乳鼠心肌微血管内皮细胞体外原代培养与鉴定的实验研究

乳鼠原代心肌细胞培养概要作者：何伟， 张明雪， 闫丽娟作者单位：何伟(辽宁中医药大学,辽宁省沈阳市,110032)， 张明雪,闫丽娟(辽宁中医药大学附属医院)刊名：实用心脑肺血管病杂志英文刊名：PRACTICAL JOURNAL OF CARDIAC CEREBRAL PNEUMAL AND VASCULAR DISEASE年，卷(期)：2009，17(4)引用次数：0次1.郭军.鲍翠玉.林国生.杨波新生大鼠心肌细胞培养方法的改进[期刊论文]-心血管康复医学杂志 2006(6)2.邵华.金秀东.梁军.张际绯.刘瑞峰不同差速贴壁时间对心肌细胞培养的影响实验性研究[期刊论文]-牡丹江医学院学报 2008(1)3.王涛.余志斌.谢满江.车红磊新生大鼠心肌细胞培养技巧[期刊论文]-第四军医大学学报 2003(2)1.期刊论文谭玉珍.王海杰.TAN Yu-zhen.WANG Hai-jie生后不同时间乳鼠心肌细胞的形态结构和功能特征-解剖学报2009,40(4)目的 观察生后不同时间乳鼠心肌细胞的形态结构和功能特征,建立理想的分离和纯化乳鼠心肌细胞技术. 方法 采用胰蛋白酶消化和机械分离,结合两次差速贴壁法以及使用溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU),从生后1～7d乳鼠心脏分离和纯化心肌细胞.观察细胞的形态和自发性搏动,并用心肌特异性肌钙蛋白丁(cTnT)免疫细胞化学染色进行鉴定.利用原位透射电镜术观察细胞超微结构,并观察其对肾上腺素和异丙肾上腺素的反应. 结果 从乳鼠心脏分离的细胞95%以上为心肌细胞,存活率为95%以上.乳鼠心肌细胞包括短柱状或杆状细胞和不规则形细胞.生后1～3d鼠大部分杆状细胞呈现幼稚心肌细胞的超微结构特征.6～7d鼠的杆状细胞具有类似于成熟心肌细胞的超微结构特征,cTnT呈高表达,横纹明显.不规则形细胞含有少量肌丝束,排列不规则.少数体积较小的细胞呈现未分化细胞的超微结构特征.培养72h后80%以上的细胞出现自发性搏动.肾上腺素和异丙肾上腺素刺激后,搏动细胞数目增多,搏动增强.生后6～7d鼠杆状细胞的药物反应较强. 结论 两类心肌细胞的超微结构特征、自发性搏动和对肾上腺素和异丙肾上腺素的反应不同.生后6～7d鼠心肌细胞较适合于成熟心肌细胞的体外实验研究.本实验建立的方法 是一种较理想的乳鼠心肌细胞培养方法 .2.学位论文张昱第一部分：硫化氢对乳鼠心肌细胞缺氧损伤的保护作用;第二部分：硫化氢对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用2009研究一硫化氢对乳鼠心肌细胞缺氧损伤的保护作用 背景： 新型气体信号分子一硫化氢(H2S)在心血管系统主要具有舒张血管，开放心肌细胞ATP敏感钾通道、抑制L型钙通道而产生的负性心肌收缩力的效应。

乳鼠心肌细胞的培养配液：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。

取鼠：鼠盆用棉铺好，取鼠。

准备：事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。

其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。

新洁尔灭（0.1％）泡纱布（用10ml5％的新洁尔灭加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液）。

用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

物品：白大衣、饭盒小剪子、小镊子（4套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织，一套剪碎心脏）瓶皿（2套）[两个小圆培养皿，培养皿内加DMEM液，先后装取出的心和剔出纤维组织后的心] [一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]250ml烧杯3个[一个用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸] [一个装0.1％新洁尔灭150ml左右，消毒小鼠]500ml烧杯1个，用作废液缸。

50ml烧杯3个（剪碎心肌组织，最后配液）三角烧杯（50ml）+小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压）离心管及帽（12-14个），两个试管吸管（5~8个）大镊子（两把，持物，例夹棉球等）台面：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装0.1％新洁尔灭浸泡）、试管架、泡沫塑料板、五个针头（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、3个250ml烧瓶（一个装一蒸水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用）1个500ml烧瓶（废液缸）、温度计、PH试纸（事先调PH值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10个）[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml 6个（胰酶、DMEM、小牛血清）1ml 2个（双抗液）20ml备用2个、微量加样器1000ml及500ml以上物品均用紫外线照30分钟。

另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机+一把小锁、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。

原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。

2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。

3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。

4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。

5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。

封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。

第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。

之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。

放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。

这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。

（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。

5只鼠铺一个培养瓶。

4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。

心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。

注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。

华中科技大学硕士学位论文NPC乳鼠Purkinje细胞原代培养及Ca2+动力学特征和小鼠小脑氨基酸测定姓名：余姗姗申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：卜碧涛2010-04华中科技大学硕士学位论文NPC乳鼠Purkinje细胞原代培养及Ca2+动力学特征和小鼠小脑氨基酸测定华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科硕士研究生：余姗姗导师：卜碧涛中文摘要第一部分NPC乳鼠Purkinje细胞原代培养及细胞Ca2+电流和Ca2+动力学特征目的建立简单有效的NPC乳鼠Purkinje细胞原代培养方法，初步研究其细胞电生理特性，并将培养细胞用荧光染料Fluo-3/AM标记后在共聚焦显微镜下测定细胞内Ca2+浓度,比较NPC-/-乳鼠及野生型乳鼠培养细胞各观察指标之间的差异。

方法钝性分离生后24h内的乳鼠小脑，采用低浓度胰蛋白酶加机械吹打法获得单细胞悬液，然后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养，24h后更换为1%N2+1%T3+1%谷氨酰胺的DMEM/F12维持培养，3-5d后进行细胞免疫荧光染色，5-7d后在共聚焦显微镜下测定Purkinje 细胞内基础荧光强度值以及加入KCL溶液（60umol/l）以及NBQX(AMPA受体阻滞剂)后荧光强度值的变化，利用相应软件处理后得出细胞内Ca2+浓度测定结果，7-9d后用全细胞膜片钳单通道法记录钙电流。

结果该方法培养的神经元形态典型，细胞学鉴定阳性率高(>70%)，并记录到钙通道电流，且NPC-/-乳鼠培养细胞Ca2+浓度高于野生型乳鼠。

结论该方法取材容易，操作简单，培养的Purkinje细胞生长状态良好，活性较高，可用于电生理和Ca2+动力学研究。

关键词原代培养；Purkinje细胞；乳鼠；全细胞膜片钳；单通道记录法；共华中科技大学硕士学位论文聚焦；细胞内Ca2+浓度测定第二部分质谱分析法测定五周龄NPC小鼠小脑皮层3种氨基酸含量目的测定五周龄NPC小鼠小脑皮层氨基酸含量，比较NPC-/-小鼠与野生型小鼠小脑内氨基酸含量的差异。

[1] 。

大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定血管平滑肌细胞（VSMC 的异常增殖是许多心血管疾病的共同病理基础， 在高血压、 动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等 许多血管性疾病中，都涉及到血管平滑肌细胞的异常增殖 血管由 3 个部分组成，自内向外依次是内膜层、 中膜层和外膜层，内膜层主要由血管内皮细胞和少量的平滑肌细胞组成， 外膜层由要收缩调节机体的血流和血压， 其功能障碍在心血管疾病中起着 非常重要的作用， 因此， 对血管平滑肌细胞的生物学特性进行深 入研究，才能探明上述血管疾病的发病机制。

在VSMC 勺研究中， 组织块贴壁法培养 VSM （和胶原酶消化法是目前采用的非常广泛的技术。

本实验采用组织块贴壁法进行大鼠胸主动脉平滑肌细胞 的培养，并采用平滑肌细胞的3种标记分子（SMASM22Calponin ） 进行免疫细胞化学鉴定。

1 材料与方法成纤维细胞组成， 中膜层由血管平滑肌细胞组成， 平滑肌细胞主1.1 材料。

动物来源：健康 Wistar 大鼠，由第三军大学实验动物中心提供，雌雄不限，体重180 〜200g 。

DM EMS 糖培养 基 （美国 Gibco 公司） ， Hepes 索莱宝） ， 优质胎牛血清 （原 代培养浓度 20%，传代培养浓度 10%，美国 Hyclone ），胰蛋白酶，鼠单抗肌动蛋白 SMA 、SM22、Calponin 北京博奥森生物），DAB 显色试剂盒，通用型免疫组化检测试剂盒北京中杉金桥生物技术XX公司）其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 取材：断颈法处死Wistar 大鼠，消毒胸腹部，大组织剪、组织镊剪开胸腹部皮肤，更换器械，切开胸腹部，并切除部分胸壁以利于暴露胸主动脉，用眼科弯镊和眼科剪分离胸腹主动脉并放入盛有无菌PBS的细胞培养皿中。

转入超净工作台上，眼科直镊和弯镊清除结缔组织和血块，剥除动脉外膜。

放入另一盛有PBS的细胞培养皿中，减去血管外的细小分支，并放入含10%台牛血清的DMEI中，眼科直剪纵向剖开血管腔，用眼科弯镊轻轻刮除内膜面，以去除内皮细胞，放入另一含10%台牛血清的DMEM中，用眼科弯剪反复剪切成1mm*1m大小的组织块。

一种简易稳定的乳小鼠脑微血管内皮细胞原代培养方法熊永洁;尹波;甘莉;王倩;张苏明【摘要】Objective To find a simple and steady method for primary culture of cerebral microvascular endothelial cells (CMECs). Methods The cerebral cortices of 1 to 3 day newborn C57 mice were dissected and the meninges were removed carefully,followed by digestion with two kinds of enzymes and centrifugation at 4'C. The CMECs were harvested and observedrnunder the inverted, pna.se contrast microscopy and the transmission electron microscopy(TEM). The growth curve was drawn through MTT assay and factor Ⅷ| associated antigen was detected by using immunotluorescence analysis to characterize CMECs. Results After primary culture for 24 h,the cells appeared "polygon shaped" or "short spindle shaped" and clustered like islands. As the cells grew, they formed confluent monolayers demonstrating "swirl" or "cobblestone" morphology. The structure of tight junctions was observed under the TEM and the immunofluorescence staining revealed that the cells were posi tive for anti f actorⅧ. Conclusion Using the above method, a higher purity of CMECs was obtained. This economical, simple and repetitive primary culture could offer material to the further study of the properties in the aspects of physiology, biochemis try and pharmacology,as well as the function study of the in vitro model of blood brain barrier or co culture system.%目的寻找一种简单并稳定的原代小鼠脑微血管内皮细胞的培养方法.方法采用两次酶消化法及4℃梯度离心法获得细胞,光镜和电镜下观察细胞形态,用检测Ⅷ因子相关抗原等方法鉴定细胞.结果光镜下细胞呈多角形或短梭形,岛屿样聚集,随细胞生长及不断融合而出现"漩涡状"、"铺路石"样排列.电镜下观察可见紧密连接结构.Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色阳性.结论上述方法可获得纯度较高的小鼠脑微血管内皮细胞,为其原代培养提供了一种经济、简易、重复性好的操作方法,也为进一步的生理、生化、药理及体外血脑屏障或共培养等方面的研究提供了材料来源.【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》【年(卷),期】2012(041)006【总页数】4页(P731-734)【关键词】小鼠;脑微血管内皮细胞;原代培养【作者】熊永洁;尹波;甘莉;王倩;张苏明【作者单位】华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,武汉,430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,武汉,430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,武汉,430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,武汉,430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,武汉,430030【正文语种】中文【中图分类】R329.51脑微血管内皮细胞（cerebral microvascular endothelial cells，CMECs）是血脑屏障的重要组成部分，在血管神经单元（neurovascular unit，NVU）的各成分中，是实现血脑屏障功能的执行者，并参与了功能的调节［1］。

大鼠乳鼠腹主动脉血管内皮细胞的培养与鉴定侯伟;魏红玉;罗彦彦;许淑茹;陆俊佳;畅荣妮;舒伟【摘要】目的:研究大鼠乳鼠腹主动脉血管内皮细胞的培养与鉴定方法.方法:取出生5～7 d左右的大鼠乳鼠的腹主动脉血管,用组织块法在含20％胎牛血清及内皮细胞生长添加剂和肝素的DMEM培养基中培养,倒置相差显微镜观察内皮细胞形态和生长特征,免疫荧光方法进行血管内皮细胞Tie2相关抗原的鉴定.结果:来自于大鼠乳鼠腹主动脉的血管内皮细胞在改良的培养基中进行体外培养,能够保持增殖和传代的能力,且Tie2抗原鉴定呈阳性.结论:成功分离大鼠乳鼠腹主动脉组织并且获得体外原代培养大鼠乳鼠腹主动脉内皮细胞.用组织培养方法可以获得较满意的血管内皮细胞.【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2014(031)004【总页数】4页(P556-559)【关键词】大鼠乳鼠;血管内皮细胞;细胞培养;Tie2【作者】侯伟;魏红玉;罗彦彦;许淑茹;陆俊佳;畅荣妮;舒伟【作者单位】广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室南宁 530021;广西医科大学药学院有机化学与药物化学教研室南宁 530021;广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室南宁 530021;广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室南宁 530021;广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室南宁 530021;广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室南宁530021;广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室南宁 530021【正文语种】中文【中图分类】R-33血管内皮细胞(endothelial cell，EC)是覆盖于血管腔表面的单层细胞，是血管结构和功能的基础，具有多种重要的生理功能。

EC不仅调节血管生成，还调节血液和组织之间的物质交换以及分泌许多细胞因子。

血管生成与恶性肿瘤的增殖、转移与浸润的关系是当前研究的热点，血管EC在肿瘤血管形成中起重要作用[1,2]，可以为抗肿瘤血管形成及其他血管依赖性疾病的研究提供条件。

细胞原代培养实验报告细胞原代培养实验报告细胞原代培养是一种常用的实验方法，用于研究细胞的生物学特性和功能。

本实验旨在通过原代培养的方式，观察和分析细胞在体外环境下的生长和变化。

我们选择了小鼠胚胎成纤维细胞作为实验对象，以下是实验的详细步骤和结果分析。

实验步骤：1. 细胞分离：将小鼠胚胎取出，用无菌PBS洗涤去除血液和其他污染物。

然后将胚胎组织切碎，并用胰酶和胆汁酸溶液进行消化。

最后通过过滤器筛选，获取单个细胞悬浮液。

2. 细胞培养：将细胞悬浮液转移到含有培养基的培养皿中，加入适量的血清和抗生素。

将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。

3. 细胞观察：每天观察细胞的生长情况，记录细胞数量和形态的变化。

使用显微镜观察细胞的形态和结构，拍摄照片以备后续分析。

4. 细胞传代：当细胞达到80-90%的密度时，使用胰酶和胆汁酸溶液将细胞从培养皿上剥离下来。

将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，加入新的培养基，并按照相同的条件进行培养。

实验结果：在细胞培养的过程中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞的生长和变化。

初始阶段，细胞悬浮液中的细胞数量较少，呈现单个细胞的状态。

随着培养时间的延长，细胞开始聚集成群，形成细胞聚落。

在观察细胞形态时，我们发现细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征。

细胞体积较小，形状呈椭圆或长条状，有较长的细胞突起。

细胞质呈现出丰富的胞浆，胞核位于细胞的中央位置。

随着细胞的传代，我们观察到细胞的增殖速度逐渐加快。

细胞密度逐渐增加，细胞聚落的大小也逐渐增大。

同时，我们还观察到细胞形态的变化，细胞突起的数量和长度有所增加。

实验讨论：细胞原代培养是一种常用的实验方法，可以用于研究细胞的生长、增殖和分化等生物学特性。

在本实验中，我们成功地将小鼠胚胎成纤维细胞进行原代培养，并观察到了细胞的生长和变化。

细胞的形态特征对于细胞的功能和特性具有重要的指示意义。

在本实验中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征，这与之前的研究结果一致。

不同方法原代培养小鼠肺微血管内皮细胞的比较的开题报告一、研究背景小鼠肺微血管内皮细胞（MVEC）在肺血管的构建和维持肺组织的完整性方面具有重要作用，因此被广泛应用于肺血管疾病的研究中。

原代培养MVEC是研究MVEC功能和基础生物学过程的必要手段。

不同的培养方法可能会影响细胞的生长和功能，因此比较不同方法的优缺点对于确定最适合的实验方案很重要。

二、研究目的通过比较不同的原代培养方法，确定最佳的培养条件，以获得高质量和高稳定性的小鼠肺内皮细胞，为后续肺血管疾病的研究提供更有效的工作策略。

三、研究内容和方法我们将比较四个不同的原代培养方法：1. 细胞筛选方法：通过胶原酶和酶凝集素的消化，从小鼠肺中分离出MVEC。

筛选过程使用CD31+/CD45-的细胞表面标记。

2. 小鼠肺微血管内皮细胞抑制法：使用牛血清白蛋白和型I和型IV胶原酶，从小鼠肺中分离出MVEC。

细胞通过CD31+表面标记进行筛选。

3. 小鼠肺微血管内皮细胞酶解法：使用胰蛋白酶和DNA酶分离小鼠肺中的MVEC。

CD31+标记用于细胞表面标记。

4. 富钙培养法：使用钙罗汀溶液和胶原酶抑制剂从小鼠肺中分离出MVEC。

我们将比较这四种方法的培养时间、适用性、纯度、产量、细胞活力和增殖率，并确定最佳的小鼠肺MVEC培养方法。

四、预期结果通过比较不同的MVEC培养方法，我们期望能够找到一种可行的方法，既能够获得高质量的小鼠肺MVEC，又能够提高细胞数量和生长周期。

此外，我们还希望明确每种方法的优劣势，为进一步的实验研究提供实用的策略。