坦敏感率为27.49%,复方新诺明为22.81%, 其余氨基糖甙类,喹诺酮类等抗生素均高度耐药,无临床应用价值.一般三代头孢菌素应用越早,越普遍的地区,细菌产ESBLs比例越高,ESBLs主要由质粒介导,很容易在细菌间传递扩散,导致对抗生素耐药细菌的广泛传播,及治疗选药的困难,多资料显示治疗产两种p一内酰酶的细菌所引起的感染,应首选碳青霉烯类抗生素l,而产某一种的可考虑应用复合制剂或联合用药等.实验室可注意分离菌株的耐药情况对两种酶进行测定,同时对临床加以指导从而避免滥用抗生素而出现高耐药的诱导产酶菌对临床治疗带来困难,通过合理用药而达到疗效同时延缓昂贵广谱抗生素的应用,减轻患者经济负担等,做到最大限度的节省人力,物力而达到最有效的治疗,尽量避免多重耐药的发生.【参考文献】[1]周志慧,李兰娟,俞云松,裘云庆,马亦林.两种检测AmpC酶方法的比较冲华检验医学杂志,2002,25 (2):88～90[2】陈东科,张志敏,张秀珍.三维法检测13内酰酶的影响因素探讨及方法的改进.中华检验医学杂志,2003,26(10):600～604[3】ChristinC.Sanders,ArthurL.BaJ'ry,JohnA.论着?27Washington,eta1.Detectionofextended—spetrum3-lactamasesproducingmembersofthefamily enterobactmiaceaewiththeVITEKESBLTest.J ChinMicrobiol,1996,34(12):2997～3001[4】余丹阳,刘又宁,崔岩.四月蒿药学资源.药物与临床杂志,2001,l6(6)[5]李艳,王海英,左云,李玉.肠杆菌科细菌产AmpC酶和ESBLs的状况及药敏检测分析.山东医药杂志.2002.42(2):39～41[6】陈民钧,王辉冲国危症监护病房革兰阴性菌耐药性连续7年监测研究_中华医学杂志,2003,83(5):375～38l【7]SaurinaG.QualeJM,ManikalVM,eta1.Antimi—crobialresistanceinenterobacteriaceaeinbrookly,NY:EpidemiologyandrelationtoantibioticusagepatternS.AntimicrobAgentsChemother,2000,45:895[8]肖倩.产ESBLs细菌的研究进展.广西医学杂志, 2002,24(5):673～676【9】余3-&.质粒介导的AmpC酶研究进展冲华检验医学杂志,2003,26(11):706—709[收稿日期2008-08-25]绝经后妇女长期补充雌三醇68例临床观察刘静肖J【摘要】由于人类寿命的延长,妇女在绝经后雌激素缺乏的情况下仍将继续生活20~30年,约占生命过程的l/3,由于雌激素水平的下降,使脂肪,糖,蛋白质,骨代谢紊乱,从而使冠心病,老年性痴呆,骨质疏松性骨折的发病率明显升高.为此,国内外学者广泛应用雌激素替代治疗,以缓解绝经期症状,提高绝经后妇女的生活质量,取得了良好效果.【关键词】绝经后妇女激素替代治疗有效性安全性中图分类号:R711.51文献标识码:B文章编号:本文对绝经后长期单纯补充雌三醇进行临床观【作者单位】:江西省妇幼保健院(江西南昌330006)察,对绝经后单纯补充雌三醇可使其骨代谢紊乩,冠心病,乳腺癌,子宫内膜癌减少40%,本文显示长期单纯性补充雌激素不会引起癌症.。
三种检测AmpC酶方法的比较陈林珍;李晓穗;刘一鸣;邹燕【期刊名称】《广东药学院学报》【年(卷),期】2006(22)1【摘要】目的采用三维试验、表型筛选法及头孢西丁纸片药敏法(K-B法)同时检测肠道G-杆菌的AmpC酶,并加以比较,找出一种适合临床常规应用的检测AmpC酶的方法.方法用头孢硝噻吩法检测出97株β-内酰胺酶阳性的肠道G-杆菌作为试验待测菌,用头孢西丁药敏法、表型筛选法测定细菌耐药情况,以判断产AmpC酶的情况.用三维分析法测定细菌粗提物中的AmpC酶情况.结果 97株肠道杆菌头孢西丁药敏法结果显示产AmpC酶共有36 株,占37.1%(36 /97),与三维试验比较总符合率为74.2%.表型筛选法产AmpC酶的菌株有15株,占15.5%(15/97),与三维试验比较总符合率为91.8 %.结论表型筛选法与三维试验法比较差异无显著性.表型筛选法可以作为一种临床快速、简便、可靠的检测AmpC酶的方法.【总页数】2页(P103-104)【作者】陈林珍;李晓穗;刘一鸣;邹燕【作者单位】广东药学院附属第一医院,检验科,广东,广州,510080;广东药学院附属第一医院,检验科,广东,广州,510080;广东药学院附属第一医院,检验科,广东,广州,510080;广州市新海医院,检验科,广东,广州,510300【正文语种】中文【中图分类】R446.62【相关文献】1.三种AmpC酶表型检测方法比较 [J], 侯伟伟;蒋燕群2.检测阴沟肠杆菌产AmpC酶的三种方法比较 [J], 顾怡明;张杰;俞云松;周志慧;杜小玲3.三种AmpC酶表型检测方法临床比较分析 [J], 朱向阳4.三种检测阴沟肠杆菌AmpC酶方法的比较 [J], 叶惠芬;周小棉;陈惠玲;刘红伟5.三种检测阴沟肠杆菌AmpC酶方法的比较 [J], 朱建峰;张雪松因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
AmpC酶AmpC 酶是AmpCβ内酰胺酶的简称。
是由肠杆菌科细菌或和绿脓假单胞菌的染色体或质粒介导产生的一类β内酰胺酶,属β内酰胺酶Ambler 分子结构分类法中的C 类和Bush Jacoby Medeiros 功能分类法中第一群,即作用于头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制的β内酰胺酶。
故AmpC 酶又称作为头孢菌素酶。
AmpC 酶按其产生的方式分为3 类:诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶。
(1) 诱导高产酶:AmpC 酶的合成往往与β2内酰胺类抗生素的存在有关。
绝大部分肠杆菌科细菌和绿脓假单胞菌在正常条件下(即无β内酰胺类抗生素存在的条件下) 只产生少量的AmpC 酶。
而当有诱导作用的β内酰胺类抗生素存在的条件下,AmpC 酶的产量明显增加,增加的范围在100～1 000 倍之间。
(2) 持续高产酶:另有一部分产AmpC 酶的菌株不论在有无β内酰胺类抗生素存在的条件下均可持续高水平产生AmpC 酶,其原因为去阻遏突变,即调控基因之一的ampD 基因发生突变,产生的有缺陷的AmpD 蛋白,不能与另一种调控蛋白—AmpR 蛋白结合形成复合物,AmpR 蛋白即以激活子状态发挥激活作用,引起AmpC酶的大量表达。
质粒介导的AmpC 酶往往都属于此类AmpC 酶。
产生这种AmpC 酶的细菌对临床的危害最大,是临床微生物实验室检测的重点。
(3) 持续低产酶:还有极少部分产AmpC 酶的菌株,不论在有无β内酰胺类抗生素的存在的条件下均持续低水平的产生AmpC 酶,其原因可能是另一种调节基因—ampR 基因发生突变, 产生有缺陷的AmpR 蛋白,不能在无β内酰胺类抗生素存在的条件下起到抑制子的作用,也不能在有β内酰胺类抗生素存在的条件下起到激活子的作用,故AmpC 酶得以持续低水平地表达。
检测不同类型的AmpC 酶或检测产不同类型AmpC 酶的菌株,其方法也有所不同。
近年来,随着β内酰胺类抗生素、尤其是头孢菌素的广泛应用,产AmpC 酶的革兰阴性杆菌越来越多见,尤其是出现了(去阻遏) 持续高产AmpC 酶和质粒介导的AmpC 酶,导致耐药菌株广泛传播和临床对该类细菌感染的治疗困难,已引起临床的高度重视,故检测AmpC 酶具有非常重要的临床意义。
作者单位:200003上海,第二军医大学附属长征医院实验诊断科・继续教育园地・AmpCβ内酰胺酶的检测赵虎 孔宪涛 AmpCβ内酰胺酶(简称AmpC酶)是由肠杆菌科细菌或/和绿脓假单胞菌的染色体或质粒介导产生的一类β内酰胺酶,属β内酰胺酶Ambler分子结构分类法中的C类和Bush2 Jacoby2Medeiros功能分类法中第一群,即作用于头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制的β内酰胺酶。
故AmpC酶又称作为头孢菌素酶[1,2]。
AmpC酶按其产生的方式分为3类:诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶[2,3]。
(1)诱导高产酶:AmpC酶的合成往往与β2内酰胺类抗生素的存在有关。
绝大部分肠杆菌科细菌和绿脓假单胞菌在正常条件下(即无β内酰胺类抗生素存在的条件下)只产生少量的AmpC酶。
而当有诱导作用的β内酰胺类抗生素存在的条件下,AmpC酶的产量明显增加,增加的范围在100～1000倍之间。
(2)持续高产酶:另有一部分产AmpC酶的菌株不论在有无β内酰胺类抗生素存在的条件下均可持续高水平产生AmpC酶,其原因为去阻遏突变,即调控基因之一的ampD基因发生突变,产生的有缺陷的AmpD蛋白,不能与另一种调控蛋白—AmpR蛋白结合形成复合物,AmpR蛋白即以激活子状态发挥激活作用,引起AmpC酶的大量表达。
质粒介导的AmpC酶往往都属于此类AmpC酶。
产生这种AmpC酶的细菌对临床的危害最大,是临床微生物实验室检测的重点。
(3)持续低产酶:还有极少部分产AmpC酶的菌株,不论在有无β内酰胺类抗生素的存在的条件下均持续低水平的产生AmpC酶,其原因可能是另一种调节基因—ampR基因发生突变,产生有缺陷的AmpR蛋白,不能在无β内酰胺类抗生素存在的条件下起到抑制子的作用,也不能在有β内酰胺类抗生素存在的条件下起到激活子的作用,故AmpC酶得以持续低水平地表达。
检测不同类型的AmpC酶或检测产不同类型AmpC酶的菌株,其方法也有所不同。
近年来,随着β内酰胺类抗生素、尤其是头孢菌素的广泛应用,产AmpC酶的革兰阴性杆菌越来越多见,尤其是出现了(去阻遏)持续高产AmpC酶和质粒介导的AmpC酶,导致耐药菌株广泛传播和临床对该类细菌感染的治疗困难,已引起临床的高度重视,故检测AmpC酶具有非常重要的临床意义。
目前已陆续报道了多种检测AmpC酶的方法,除改良的三维试验较为经典外,其他的检测方法还不成熟,尚在摸索、试验阶段,检测的结果也各不相同。
现讲述如下。
一、头孢西丁敏感试验[4]AmpC酶可以水解头孢西丁(FOX),即产AmpC酶的菌株对头孢西丁耐药。
而ESBLs等其他β内酰胺酶一般不能分解头孢西丁,即产ESBLs的菌株对头孢西丁敏感。
利用AmpC酶的这一特性,可以对产AmpC酶的菌株进行初步筛选。
具体操作方法:(1)纸片扩散法:按美国临床实验室标准化委员会(NCCL S)的纸片扩散(K2B)法进行。
FOX纸片的含量为30μg。
判断标准为抑菌环<18mm,表示待检菌株对FOX耐药。
(2)稀释法:手工的(微量)肉汤稀释方法参照NCCL S的方法进行;也可用MicroScan等微生物分析仪进行分析,操作方法按其操作规程进行。
判断标准为MIC>16μg/ml,表示待检菌株对FOX耐药。
对FOX耐药的菌株,应怀疑产AmpC酶可能。
当然,不是所有对头孢西丁耐药的菌株都是产AmpC酶的菌株(目前产ESBLs菌株对头孢西丁的耐药率已超过30%)。
故此方法仅仅作为初步筛选。
需做三维试验或纸片协同试验等试验,进行进一步的确定。
二、AmpC酶表型筛选试验[5]根据AmpC酶对大部分头孢菌素、尤其是三代头孢菌素耐药的特性,选用多种头孢菌素纸片对产AmpC酶的菌株进行表型筛选。
可选用亚胺培南(IP)、头孢吡肟(FEP)、头孢他啶/克拉维酸(CTD/Cla)、头孢噻肟(CTX)和头孢噻肟/克拉维酸(CTX/Cla)5种抗生素纸片进行筛选试验。
具体操作方法按NCCL S的K2B法进行。
判断标准:(1)IP、FEP敏感,而CTX、CTD/Cla和CTX/ Cla耐药;(2)IP、FEP敏感,而在CTX、CTD/Cla和CTX/Cla 的抑菌环内存在散在的菌落;(3)IP敏感,而FEP、CTD/Cla 和CTX/Cla耐药。
以上3种结果提示,待检菌株产AmpC 酶。
最后一种表型提示,待检菌株产AmpC酶的同时,产生其他β内酰胺酶,如产ESBLs。
此方法操作简便、快速省时,较三维试验简单得多,结果基本可靠,与三维试验的符合率达89158%。
可以在各临床微生物实验室推广应用。
三、氟氯西林(FCC)双抑制剂扩散协同试验[6,7]氟氯西林(FCC)可抑制AmpC酶的活性,使产AmpC酶的菌株不能及时水解和破坏头孢菌素,保留了这些抗生素的抗菌活性。
利用这一特性,可选用FCC与其他超广谱头孢菌素(ESC)进行双抑制剂扩散协同试验(double inhibitors diffuse synergy test,DIDST),观察其有无协同作用。
因FCC 在琼脂中扩散能力较差,故试验过程中不直接选用FCC纸片,而是将FCC药液直接加在空白纸片上进行扩散,这样才能观察到协同试验的效果。
具体操作方法:在M2H平板上均匀涂布待检菌株,中央贴一空白纸片,并在其周围20～25mm处贴上CTD、头孢曲松(CRO)、头孢哌酮(CFP)、氨曲南(A TN)、CTX和CPI纸片,再在空白纸片上滴加10mg/ml FCC20μl,35℃孵育18～24h,观察纸片之间的抑菌环情况。
FCC与任何一种头孢菌素协同为阳性,提示产AmpC 酶。
此方法与AmpC酶表型筛选试验相仿,即采用纸片扩散方法即可快速检测AmpC酶,操作简便、快速省时。
结果基本可靠,可以在各临床微生物实验室推广应用。
四、三维试验[4,5,7,9]三维试验也是利用AmpC酶可以水解头孢西丁的原理,先用冻融法或超声粉碎法将待检菌株中的β内酰胺酶提取出来(粗提),观察这种酶的粗提物对头孢西丁的抑制情况。
如果粗提物中有AmpC酶存在,即可抑制头孢西丁的活性,使其周围对头孢西丁敏感的大肠埃希菌得以生长;反之,大肠埃希菌受头孢西丁的抑制则不能生长。
具体操作方法:(1)制备β内酰胺酶的粗提物:将待检菌株接种在M2H肉汤或胰蛋白大豆胨水中增菌,离心收集细菌,用0101mol/L的磷酸盐缓冲液或PBS(p H710)冲洗后制成一定浓度的细菌悬液,再用冻融法(-70℃快速冷冻、室温或37℃水浴快速解冻,反复5次)或超声粉碎法(4℃,超声粉碎)破碎菌细胞,使其菌体内的酶释放出来,再离心(12,000r/min,1h)去除细菌碎片,收集上清液即为β内酰胺酶的粗提物。
取部分上清液接种M2H平板常规培养,证实无活菌存在。
再用头孢硝噻吩纸片确定有β内酰胺酶的存在。
(2)三维试验:将大肠埃希菌标准菌株A TCC25922按NCCL S的K2B法涂布在M2H平板上,在平板的中央贴一张FOX纸片,从距离纸片5mm处用无菌刀片在平板的琼脂上向外缘方向(离心方向)切一裂隙(一块平板可切4～5条裂隙),每一裂隙中加入25～30μl的一种待检菌株的β内酰胺酶粗提物(注意β内酰胺酶粗提物不可溢出裂隙),35℃培养18～24h,观察裂隙的内侧端(头孢西丁纸片的抑菌环内)周围有无细菌生长。
判断标准:裂隙的内侧端周围有细菌生长、导致头孢西丁纸片的抑菌环有缺失者为阳性,表明该裂隙内的β内酰胺酶为AmpC酶,也就是说这种待检细菌产AmpC酶。
因利用酶的粗提物而不是活菌做检测,不受抗生素的诱导影响,故三维试验是目前公认的、较为经典的检测(去阻遏)持续高产AmpC酶的方法,也是目前检测质粒AmpC酶最好的方法。
但缺点是需增菌、破碎菌细胞并提取酶的粗提物,操作繁琐、费时,难以在临床微生物实验室常规应用。
五、等电聚焦及氟氯西林抑制试验[5,9,10]AmpC酶的等电点相对集中,为610～1010,且大多≥910,故可用物理方法先将其从待检菌细胞中释放出来,制成酶的粗提物,再用等电聚焦的方法在琼脂糖凝胶板上将其与其他β内酰胺酶或其他蛋白成分分开。
头孢硝噻吩(nitrocephin)是一种标记有硝基环的头孢菌素,溶于水后呈黄色,被β内酰胺酶(包括AmpC酶)水解后呈红色。
氟氯西林可以抑制AmpC酶的活性,而对其他β内酰胺酶的活性则无明显的抑制作用。
若先用氟氯西林对凝胶板上的酶进行抑制,再用头孢硝噻吩进行显色反应,被抑制掉的条带即可能为AmpC酶条带。
具体操作方法:用超声粉碎法制备待检细菌中的β内酰胺酶粗提物,再用Phastsystem电泳法进行等电聚焦(用两份同种β内酰胺酶粗提物跑出两块凝胶板,电泳的条件完全相同)。
将一用氟氯西林(1mmol/L)浸润的滤纸条覆盖在第一块凝胶板(A板)上,而第二块凝胶板(B板)上仅覆盖用无菌蒸馏水浸润的滤纸条,30s后去除两块凝胶板上的滤纸,再分别覆盖上浸润头孢硝噻吩(500μg/ml)的滤纸条,1min 后揭去滤纸条,观察凝胶板上各条带的显色情况。
结果判断:如果A、B两块凝胶板上的条带颜色不同,即在B板上变色(由黄变红者)、而在A板上不变色(仍为黄色)的条带,即为AmpC酶,表明待检菌株产AmpC酶。
与三维试验相同,该方法也是利用酶的粗提物而不是活菌作检测,不受抗生素的诱导影响,也是用来检测(去阻遏)持续高产AmpC酶的方法,也可检测质粒AmpC酶。
但缺点较三维试验更繁琐、费时,不宜在临床微生物实验室推广应用。
六、AmpC酶的基因检测AmpC酶的基因组是由一种结构基因—amp C和4种调控基因———ampR、ampD、amp E和amp G所组成[2,3]。
AmpC 酶基因存在于阴沟肠杆菌、黏质沙雷菌、拘橼酸杆菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、普通变形杆菌及肺炎克雷伯菌等产AmpC酶的细菌的染色体远端或质粒中。
存在于不同细菌中的AmpC酶基因其特定的核苷酸序列都是相同的,即不论是结构基因ampC还是各种调控基因,都有其特定的核苷酸序列。
故通过查找待检细菌中有无特定的AmpC酶的基因片段(通过特异性的基因引物,扩增待检细菌中特定的AmpC酶的基因片段,分析其特定的核苷酸序列),即可确定待检细菌能否产AmpC酶。
目前有报道可以检测的AmpC酶的基因有ampC基因和ampD基因[5,11,12]。
具体操作方法:用煮沸法提取待检细菌DNA或质粒DNA,再用PCR法进行扩增(94℃1min,56℃1min,72℃3 min,共35个循环)。
扩增ampC基因的引物分别为:引物1 (5′2CTG A TG AAA GCCCA GTCTGT23′)和引物2(5′2 TTCGCG A GCA TCACAA TACC23′),扩增ampD基因的引物分别为:引物3(5′2CCG A GTAACA GCACCA TA G A23′)和引物4(5′2TA TTGCGCA TCGGTGTAA GG23′)。
