β-内酰胺酶及其活力测定法

牛乳制品青霉素酶的检测方法探析一、β-内酰胺酶检测方法及原理现有的青霉素酶的检测方法有碘量法、酸度法、高效液相色谱法、酶联免疫法、头孢硝噻吩显色法以及杯碟法等。

碘量法是《中国药典》中规定的检测β-内酰胺酶活性的方法，该法方便快捷、检出限高。

现阶段，牛乳制品中β-内酰胺酶的检测方法采用的是卫生部制定的《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类物质检验方法杯碟法》，该方法可以检测出生鲜乳中未反应完全的β-内酰胺酶，可用于检测未经过任何加工的牛奶，并且检出限较低，容易区分外源性和内源性β-内酰胺酶。

其检测原理是以一种对青霉素高度敏感的细菌作为指示菌，实验时如果被测牛奶样品含有青霉素酶，破坏了青霉素，指示菌株即可生长，否则指示菌将被抑制。

同时，通过与标准品比对抑菌圈的大小，可以定量地确定β-内酰胺酶的含量。

崔生輝等运用β-内酰胺酶特异性抑制剂舒巴坦建立了该酶的检测方法，该方法在牛奶中的检出限为4U/mL。

目前，微生物法仍然是实验室检测牛奶中β-内酰胺酶的主要方法。

二、材料和方法（一）材料和试剂青霉素酶（P0389，sigma）；Zeba Spin 脱盐柱（89889，Thermo Scientific）；青霉素酶抗体（ab12251，Abcam）；青霉素酶（ab10712，Thermo Scientific）；Chroma Link™ Biotin （B-1001-010，Solulink）；鸡抗鼠IgG （ab6706，Abcam）；Alpha Screen®Streptavidin Donor beads（6760002，perkinelmer）；Alpha Screen® Unconjugated Acceptor Beads（6762001，perkinelmer）。

（二）方法2.1抗原的纯化及生物素化抗原的纯化：将青霉素酶溶解于修饰缓冲液（100mmol/L 磷酸钠，150mmol/L NaCl，pH8.0）中，用Zeba Spin脱盐柱进行液体交换和脱盐净化。

β--内酰胺酶β-内酰胺酶及其检测方法β-内酰胺酶是细菌产生的可水解β-内酰胺环抗生素的酶。

β-内酰胺酶（β-lactamase）的产生是细菌对(β内酰胺类)抗菌药物耐药最常见的机制，，广泛地涉及到许多社区获得性感染和医院内感染的重要病原菌，在各种耐药机制中占80%。

β-内酰胺酶是由多种酶组成的酶家族，通过水解或非水解方式破坏进入菌体内的β-内酰胺环，导致β-内酰胺类抗生素失活，这些酶的基因存在于细菌的染色体或质粒中。

它的种类和数量现已超过了400种，β-内酰胺酶分类比较多而复杂，最常用的有两种，即分子生物学方法和布氏法。

其检测方法包括常规方法和分子生物学方法。

前者包括微生物法，碘量法，纸片酸度定量法，.产色头胞菌素法；后者包括转移性分析，基因分析，酶蛋白性质分析。

一β内酰胺酶的合成、定位及传播方式β内酰胺酶既可以在细菌内组成型表达，如铜绿假单胞菌；又可以由质粒介导的诱导表达，如嗜水气单胞菌及金黄色葡萄球菌。

而质粒介导的方式是细菌耐药性传播的一个主要机制，在革兰氏阴性菌中利用接合的方式进行传播，而在革兰氏阳性菌中利用转导的方式获得耐药性状。

细菌的这种耐药性状的可转移性正是细菌耐药性爆发的原因。

在革兰氏阴性菌中，β内酰胺酶象胞外酶一样被分泌到膜外的环境，而在革兰氏阳性菌中，β内酰胺酶在它与受体结合以攻击抗生素的之前则停留在周质腔中。

二β内酰胺酶的作用机制β内酰胺酶破坏β内酰胺抗生素的β内酰胺环有两种作用机制。

第一，绝大多数常见的β内酰胺酶有一个依赖丝氨酸发挥作用的机制，并且根据氨基酸序列组成分为三类（A，C和D）。

通常它们的活性位点具有一个狭窄的纵形沟状结构，在沟的底部形成了一个空腔（氧阴离子袋），这种疏松的构造容易弯曲，便于结合底物。

由于β内酰胺环上的羰基碳在结合β内酰胺酶活性部位的丝氨酸时发生了不可逆的反应，结果使其成为开环物，进而重建了β内酰胺酶。

这类酶对青霉素、头孢菌素、单内酰环类抗生素都有活性。

3
10．建议待测样本蛋白浓度为 100 微克/20 微升；如果样本酶活性过低或过高， 则可以增加或降低样本量 （本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度 12．β-内酰胺酶活性单位浓度定义：在 37℃温度下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解 1 微摩尔的头
[（样品读数－背景读数）X 样品稀释倍数 X 0.25（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）X 20.5 （毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 10（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫 克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔头孢硝噻吩/分钟
注意事项
1． 本产品为 20 次（比色皿）和 80 次（酶标板）操作 2． 操作时，须戴手套 3． 底物液（Reagent D）避免光照和反复冻融 4． 用户可以根据需求，配制反应工作液，不宜存放 5． 如果样品有限酶活性过低，建议使用细菌β-内酰胺酶活性荧光定量检测试剂盒（GMS10093.3） 6． 反应孵育完成后，即刻进行比色测定 7． 测定值由低到高变化；测定持续 10 分钟 8． 比色测定后，比色皿须清洗彻底 9． 样本测定 10 分钟读数高于 0 分钟读数表明具有酶活性
技术背景
β-内酰胺酶（β-lactamase；EC3.5.2.6）属于细菌酶蛋白家属的成员之一，29KD 单体蛋白（monomeric）。大 量细菌分泌产生，分布在细菌周边和细菌细胞浆内，通过水解酰胺键（amide bond），分解β-内酰胺（β-lactam） 的 4 原子环状结构，由此产生抗菌素抗性，例如青霉素类、头孢菌素类（cephalosporins）、头霉素类 （cephamycins）、 碳青霉素烯类（Carbapenems）抗性。β-内酰胺酶功能上分成 4 大组，结构上分成 4 大类。 β-内酰胺酶催化反应敏感有效，且容易测试。因此β-内酰胺酶成为崭新的报告基因，替代传统的β-半乳糖苷 酶报告基因系统，可以在活体细胞内实时监测基因转录、检测蛋白间相互作用、评价基因表达载体转染的 效果。基于头孢硝噻吩（Nitrocefin），一种黄色底物，对于所有β-内酰胺酶具有敏感性，在β-内酰胺酶的催 化下，水解产生红色产物，通过 486nm 波长的吸光峰值分析，来定量分析β-内酰胺酶的活性。

奶制品中三聚氰胺问题出现后，检科院按照国家局科技司的安排，对奶制品中可能的添加物进行了调查。经过前期的调研工作，初步判断市售解抗剂的主要成分是β-内酰胺酶，它是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的，可选择性分解牛奶中残留的β- 内酰胺类抗生素。β-内酰胺酶为我国不允许使用的食品添加剂,该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。β-内酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性，导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力，给消费者的身体健康带来危害。
（是否产生抑菌圈）
1 ＋ － － 有
2 ＋ － ＋ 有
3 ＋ ＋ － 无
4 ＋ ＋ ＋ 有
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同浓度舒巴坦（0ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，400ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察是否产生抑菌圈，以确定舒巴坦最高可适用浓度。
在青霉素G浓度（～0.5ug/ml）和舒巴坦最高适用浓度（～200ug/ml）确定的基础上，在
自陆桥。
1.3 试剂 试验用10U青霉素药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；舒巴坦、青霉素G、β-内酰胺酶标准品、生鲜牛乳抗生素分解剂、脱脂奶粉、生理盐水
1. 4 主要仪器 牛津杯（外径8mm）
2 方法
2.1 预试验
2.1.1 抗生素检测用培养基制备
90mm培养皿铺10ml抗生素检测用培养基Ⅱ（含1×108CFU/ml藤黄微球菌）。
2.1.5 β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素G和不同浓度β-内酰胺酶（0U/ml，4U/ml，40U/ml，200U/ml，300U/ml，400U/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。

安徽科技学院学报,2021,35(1):1-9Journal of Anhui Science and Technology University0-内酰胺酶的活性检测和抑制研究进展丁 阳，吴琼*,李林*(南京工业大学先进材料研究院，江苏南京210000)摘 要：-内酰胺类抗生素是20世纪的伟大发明之一，拯救了数以万计生命。

然而，随着抗生素临床应用 的普及，由—内酰胺酶导致的致病菌耐药性问题也日益突出。

耐药菌的进化和传播严重影响到人类健康 和全球社会经济发展。

因此，检测/抑制0内酰胺酶的活性对合理使用抗生素、有效治疗感染类疾病具有 重要意义。

目前，特异性检测、抑制！内酰胺酶的相关方法和临床应用已有报道。

本综述主要阐述细菌产 生-内酰胺酶的耐药机理，总结近年来！内酰胺酶荧光探针和抑制剂的发展，以期为今后设计特异性高、 灵敏度强的该类荧光探针和抑制剂提供理论依据，解决抗生素耐药性问题。

关键词：-内酰胺酶;耐药菌；抗生素；荧光探针;抑制剂中图分类号:R1文献标志码:A 开放科学(资源服务)标识码(OSID):文章编号：16738772(2021)01000109DOI ：10. 19608/j. cnki. 1673-8772. 2017. 0913Recent Progress in Detection and Inhibition of the Activity of p-LactamaseDING Yang, WU Qiong * , LI Lin *(Institute of Advanced Materials , Nanjing Tech University, Nanjing 210000, China)Abstract :Lactam antibiotics are generally perceived as one of the greatest inventions of the 20th centu ­ry, and these small molecular compounds have saved millions of lives. However, upon clinical applica ­tion of antibiotics, the 0—lactamase secreted by pathogenic bacterias can lead to the gradual development of drug resistance. As a result, detecting and inhibiting the activities of -lactamase are of great value for 2heraionaluseofanibioicsand2he2rea2men2ofinfeciousdiseases1A2presen2(manyspecificde2ec- ionme2hodsandinhibiorsof -lac2amasehavebeendevelopedandappliedinclinicalpracice1In2his review (we describe2he resis2ance mechanism of bac2eria producing -lac2amaseandfur2hersummarize 2hefluorogenicprobesandinhibiorsof -lac2amase 1I2may be valuable2o design fluorogenic probes wihimprovedseleciviy (sensiiviy (ande f eciveness2ofur2heridenify2heinhibiorsfor -lac2amases andeven2ua l yovercomebac2erialresis2ance1Key words : 0-Lactamase; Drug-resistant bacterias; Antibiotics; Fluorogenic probes; Inhibitors收稿日期：2021-01-02基金项目：国家自然科学基金项目(81672508)；江苏省研究生科研与实践创新计划(KYCX-1056) +作者简介:丁阳(1996 — )男，安徽合肥人，硕士研究生，主要从事小分子荧光探针对蛋白质尖性的检测与调控研究+通信作者:吴琼,副教授,E-mail : iamqwwi @njtech. edu. in ；李林，教授,E-mail : iamlli @njtech. edu. cno2安徽科技学院学报2021年1背景抗生素的诞生在现代医学发展史上具有里程碑的意义，也是最成功的药物之一+这些小分子化合物在感染性疾病的治疗中发挥着重要作用，挽救了数百万人的生命⑴+常用的抗生素包括'内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类和大环内酯类等2。

１ ３ 一 内酰胺 酶 。 四 、色 谱 法
五 、其他检测方法 免疫 生物 传 感器 。酶 传 感 器依 赖于 酶 高效 液 相 色谱 法是 目前 被广 泛 应 随 着 生 物 化 学 技 术 的 不 断 进 催 化 反应 的专 一 性 ，通过 检 测 反 的 用 的 一种 理化 检 测方 法 ，分 直接 法 和 步 ， １ ３一 内酰 胺 酶 的检 测 技 术 不 断 发 产 物或／ 和底 物 ，得 到抗生 素 的含量 。
接 判 断 牛奶 中是 否 有 １ ３一 内 酰胺 酶
ｍ 的是抗 生 素 的残 留。 为 了掩蔽抗 生 崔生 辉 等运用 此 原理 建 立 了该酶 的检 留。结 果 表 明 ，当酶 浓度 大 于３ ０ ｕ 索 的使用 ．一些 法分 子在 原料 乳 中 测 厅法 ，该 方法 在 牛奶 中的检 ｆ ｝ Ｊ 限 为 升时 ，可 以用 直接 碘 量法 埘其 进 行 添加 ６一内酰 胺 酶这 一物 质 ，以 降 解 ４ Ｕ ／ 毫升 （ Ｕ为酶 的活 力单位 ）。 性 分 析 ，Ｈ ｊ 间接滴 定 法对 其进 行 定 已使 ｆ ｝ Ｊ 的 抗 素 ，使 之 无 法 俭 出 。 陔 疗法 准确 灵敏 、应用 广 泛 ，但 分析 。
们生 活 中不 可或 缺 的天 然食 品 。高 品 青 霉 素作 为对 照 ，通 过 比对加 入 １ ３一 中规 定 的 检 测 １ ３ ～ 内酰胺 酶 活性 的 质 、无 污染 的牛 奶在 增 强 同民 身体素 内酰胺 酶抑 制剂 与 未加 入抑 制剂 的样 法 。 谢 岩 黎 等 采 用 碘 量 法 对 牛 奶 质 中起着 重 要作 埚 ： 当前 乳 及乳 制 品 品 所产 生 的抑制 圈 的大 小来 问接 测 定 的 Ｂ一 内酰 胺 酶 定 性 、定量 分析 ， 质量 安 全仍 存在 一 定问 题 ，其 中最 突 样 品 是 否 含有 Ｂ一 内 酰胺 酶 类 药 物 。

一、实验目的1. 了解内酰胺酶的生物学特性及活性测定方法。

2. 掌握内酰胺酶活性测定的实验操作步骤。

3. 通过实验，加深对内酰胺酶的认识，为相关研究提供实验依据。

二、实验原理内酰胺酶（β-内酰胺酶）是一种水解β-内酰胺类抗生素的酶，具有广谱的抗菌活性。

本实验采用比色法测定内酰胺酶活性，通过测定底物（如苯甲酰甘氨酰苯甲酸）水解产物的生成量来反映酶的活性。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌菌种、菌液、菌粉等。

2. 试剂：苯甲酰甘氨酰苯甲酸（Benzoyl-L-phenylalanyl-L-arginine, BAPNA）、N-乙酰-β-D-葡萄糖胺（N-Acetyl-β-D-glucosamine, NAG）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、盐酸、氢氧化钠等。

四、实验方法1. 制备菌悬液：将大肠杆菌菌种接种于LB培养基中，37℃培养过夜。

取适量菌液，用无菌生理盐水稀释至10^-5倍，备用。

2. 制备酶反应体系：取0.5 mL菌悬液，加入0.5 mL 50 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.0）、0.5 mL 0.5 mmol/L BAPNA底物溶液，混匀后立即于波长405 nm处测定吸光度。

3. 测定酶活性：每隔一定时间，重复测定吸光度，计算酶活性。

4. 数据处理：以酶活性对时间为坐标绘制曲线，求出酶的半衰期（t1/2）。

五、实验结果与分析1. 实验结果（1）酶活性随时间变化曲线（2）酶活性计算结果2. 实验分析（1）从酶活性随时间变化曲线可以看出，内酰胺酶活性在实验过程中呈先上升后下降的趋势，说明酶活性存在一定的时间依赖性。

（2）根据酶活性计算结果，得出酶的半衰期为30分钟，说明内酰胺酶的活性较高。

（3）与文献报道相比，本实验所得酶活性结果与其基本一致，表明实验操作规范，结果可靠。

六、实验结论1. 成功制备了内酰胺酶菌悬液，并测定了其活性。

2. 通过比色法测定内酰胺酶活性，验证了实验方法的可靠性。

紫外分光光度法检测金属β-内酰胺酶活性的研究沈祝飞;周冰;张加慧【摘要】目的建立以紫外分光光度法检测金属β-内酰胺酶活性的方法.方法采用以美罗培南作反应底物,中性羟胺与硫酸铁胺为显色体系,通过紫外分光光度计检测反应液中美罗培南剩余量计算金属β-内酰胺酶的分解量,从而计算出其酶活性.结果美罗培南的浓度在1～5mg/mL范围内,线性良好,相关系数大于0.999.该方法检测限为0.05U,回收率在90％～119％范围内,重复性相对标准偏差为6.1％～8.7％.检测出的酶活性与酶蛋白含量成正相关.结论该方法能有效区分金属β-内酰胺酶与非金属β-内酰胺酶,并准确反应金属β-内酰胺酶分解碳青霉烯类抗生素的能力.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2015(040)012【总页数】4页(P930-932,937)【关键词】金属β-内酰胺酶;羟胺法;美罗培南;酶活性【作者】沈祝飞;周冰;张加慧【作者单位】杭州北望生物技术有限公司,杭州310015;杭州北望生物技术有限公司,杭州310015;杭州北望生物技术有限公司,杭州310015【正文语种】中文【中图分类】R978.1+1《中国药典》(2010版)二部附录Ⅺ H无菌检查法规定的β-内酰胺类抗生素供试品处理方法中，要求用β-内酰胺酶来处理供试品，以便消除β-内酰胺类抗生素的抑菌性，排除其对无菌检查结果的影响，避免造成假阴性的判断。

金属β-内酰胺酶(metallo-β-lactamase，MBL)是β-内酰胺酶的一种，它可以特异性水解碳青霉烯类的β-内酰胺类抗生素，主要用于β-内酰胺类抗生素无菌检查用供试品的中和剂，尤其是碳青霉烯类抗生素的专属中和剂。

目前，《中国药典》(2010年版)中只规定了β-内酰胺酶中的青霉素酶活性检测的碘滴定法，并没有针对MBL酶活性检测的方法。

碘滴定法所用的底物是青霉素，不能真实反映MBL酶分解碳青霉烯类抗生素的活性。

本文以美罗培南作反应底物，美罗培南可快速与中性羟胺反应，生成羟肟酸，然后与硫酸铁胺形成水溶性内络盐而显红色，在515nm处有最大吸收峰，反应原理如图1[1-2]。

一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法
1. 凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法是一种用于测量细菌中β-内酰胺酶酶活性的方法，它可以通过测量底物的降解速率来确定酶的活力。

2. 酶活力定量检测方法最常用的底物是含有β-内酰胺环的化合物，例如酶对其进行水解产生胺类产物。

许多酶活性检测方法使用人工合成的底物，例如酚红，其水解生成的胺类产物可以通过吸光度测量来确定酶活力。

3. 该方法的原理是，在凝胶培养基中，添加一定浓度的底物，并培养一段特定的时间，然后通过测量培养基中胺类产物的浓度变化来获得酶的活力。

4. 实验首先制备含有合适浓度底物的凝胶培养基样品，并将其分配到培养皿中。

然后将待测的菌株接种于培养皿中，并在一定温度下培养。

5. 在培养一定时间后，可以使用薄层层析法将培养基中的胺类产物与底物分离。

通过比较样品与标准品在层析板上的迁移距离，可以确定胺类产物的浓度。

6. 利用分光光度计测量胺类产物的吸光度，通过构建标准曲线，可以得到吸光度与胺类产物浓度的线性关系。

然后根据酶水解底物产生的胺类产物的浓度变化来确定酶活力。

7. 在进行实验时，需注意控制培养温度、培养时间和培养基pH等因素，以确保实验结果的可靠性。

8. 该方法相比其他方法具有较高的灵敏度和准确性，用于研究β-内酰胺酶的特性和抗生素抗性机制具有重要意义。

9. 在实际应用中，该方法可以用于筛选抗生素敏感性菌株和评估β-内酰胺酶抗性的传播情况。

10. 酶活力定量检测方法在药物研发和临床药物监测中具有广泛的应用前景，有助于指导临床用药和制定治疗方案。

-内酰胺酶的检测方法
内酰胺酶是一种酶，在细胞中起着重要的生物催化作用。

内酰胺酶的功能与细胞的代谢、信号调节和细胞凋亡等过程密切相关。

因此，对于内酰胺酶的检测方法具有很大的研究意义。

常用的内酰胺酶检测方法包括：
1. 活性测定法：通过测定内酰胺酶的催化活性来确定其含量，常用的测定方法有亚甲蓝法、苏丹Ⅲ法和三氯乙酸法等。

这些方法通过观察酶催化产生的颜色、光谱或其他物理性质的变化，来间接或直接测定内酰胺酶的活性。

2. 免疫测定法：利用特异性抗体与内酰胺酶结合来检测其含量。

包括免疫沉淀法、免疫层析法、免疫荧光法和酶联免疫吸附测定法等。

3. 基因表达测定法：通过检测内酰胺酶的编码基因的转录水平和翻译水平来推测其含量。

常用的方法包括实时荧光定量PCR、Northern blotting和Western blotting等。

4. 代谢产物分析法：通过分析内酰胺酶代谢产物的含量来间接推测其活性和含量。

例如利用质谱分析法测定内酰胺酶代谢产物的质谱图谱，从而推测其含量和活性。

综上所述，对于内酰胺酶的检测可以采用活性测定法、免疫测定法、基因表达测定法和代谢产物分析法等不同方法，根据研究的目的和要求选择合适的方法进行检测。

外源性β-内酰胺酶是我国不允许在食品中使用的化学物质。

违法使用的目的，是为了掩盖违规使用大环内脂类等抗生素治疗奶牛疾病的行为。

但是，内源性β-内酰胺酶的产生机理也是科学研究基本确认的事实。

近几十年来，国际国内畜牧业养殖奶牛过程中无限制使用大环内脂类抗生素治疗动物、家禽等食用动物各种炎症、败血症、水肿病等病症，造成革兰氏阳性细菌对抗生素耐药，细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性一般通过4种途径。

（1）产生β-内酰胺酶使β-内酰胺类抗生素开环失活，这是产生耐药的主要原因。

目前发现的β-内酰胺酶已超过300种，它通过与β-内酰胺环上的羰基共价结合，水解酰胺键从而使β-内酰胺类抗生素开环而失活。

（2）改变抗生素与青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）的亲和力。

当β-内酰胺类抗生素与PBP结合后，PBP就会失去酶活性，使细菌细胞壁的形成部位破损而引起溶菌，反之，则成为耐药菌。

PBP基因的变异，使β-内酰胺类抗生素无法与之结合或结合能力降低，这是形成耐药的根本原因。

（3）细胞膜和细胞壁的结构发生改变，使药物难以进入细菌内。

如生物膜的形成。

（4）细菌体内的能力依赖性主动转运机制，将已进入细菌内的抗生素泵出体外，也可导致耐药性。

由于细菌耐药产生的内源性β-内酰胺酶有300多种，同外源性β-内酰胺酶的分别鉴定检测技术尚未见报道。

而目前各检测机构正在研究的乳制品中β-内酰胺酶的检测方法无论是化学仪器分析高效液相色谱法还是微生物法，其检测原理都是：测出的β-内酰胺酶无法判定是人为添加的或是耐药细菌产生的。

奶制品中检出的β-内酰胺酶有可能是非法添加的，也有可能是细菌产生的。

耐药性产生的机理很复杂，细菌耐药基因的转移、共生菌协同以及基因交叉耐受，等影响都要考虑。

另外，根据现有的国际食源性抗生素耐药微生物的风险管理原则，建议加强畜牧业奶业生产全过程，而终产品的β-内酰胺酶检测始终是一个辅助手段，凭检测结果很难处理。

β-内酰胺酶及其活力测定法培养基胨15g甘油50g氯化钠4g0.1％硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶液0.5ml枸橼酸钠5.88g20％硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶液1ml磷酸氢二钾4g肉浸液1000ml混合上述成分，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，分装于500ml锥形瓶内,每瓶80ml,在115℃灭菌30分钟。

酶溶液的制备取蜡样芽孢杆菌［Bacillus cereus CMCC(B)63301］的斜面培养物,接种至上述一瓶培养基内,在25℃摇床培养18小时后，取此培养物接种至其余各瓶培养基内，每瓶接种10ml，同时每瓶加入无菌青霉素4500单位，在25℃摇床培养24小时，再加无菌青霉素2万单位，继续培养24小时，再加无菌青霉素2万单位,继续培养24小时,离心沉淀菌体，调pH值至约8.5,用滤柱滤过除菌，滤液用无菌操作调pH值至近中性后，分装于适宜容器内，在10℃以下贮存，备用。

酶活力测定法青霉素溶液称取青霉素钠（钾）适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。

青霉素酶稀释液取青霉素酶溶液，按估计单位用磷酸盐缓冲液(pH7.0) 稀释成每1ml中约含青霉素酶8000～12 000单位的溶液，在37℃预热。

测定法精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中，预热至37℃后，精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml，迅速混匀，在37℃准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.01mol/L)［精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度］25ml中,在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L) 滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。

空白试验取已预热的青霉素溶液2ml，在37℃放置1小时，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加青霉素酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。

色谱法
高效液相色谱法
利用高效液相色谱技术分离和检测β内酰胺酶，通过检测色谱图中的峰形 和峰高，确定β-内酰胺酶的浓度。
气相色谱法
利用气相色谱技术分离和检测β-内酰 胺酶，通过检测色谱图中的峰形和峰 高，确定β-内酰胺酶的浓度。
免疫学检测法
酶联免疫吸附试验
利用特异性抗体与β-内酰胺酶结合，通过酶标仪检测发光强度， 从而确定β-内酰胺酶的浓度。
按照水解底物分类
TEM型
能水解青霉素类和头孢菌素类抗生素。
SHV型
主要水解头孢菌素类抗生素。
AmpC型
能水解所有β-内酰胺类抗生素。
OXA型
对所有β-内酰胺类抗生素的水解活性 较低，但对碳青霉烯类抗生素的水解 活性较高。
按照结构分类
Class A
Class B
属于丝氨酸酶，由一条多肽链组成，含有 活性位点Ser-Thr-Gly。
放射免疫分析法
利用放射性同位素标记β-内酰胺酶，通过检测放射性强度，从 而确定β-内酰胺酶的浓度。
03
β-内酰胺酶的检测标准
检测标准制定机构
美国临床和实验室标准协会（CLSI）
01
CLSI是全球知名的临床实验室标准制定机构，制定了一系列β-
内酰胺酶检测标准，为全球实验室提供指导和参考。
欧洲药典委员会（EDQM）
β-内酰胺酶的分类及检测
• β-内酰胺酶的分类 • β-内酰胺酶的检测方法 • β-内酰胺酶的检测标准 • β-内酰胺酶的检测现状与展望
01
β-内酰胺酶的分类
按照来源分类

微生物来源
由细菌、真菌等微生物产生的β-内酰胺酶。
动物来源
某些动物体内也存在的β-内酰胺酶，如某些 鱼类。

β-内酰胺酶β-内酰胺酶介绍：β-内酰胺酶是指能催化水解生物分子中β -内酰胺环中的的酰胺键的灭活酶。

细菌产生β- 内酰胺酶是细菌对β -内酰胺类抗生素耐药的主要机制。

β- 内酰胺酶类抗生素包括青霉素类 ,头孢菌素类 ,非典型β- 内酰胺类等 ,是品种最多 ,研究进展最快 ,临床应用最广泛的一大类药物。

β-内酰胺酶正常值：体内菌群的种类和比例正常，人体处于动态平衡。

β-内酰胺酶临床意义：细菌耐药性的机制：1. 灭活酶――主要为β 内酰胺酶 (2 0 0多种) ,使抗生素失效。

2. 靶位改变――与抗生素结合靶位的改变 ,使抗生素作用下降。

3.细菌膜通透性的改变――使抗生素不能或很少进入细菌体内到达作用靶位。

细菌耐药性的发展从医院内菌株(如肠杆菌科、金黄色葡萄球菌)到医院外菌株(如肺炎链球菌、化脓性链球菌、淋球菌)，其耐药性从对单种药物耐药发展至多重耐药，例如金黄色葡萄球菌对青霉素耐药;ESBL菌株对多种常用抗生素耐药。

异常结果：肠杆菌科、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、淋球菌等感染但是用抗生素无效或者效果不明显，细菌产生耐药性。

需要检查的人群：有上述情况的患者β-内酰胺酶注意事项：不合宜人群：没有检查前禁忌：注意正常的生活饮食习惯，注意个人卫生。

检查时要求：积极配合医生β-内酰胺酶检查过程：β-内酰胺酶的检测临床标本中分离金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌以及最近发现的肠球菌属少数菌株对青霉素、氨苄青霉素出现耐药。

由于上述菌株产生β-内酰胺酶水解前述抗生素。

检测该酶有下列方法：(一)微生物活性消失法此法是以一株对青霉素高度敏感的枯草芽胞杆菌的指示菌，如待检菌株产生β内酰胺酶，破坏了青霉素，则在划线两边有枯草芽胞菌生长，否则指示菌仍呈很大抑菌环。

(二)淀粉-碘测定法β内酰胺酶破坏β内酰胺环，碘与被打开β内酰胺环结合，使蓝色的淀粉-碘复合物转变成无色。

方法：用pH6.0磷酸缓冲液配制青霉素悬液6000μg/ml，取该液0.1 ml置于微量稀释板凹孔中，挑选检测菌株数个菌落混悬于其中，摇动30min，静置室温中1h，加淀粉液2滴，再加碘液1滴，混合，立即观察颜色变化，阳性者当加入碘液后，首先立即出现蓝色、如在10min内消失蓝色，提示该菌产生β-内酰胺酶。

牛奶中β-内酰胺酶的检测在老板姓认识“三聚氰胺”这个此后，老板姓又认识到了一个新词—β-内酰胺酶。

β-内酰胺酶是一种细菌所特有的分解抗生素的酶，牛奶中检测出β-内酰胺酶有可能是奶牛体内自身产生的，也有可能是牛奶在加工过程中感染了一些细菌所产生的。

另一种可能就是在加工过程中，人为加入β-内酰胺酶，因为它能分解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素，为抗生素打掩护。

β-内酰胺酶的检测方法-杯碟法1 原理该方法采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株，利用舒巴坦特异性抑制β-内酰胺酶的活性，并加入青霉素作为对照，通过比对加入β-内酰胺酶抑制剂与未加入抑制剂的样品所产生的抑制圈的大小来间接测定样品是否含有β-内酰胺酶类药物。

2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 β-内酰胺酶检测仪2.2恒温培养箱：36℃±1℃。

2.3 高压灭菌器。

2.4 无菌培养皿:内径90 mm，底部平整光滑的玻璃皿，具陶瓦盖。

2.5 无菌牛津杯：外径(8.0士0.1) mm，内径(6.0士0.1) mm，高度(10.0士0.1) mm。

2.6 麦氏比浊仪或标准比浊管。

2.7 pH计。

2.8 无菌吸管：1mL（0.01mL刻度值），10mL（0.1mL刻度值）。

2.9 加样器:5μL～20μL，20μL -200μL及配套吸头。

3.操作步骤3.1 菌悬液的制备将藤黄微球菌接种于营养琼脂斜面上，经36士1℃培养18h-24 h，用生理盐水洗下菌苔即为菌悬液，测定菌悬液浓度，终浓度应大于1×1010 CFU/mL，4 ℃保存，贮存期限2周。

3.2 样品的制备将待检样品充分混匀，取1 mL待检样品于1.5 mL离心管中共4管，分别标为：A、B、C、D，每个样品做三个平行，共12 管，同时每次检验应取纯水1 mL加入到1.5 mL离心管中作为对照。

如样品为乳粉，则将乳粉按1:10的比例稀释。

如样品为酸性乳制品，应调节pH值至6-7。

Bush-J-M分类策略 3组金属酶 头孢菌素酶 1组 酶EDTA 2e组 2a组 2d组 青霉素 酶 2c 组 2f组 非金属酶 4 组 2be 组 广谱酶 2b 2br组
表2 β-内酰胺酶的结构和功能分类 分子结构 功能 举例 最适底物 抑制剂 (Ambler) (Bush) PEN CARB OX CR CTX ATM IPM CLAV CLOX EDTA 丝氨酸酶 A 2a PC1，LEN-1 卅 十 － 土 － － － 卄 － － 2b SHV-1,TEM-1 卅 十 十 卄 － － － 卄 － － 2be K1,TEM-3, 卅 十 十 卄 卄 卄 － 卄 － － SHV-2,PER-1 2br TEM-31 卅 十 十 十 － － － － － － 2C PSE-1,BRO-1 卄 卅 十 十 － － － 十 － － 2e 卄 卄 － 卄 卄 卄 － 卄 － － 2f Sme-1,NMC-A 卄 十 ? 十 十 卄 卄 十 － － IMI-1 C 1 AmpC 卄 十 － 卅 十 － － － 卄 － D 2d OXA-1 卄 十 卅 十 － － － V － － 未定 4 AVS-1 卄 卄 卄 V V － － － － － 金属酶 B 3 IMP-1 卄 卄 卄 卄 卄 － 卄 － － 卄 嗜麦芽L-1
A类β-内酰胺酶 1。 A类β-内酰胺酶： 广谱酶2b组
A
B
A 大肠埃希菌TEM-1型酶结构 ；B 肺炎克雷伯菌的SHV-1型酶结构
超广谱β-内酰胺酶(2be) 经典超广谱β-内酰胺酶 TEM型ESBLs SHV型ESBLs SHV-2型ESBLs 、SHV-5 型ESBLs SHVΩ环突变型ESBLs 其他超广谱β-内酰胺酶 CTX-M-型酶 可为分4个小组 PER-1及其相关ESBL PER-1、-2 、VEB-1、2 CME-1 TLA-1 特殊的非典型ESBL SFO-1 、GES-1

果 判 定 。当试剂盒 的按 钮 向下 、 左边 的斑 点 比右边 的
钟 。将 试纸 条 编号 ， 依 次插 入 到微 孔 试剂 中 ， ４ ０ １ ２ 孵
育 ３分钟 后 ， 仔 细 观察 试 纸条 判定 线 的颜 色 ， 并 根 据 其 深浅 程 度判定 结果 。
斑点 浅 时 ， 判 定 Ｂ一内酰胺 酶为 阴性 ， 如 果左 边 的 颜
加热 器 上 ， 孵育 ２ ０分钟 ， 室温 冷却 ｌ ０分 钟 。用 配 套 的 塑料 刻 度 吸管从 西 林 瓶 中吸 取 至 刻度 线 的试 液 ，
置于 显色 剂塑料 试 管 中摇 匀 。之后 在 ４ ５ ｃ ｃ的加 热 器 上加 热 ５ ． ０ ０分钟 ，同时 将双 流 向试剂 盒置 于加 热 器 上温 热 。将 塑料 试 管 中 的液 体全 部倒 入 双 流 向 试剂 盒 的样 品 口上 ，当 试剂 盒 观察 窗 内 的蓝 色斑 点 消 失
一
胺类抗生素及其保护剂。微孔试剂 ， 含有青霉素特异 性 配体 蛋 白质及 显色剂 。试 纸条 ， 包被 有 Ｂ一内酰胺
类抗 生 素 。
打 开 试剂 盒 之前 应 先将 其 恢 复至 室 温 ，避 免有
冷凝 水 产生 而受 潮 。 取 经检测 为无 抗 （ 抗 生素检 测 为
阴性 ） 的生 鲜 牛乳 样 品 ， 恢 复 至室 温 ， 充 分 混 匀后 作 为待 测样 品备 用 。移 取 ４ ０ ０微 升 的待测 样 品至抗 生 素试剂瓶 中， 混匀 ， 在 ４ ０ ２的加 热 器 上 ， １ 孵育 ４ ５分
和符合 规定 的三 级水 。 所用 试剂均 应保 存在 ２ － ８ 的 干燥环 境 中。西林 瓶 ， 含有 一定 量 的 Ｂ一内酰胺 类抗 生素 。双流 向竞 争性 酶 联免疫 吸 附试剂 盒 ， 包 括塑 料 刻度 吸管 、 显 色剂 塑料 试管 和 双流 向试剂盒 。