大鼠心肌微血管内皮细胞的体外培养

大鼠胰岛微血管内皮细胞分离、纯化与培养的改进孙嘉;张桦;蔡德鸿【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2008(024)007【摘要】目的:建立稳定可靠的大鼠胰岛微血管内皮细胞分离培养方法.方法:分离纯化大鼠胰岛后进行内皮细胞选择性培养,使用UEA-1包被的免疫磁珠对胰岛微血管内皮细胞进行纯化.免疫荧光法检测经典的内皮细胞标志物第Ⅷ因子相关抗原(vWF)和cD34的表达和吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)能力.结果:胰岛培养4-5 d后,可见内皮细胞从贴壁的胰岛内爬出,通过UEA-1包被的免疫磁珠筛选出胰岛微血管内皮细胞接种后24 h细胞开始贴壁.该细胞具有单层生长、接触抑制的特性.大鼠胰岛微血管内皮细胞表达vWF和CD34,可摄取Dil-Ac-LDL.结论:本研究方法是一种较为高效的分离、纯化和培养大鼠胰岛微血管内皮细胞的方法.【总页数】3页(P1454-1456)【作者】孙嘉;张桦;蔡德鸿【作者单位】南方医科大学附属珠江医院内分泌科,广东,广州,510282;南方医科大学附属珠江医院内分泌科,广东,广州,510282;南方医科大学附属珠江医院内分泌科,广东,广州,510282【正文语种】中文【中图分类】R335+.6【相关文献】1.大鼠胰岛分离纯化方法的改进 [J], 杨永生;孙宝震;解英俊;赵吉生;王春艳;张学文;李巍2.原代大鼠胰岛细胞分离纯化及单细胞培养初探 [J], 罗瑞琼;韦芳;荣曦;刘红3.大鼠胰岛分离纯化技术的改进 [J], 李永翔;李戈;董维平;陈静;卢大儒;谭建明4.大鼠肺微血管内皮细胞的体外分离培养与纯化 [J], 梁宏伟;冯波;朱雯宇;王建舫;张涛;穆祥5.大鼠胰岛的分离纯化方法改进与功能鉴定 [J], 袁宇;丛聪;张静;魏玲玲;李胜富;金熙;麦刚;李幼平;程惊秋;陆燕蓉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

生和发展都是以内皮细胞受损为基础，肺微血管内皮细胞在病理条件下，不仅是炎症反应的主要靶细胞，更是活跃的炎症细胞和效应细胞。

其功能和结构的完整性对于维持正常肺功能至关重要，这种特殊的细胞类型是研究肺功能不全及许多肺部疾病发生机制的理想细胞模型来源[4]。

近年，从生物化学、细胞生物学及分子生物学等方面探究内皮细胞生理功能的研究课题日益增多，有助于更全面认识PMVECs并了解其相关机制，进而可对相关疾病进行预防和治疗[5]。

近20年，国内外对PMVECs的研究取得众多成果，但其养困难、成本高、重复性差、易污染等问题，降低了培养成功率，因此建立完整高效的PMVECs培养方法意义重大。

本文总结了PMVECs培养的一般方法，具体流程，见图1。

图1 皮细胞培养一般流程1 肺微血管内皮细胞培养法1.1 原代培养肺微血管内皮细胞原代培养是指从活体生物中将肺组织取下进行培养，在完成首次传代培养之前的细胞都称为原代培养[6]。

国内外研究报道的肺微血管内皮细胞的方法主要有2种，一是组织块贴壁法[7-10]，二是酶消化法[11]。

2种方法各有利弊，组织块法操作简单、细胞成活率高、成本低、可减少因酶消化造成的细胞损伤，但是细胞迁出时间不好把握且组织块去除不彻底会造成其他杂细胞污染等。

酶消化法培养周期快、细胞生长速率快，但是消化时间和酶浓度不好控制，细胞成活率可能会因为消化时间过长受到影响。

1.1.1 组织块贴壁法组织块贴壁法是指将取自活体生物的组织，在无菌条件下剪成1×1×1 mm3小块，平铺在培养器皿中，加入含胎牛血清的培养基在37 ℃5%CO2条件下培养的方法。

组织块贴壁法的一般操作步骤：先去除组织胸膜，将去除胸膜的肺组织剪下1～3 mm左右的肺组织边缘，切成1×1×1 cm3组织块，用基础培养基DMEM清洗多次，至少3次，均匀地贴在25 cm2的培养瓶中，放入5% CO2 37 ℃的培养箱中培养1 h，等组织块贴壁后，加入完全培养基DMEM（20%FBS、ECGS、肝素钠、双抗等），放入培养箱中16 h以上，去除未贴壁的组织块，加入新的培养基，以后每2～3 d更换1次培养基。

大鼠视网膜微血管内皮细胞的分离培养及血管形成体系的建立【摘要】目的应用Matrigel建立大鼠视网膜微血管内皮细胞(Retinal Microvascular Endothelial Cells， RMECs)血管形成的体外培养体系，为进一步探讨视网膜相关疾病提供实验基础。

方法体外培养RMECs，在Matrigel上建立血管形成的体外培养体系。

结果经分离培养的RMECs在 Matrigel上培养形成管腔样结构。

结论 RMECs能够在Matrigel上形成血管腔。

【关键词】视网膜微血管内皮细胞;细胞培养;血管形成Abstract: Objective To induce Rat Retinal Microvascular Endothelial Cells (RMECs) to Form New Blood Vessels by setting up a stable angiogenesis culture system on Matrigel. It would be a basic experimental study for the retinal-related disease. Methods By culturing RMECs in vitro and setting up a stable angiogenesis culture system on Matrigel. Results RMECs were lumina formation on Matrigel. Conclusions RMECs can be induced to form mew blood vessels on Matrigel in vitro.Key words: Retinal Microvascular，Endothelial Cells; cell culture; angiogenesis血管内皮细胞密切参与糖尿病微血管病变和肿瘤血管新生等病理过程[1，2]。

原代大鼠脑微血管内皮细胞的培养及鉴定马华根;唐元瑜;纪立金【摘要】目的:建立一种纯度较高的原代大鼠脑微血管内皮细胞的分离培养方法.方法:取7～10日龄SD大鼠脑组织,经匀浆,牛血清白蛋白密度梯度离心,Ⅱ型胶原酶消化获得脑微血管段后,置于CO2培养箱中进行原代培养.通过细胞形态学观察、第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色鉴定所培养的细胞.结果:在倒置显微镜下,体外培养24～48 h后,细胞从贴壁的脑微血管段周围爬出,单个细胞为短梭形或多角形,呈团簇状单层贴壁生长,待细胞密集融合后,则成典型的“铺路石样”涡旋状排列;Ⅷ因子免疫细胞化学染色检测,相关抗原表达为阳性,细胞胞质显棕黄色,阳性细胞率达99％以上.结论:该方法能够成功分离培养出原代大鼠脑微血管内皮细胞.%Objective:To establish a method that can successfully separate and cultivate microvascular endothelial cells of rat brains in vitro.Methods:The microvascular segments of the rat brain were obtained from 7 to 10 d SD rats by homogenation,bovine serum albumin gradient centrifugation and digestion with collagenase type Ⅱ and then they were cultured in carbon dioxide incubator.The cultured cells were identified by cell morphology observation and immunohistochemical detection of Ⅷ factor-related antigen.Results:Under the inverted microscope,the cells in vitro cultured for 24 h to 48 h,emerged from the microvascular section of the wall.The cells were fusiform-shaped or polygonal-shaped,and proliferated in a clustered monolayer.The typical "paving pebbles" sample was observed after the cells became dense.The correlation antigen of Ⅷ factor was positive,the cytoplasm was brown,and the positive cells accounted formore than 99％.Conclusion:The method can successfully separate and cultivate microvascular endothelial cells of rat brains in vitro.【期刊名称】《解剖学杂志》【年(卷),期】2018(041)003【总页数】4页(P276-279)【关键词】脑;微血管内皮细胞;原代培养;Ⅷ因子相关抗原;大鼠【作者】马华根;唐元瑜;纪立金【作者单位】福建中医药大学中医学院,福州350122;福建中医药大学中医学院中医基础理论教研室,福州350122;福建中医药大学中医学院中医基础理论教研室,福州350122【正文语种】中文脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)是构成血脑屏障的主要成分之一,它能通过选择性双向跨细胞膜转运系统及细胞间的紧密连接将脑组织与体循环分隔开,限制蛋白质和大多数极性分子进入脑组织,只有少部分蛋白质和多肽能以转胞吞方式通过血脑屏障进入血液[1];并且BMECs在脑的物质代谢、纤溶与止血、免疫应答等方面也发挥着重要作用,与脑水肿、脑血管疾病的发生发展、脑肿瘤的浸润和扩散,尤其是脑肿瘤的血管生成等病理过程密切相关[2-3]。

大鼠肺微血管内皮细胞编号名称规格北京派瑞金GK1001大鼠肺微血管内皮细胞5×105cells/瓶为能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。

派瑞金提供的大鼠肺微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。

研发的大鼠肺微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。

同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。

大鼠肺微血管内皮细胞简介：1、名称：大鼠肺微血管内皮细胞2、组织来源：大鼠肺血管组织3、规格：5×105cells/25cm2培养瓶4、细胞简介：大鼠肺微血管内皮细胞分离自正常大鼠肺血管组织，血管内皮细胞密切参与包括再生、发育、伤口愈合等一系列生理及炎症反应。

细胞呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列。

肺微血管内皮细胞构成半选择性屏障，该屏障对于肺气体交换，调节液体和可溶物在血液与肺间质之间的流动具有重要意义。

本公司生产的大鼠肺微血管内皮细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度75%~85%，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

5、培养基信息：1）培养基类型：1640培养基(GIBCO，添加NaHCO31.5g/L，Sodium Pyruvate0.11g/L) 2）添加因子：优质胎牛血清10%，细胞生长因子等大鼠肺微血管内皮细胞使用方法：收到细胞后，请按照以下方法进行操作。

1.取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。

2.待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。

大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定*谢　崧　杨晓静　钱桂生　王关嵩(第三军医大学新桥医院,　重庆　630037)摘要　取大鼠周边肺组织进行肺微血管内皮细胞培养。

将肺组织切成小块,用含有20%新生牛血清、肝素90L g/ ml、L-谷胺酰胺4mmol、青霉素100U/ml和链霉素100L g/m l的R PM I-1640培养基培养。

血细胞立即从肺组织周围游出。

继而是肺微血管内皮细胞。

成纤维细胞及其他细胞72h才游出。

培养60h后取出肺组织块,培养瓶中只有微血管内皮细胞和血细胞。

后者可通过传代除去。

获得的肺微血管内皮细胞具有规律的鹅卵石样形态和对异植物血凝素结合试验及八因子相关抗原免疫荧光染色均阳性。

关键词　大鼠　肺循环　微循环　内皮细胞　细胞培养　肺微血管在生理和病理情况下都起着重要作用,如与成人呼吸窘迫综合征、肺动脉高压[1]等的发生有关。

目前仅限于肺动脉内皮细胞的研究,而肺微血管和大血管之间据文献报道在表型和功能有着显著的不同[2]。

故有培养和研究肺微血管内皮细胞的必要。

虽然肺有大量的血管内皮细胞,但同时存在40多种类型的细胞尤其成纤维细胞和平滑肌等细胞的迅速生长,使内皮细胞生长受抑制。

分离和培养纯的肺微血管内皮细胞较为困难。

国内未见肺微血管内皮细胞培养的报道。

本文采用简单的方法成功地分离和培养出大鼠肺微血管内皮细胞。

1　材料和方法1.1　主要试剂　RPM I-1640培养基为美国Gibco 公司产品。

新生牛血清由华西医科大学公共卫生学院生产。

兔抗人八因子相关抗原抗血清为DAKO公司产品,华美分装。

荧光标记异植物血凝素为Sigm a 公司产品。

荧光标记羊抗兔1gG由卫生部上海生物制品研究所生产。

抗菌素为青霉素钠盐和硫酸链霉素。

L-谷氨酰胺为第二军医大学分装。

胰蛋白酶和肝素钠均为上海生化试剂商店提供。

大鼠肺动脉内皮细胞按本研究所建立的方法[3]培养。

1.2　取材　选重200-300g健康雄性Wistar大鼠,10%乌拉坦(10L l/mg)腹腔麻醉。

大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养
陈小菊
【期刊名称】《川北医学院学报》
【年(卷),期】2008(023)005
【摘要】目的探讨一种分离和培养大鼠肺微血管内皮细胞(LMVEC)的简单方法. 方法组织贴块法培养大鼠LMVEC,倒置显微镜下观察细胞的形态和生长特性,并采用免疫组化方法进行鉴定.结果获得的LMVEC具有规律的铺路石镶嵌状排列,内皮细胞特异性抗体CD31免疫组化染色阳性. 结论组织贴块法培养LMVEC是简单可行的.
【总页数】3页(P458-460)
【作者】陈小菊
【作者单位】川北医学院附属医院呼吸内科,四川,南充,63700
【正文语种】中文
【中图分类】R322.3+5
【相关文献】
1.肺循环灌注对大鼠肺微血管内皮细胞分离和培养的影响 [J], 肖贞良;孙耕耘;钱桂生
2.小鼠肺微血管内皮细胞磁珠分选法分离和原代培养 [J], 孙振朕;蔡在龙;朱科明;邓小明
3.大鼠肺微血管内皮细胞的体外分离培养与纯化 [J], 梁宏伟;冯波;朱雯宇;王建舫;张涛;穆祥
4.不同酶消化液对大鼠肺微血管内皮细胞分离培养的影响 [J], 李佩珊; 张志欢; 孙雄; 吴显平; 张永红; 张涛
5.大鼠肺微血管内皮细胞培养方法研究进展 [J], 白祥慧;邹登朗;祁得胜;刘忠浩;马建滨;都玉蓉
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㊃论 著㊃D O I :10.3760/c m a .j.i s s n .1673-436X.2018.05.008作者单位:050000石家庄,河北医科大学第三医院呼吸二科(张鑫红㊁田凤军㊁陈海利㊁徐迎春),重症医学科(王智勇);050000石家庄,河北医科大学病理生理教研室(黄新莉)通信作者:田凤军,E m a i l :185********@163.c o m改良大鼠肺微血管内皮细胞原代培养技术及鉴定张鑫红 田凤军 陈海利 徐迎春 王智勇 黄新莉ʌ摘要ɔ 目的 改良大鼠肺微血管内皮细胞(P MV E C s)原代培养方法,并对所培养的P MV E C s 进行鉴定㊂方法 组织贴块法培养P MV E C s ,从动物的选取㊁肺灌注㊁细胞漂洗次数及试剂温度等方面进行了改良㊂免疫组织化学鉴定P MV E C s ㊂结果 原代培养的P MV E C s 呈典型的铺路石样生长㊂免疫组织化学显示Ⅷ因子及血管性血友病因子表达阳性㊂结论 经改良后培养P MV E C s ,细胞培养的重复性高且生长状态好㊂ʌ关键词ɔ 肺微血管内皮细胞;原代培养;细胞培养I m p r o v e m e n t o fm e t h o d p r i m a r y c u l t u r e a n d i d e n t i f i c a t i o n o f r a t p u l m o n a r y mi c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s Z h a n g X i n h o n g *,T i a nF e n g j u n ,C h e n H a i l i ,X uY i n g c h u n ,W a n g Z h i y o n g ,H u a n g Xi n l i .*T h e S e c o n d D e p a r t m e n t o f R e s p i r a t o r y M e d i c i n e ,t h eT h i r d H o s p i t a l o f H e b e iM e d i c a lU n i v e r s i t y ,S h i j i a z h u a n g 050000,C h i n aC o r r e s p o n d i n g a u t h o r :T i a nF e n g ju n ,E m a i l :185********@163.c o m ʌA b s t r a c t ɔ O b je c t i v e T o i m p r o v e t h e m e t h o d of p r i m a r y c u l t i v a t i o n o f r a t p u l m o n a r y m i c r o v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s (P MV E C s ),a n di d e n t i f y t h e p r i m a r y cu l t i v a t e d P MV E C s .M e t h o d s T i s s u eb l o c ka d h e r i n g w a l l m e t h o d w a su s e dt oc u l t i v a t e P MV E C s .P r i m a r y cu l t i v a t i o n m e t h o d w a s i m p r o v e d f r o mt h e p r o c e d u r e so fa n i m a l s e l e c t i o n ,p u l m o n a r yp e r f u s i o n ,t h en u m b e ro fc e l l sr i n s e sa n d t e m p e r a t u r e o f r e a g e n t sa n ds oo n .I mm u n o h i s t o c h e m i c a l o b s e r b a t i o nP MV E C s .R e s u l t s T h eP MV E C s w e r ee x h i b i t e d a s p o l y g o n .I mm u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g r e v e a l e d t h a t e x pr e s s i o n o f Ⅷa n d v o n w i l l e b r a n d f a c t o rw a s p o s i t i v e .C o n c l u s i o n s A f t e r t h e i m p r o v e d m e t h o do fP MV E C s ,t h e r e p r o d u c i b i l i t yo f c e l l c u l t u r e i sh i gha n d t h e g r o w t hs t a t u s i s g o o d .ʌK e y wo r d s ɔ P u l m o n a r y m i c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s ;P r i m a r y c u l t u r e ;C e l l s c u l t u r e 肺微血管内皮细胞(p u l m o n a r y mi c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s ,P MV E C s )在A R D S 等多种肺部疾病中是最早激活的效应细胞[1]㊂因此,体外培养P MV E C s 构建实验模型,对深入研究肺部不同疾病的发病机制具有重要意义㊂虽然国内外已有许多研究报道P MV E C s 原代培养和鉴定方法[2-3],但P MV E C s 的原代培养成功率仍然低,重复性差㊂本研究尝试对P MV E C s 培养过程中技术细节部分的改良,探索简单易行的实验方法,改善P MV E C s 原代培养的重复性及细胞的稳定性㊂1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物 S D 幼年大鼠,雌雄均可,体质量40~50g ,购自河北医科大学动物实验中心㊂实验过程中对动物的处理符合‘关于善待实验动物的指导意见“等相关要求㊂1.1.2 主要试剂 D M E M /F -12培养液㊁双抗液㊁牛血清白蛋白㊁P B S 缓冲液及2.5g /L 胰蛋白酶-E D T A 均购自美国G i b c o 公司,胎牛血清购自P A N 公司,4%多聚甲醛及聚乙二醇辛基苯基醚(T r i t o n X -100)购自索莱宝公司,兔抗大鼠Ⅷ因子相关多克隆抗体及兔抗大鼠血管性血友病因子(v o nw i l l e b r a n d f a c t o r,VW F )相关多克隆抗体购自武汉博士德公司,免疫组织化学二抗试剂盒购自北京中杉金桥公司,底面积25c m 2细胞培养瓶㊁35mm 细胞培养皿购自美国C o r n i n g 公司㊂1.1.3 主要设备 倒置荧光显微镜㊁含体积分数5%C O2细胞培养箱㊁超净台㊁低温离心机均购自美国T h e r m o公司㊂1.2细胞培养1.2.1原代培养大鼠2只,肝素钠㊁水合氯醛腹腔注射给药㊂麻醉成功后大鼠消毒3次,固定于超净台内㊂暴露心㊁肺,灌洗肺叶至发白㊂剪取肺组织,置于4ħP B S中漂洗㊂4ħ培养基中剪取边缘肺组织,约为(1mmˑ1mmˑ1mm)大小㊂将组织块均匀接种到细胞培养瓶中,吸去瓶中的全部培养基,并置于细胞培养箱中㊂组织块贴壁后,加37ħ完全培养基继续培养㊂约48h后组织块开始迁出P MV E C s,60h左右将组织块取出㊂之后隔天换液1次㊂1.2.2传代培养培养7~10d后,待细胞约为瓶底80%~90%,即可进行传代㊂弃去原培养液,漂洗后消化,待细胞收缩变圆㊁脱落,终止消化并离心㊂将离心后的细胞悬液,按1ʒ1比例传代㊂根据生长情况每1~2d换液1次㊂1.3细胞鉴定1.3.1细胞形态学观察显微镜下观察原代及传代细胞形态㊂1.3.2 Ⅷ因子鉴定取传代细胞,至六孔板内的盖玻片上㊂待细胞爬满玻片后,漂洗后加入4%多聚甲醛固定,0.3%T r i t o n X-100室温破膜,牛血清白蛋白温箱封闭㊂Ⅷ因子4ħ过夜后,加荧光二抗温箱避光孵育,漂洗后观察并记录㊂P B S替代一抗作为阴性对照㊂1.3.3 VW F鉴定按上述方法固定细胞后,依据免疫组织化学二抗试剂盒步骤鉴定VW F㊂P B S 替代一抗作为阴性对照㊂2结果2.1形态学结果显微镜下观察,原代细胞以铺路石样排列生长㊂而传代细胞呈长梭状㊂见图1㊁2㊂2.2 Ⅷ因子鉴定结果免疫荧光显示,细胞胞浆呈现绿色荧光,Ⅷ相关抗原表达阳性㊂见图3㊂2.3VW F鉴定结果免疫组织化学显示, P MV E C s内呈棕褐色,VW F相关抗原表达阳性㊂见图4㊂3讨论研究表明[4-5],肺脏组织大血管与微血管的内皮细胞之间存在着结构与功能的差异㊂在血管生成㊁血管通透性及其他相关研究中,P MV E C s更适合建立研究模型㊂这是因为P MV E C s较大血管有更强的适应环境的特性㊂注:P MV E C s为肺微血管内皮细胞图1组织块植入48h后P MV E C s开始从组织块中迁出ˑ2注:P MV E C s为肺微血管内皮细胞图2原代培养P MV E C s至72h,细胞约为瓶底80%~ 90% ˑ20目前用于原代培养P MV E C s方法主要有组织贴块法㊁免疫磁珠分离法㊁酶消化法等[6-9]㊂后两种方法步骤复杂,对技术及实验环境要求高,存在消化酶浓度把握不准的困难㊂而组织贴块法方法简单,易于操作,原代细胞培养成功率高㊂为提高组织贴块法原代培养P MV E C s的成功率,本实验尝试从以下几个方面进行了改良:①合适的动物选取是原代培养成功的第1步㊂在前期动物选取时,部分学者选择体质量150~250g的成年大鼠[2,10-11]㊂而在本研究的预实验中发现,成年大鼠的肺组织P MV E C s爬出困难,后期细胞生长缓慢㊂经过多次重复选择,最终选用体质量40~50g的幼年大鼠,其新陈代谢快,后期细胞状态好,传代能力强㊂②在灌洗肺循环环节,有的研究为了减少操作时间,摒弃此环节[6]㊂但在刘勇军等[2]的研究中得出,未灌洗的肺组织中存留大量红细胞及红细胞裂解物,影响迁出的P MV E C s的生长活力㊂因此,灌洗肺组织仍是必要的㊂与此同时,我们还发现,选择合适的灌注速度,尽量避免损伤肺微血管,对提高细胞培养的成功率有着至关重要的作用㊂本研究采用1m l注射器针头配10m l 针管从右心室进针缓慢灌洗肺组织至发白,不但可以控制灌注速度,又可清除大量红细胞,降低了裂解物对P MV E C s的毒性作用㊂③如何保证肺组织的活性是实验成功与否的关键㊂在本实验开始阶段,取材时选用未预冷的P B S及完全培养基, P MV E C s迁出率低㊂而将P B S及完全培养基改良为4ħ预冷,后期P MV E C s迁出率增高,生长状态好㊂④组织块是否贴壁是P MV E C s迁出的关键㊂根据以往的研究[12],组织块置于培养瓶后,仍有少量的培养基㊂然而我们经过多次尝试发现,即使少量的培养基,仍可引起组织块漂浮以至于无法贴壁㊂故采用无菌吸管吸去培养瓶中的全部培养基,湿润的瓶底可助于组织块牢固的贴壁,大大提高了P MV E C s迁出率㊂⑤以往的研究发现,即使增大灌注量也无法将肺组织中的红细胞完全清除[2]㊂因此,肺组织块植入后,应隔天换液至组织块取出㊂在本研究中,前期更换细胞培养基时,采用未经预热的P B S及完全培养基,结果发现大片细胞损伤甚至凋亡㊂对于更换培养基引起的凋亡,可能与温度骤然下降有关㊂故我们改良此步骤为,P B S及完全培养基经37ħ预热后再更换细胞培养基㊂而后发现P MV E C s的损伤减轻,改善了细胞生长状态㊂⑥理论上,每次换液时应将血细胞及其裂解产物漂洗干净㊂但在本实验的预实验阶段发现,过度漂洗并不能将裂解产物全部漂洗干净,还可能使组织块漂浮㊂在二者中经过多次权衡,最终采用每次换液前P B S漂洗2次,既可清除大部分裂解产物又可避免组织块漂浮㊂⑦在细胞传代阶段,以往研究多采用0.25%胰蛋白酶[12]㊂然而,0.25%胰酶消化后细胞不易脱落,需反复吹打下来,机械损伤严重㊂而我们将0.25%胰酶提前37ħ预热,胰酶的活性增高,传代后只需轻轻敲打瓶底数下即可,细胞损伤较机械损伤轻㊂⑧在本研究中,细胞固定前P B S漂洗需经37ħ预热,否则后期鉴定细胞时,易出现细胞脱落的现象,影响后期鉴定结果㊂经上述原代培养技术细节的改进,培养成功率大幅提高,且操作可重复性好㊂注:P MV E C s为肺微血管内皮细胞图3 P MV E C s中Ⅷ因子的表达结果免疫荧光 ˑ2注:P MV E C s为肺微血管内皮细胞;VW F为血管性血友病因子图4 P MV E C s中VW F的表达结果免疫组织化学ˑ10本研究显示,原代P MV E C s大多数以团簇状生长,呈典型的铺路石样㊂传代P MV E C s细胞形态与原代细胞形态略不同,呈长梭状,这与贾建桃等[6]的研究是一致的㊂总之,本研究采用了组织贴块法的方法培养P MV E C s,重点是对动物的选取㊁肺灌注的速度㊁漂洗次数及试剂温度等方面的优化㊂改良后的细胞培养重复性高且生长状态好,可在以后的相关研究工作中推广应用㊂参考文献[1]S a k a oS,T a r a s e v i c i e n e-S t e w a r t L,W o o dK,e t a l.A p o p t o s i s o fp u l m o n a r y m i c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a 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n.2095-140X.2013.01.003.(收稿日期:2017-11-07﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏)㊃简讯㊃‘肺脏介入医学“已出版由科学出版社最新出版的中文版‘肺脏介入医学“,是由北京协和医院组织相关专家翻译㊂该书系统的介绍了介入技术在治疗肺部良性与恶性疾病方面的最新内容和方法㊂三位主编:J o h nF.B e a m i s,J rP r a v e e nN.M a t h u rA t u l C.M e h t a均是肺脏介入医学领域的专家;美国支气管病学会的创始人㊂作为当今介入领域知名专家的智慧结晶,这一综合性专著为呼吸科医生及其他专科医师提供了全面的有关介入技术在诊断和治疗领域的应用技术包括硬质支气管术㊁激光治疗㊁冷冻治疗㊁电手术治疗㊁荧光支气管镜术㊁内科胸腔镜以及经支气管壁和经胸壁针吸术等㊂对于异物取出㊁肺胸膜病变以及早期肺癌等处理过程中的困境及具体情况,本书详细阐述了其操作流程㊂该书是呼吸科医生的必备参考书之一㊂定价149.00元㊂邮购电话:010-********传真:010-********地址:100717北京市东黄城根北街16号科学出版社温晓萍(请在汇款附言注明您购书的书名㊁册数㊁联系电话㊁是否要发票等)。