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椪柑原生质体分离与培养过程中活性氧动态变化及来源分析

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Botanical Research 植物学研究, 2016, 5(3), 67-73 Published Online May 2016 in Hans. http://www.hanspub.org/journal/br http://dx.doi.org/10.12677/br.2016.53010

文章引用: 徐小勇, 张一卉, 凌裕平. 椪柑原生质体分离与培养过程中活性氧动态变化及来源分析[J]. 植物学研究, 2016, 5(3): 67-73. http://dx.doi.org/10.12677/br.2016.53010

The Dynamic Changes and Origin Analysis of Reactive Oxygen Species during Isolation and Culture of Citrus reticulata Blanco Protoplasts

Xiaoyong Xu, Yihui Zhang, Yuping Ling School of Horticulture and Plant Protection, Yangzhou University, Yangzhou Jiangsu

Received: May. 3rd, 2016; accepted: May. 20th, 2016; published: May. 30th, 2016

Copyright © 2016 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Abstract In order to uncover the mechanisms underlying different regeneration capacity of protoplasts, we analyzed the dynamic changes and origin of reactive oxygen species (ROS) during isolation and culture of Citrus reticulata Blanco protoplasts. The dynamic changes of ROS were analyzed by flu-orescent markers, and ROS origin was investigated by ROS indicators. The results showed that ROS signals were visible in the cytoplasm and cell membrane of protoplasts; compared with me-sophyll protoplasts, callus protoplasts contained significantly lower level of ROS during isolation, but significantly higher level of ROS during culture; a significant decrease in the level of ROS dur-ing isolation and culture of callus protoplasts was observed after DPI or NaN3 treatment. Our

findings indicate ROS plays a crucial mediating role in protoplast regeneration of Citrus reticulata.

Keywords Protoplast, Reactive Oxygen Species, DPI, NaN3

椪柑原生质体分离与培养过程中活性氧动态变化及来源分析

徐小勇，张一卉，凌裕平 徐小勇 等 68 扬州大学园艺与植物保护学院，江苏 扬州

收稿日期：2016年5月3日；录用日期：2016年5月20日；发布日期：2016年5月30日

摘 要 分析原生质体分离与培养过程中活性氧(ROS)的动态变化与来源，对揭示原生质体再生能力差异的机制具有重要意义。本研究采用荧光标记法分析了ROS在椪柑原生质体分离与培养中的动态变化，同时通过ROS抑制剂处理探究了其ROS的来源。结果表明，ROS分布在原生质体的细胞质和细胞膜上；分离阶段

愈伤组织原生质体的ROS水平显著低于叶肉原生质体，但在培养阶段显著高于叶肉原生质体；DPI与NaN3

处理均显著降低了原生质体分离与培养过程中的ROS水平。因此，ROS在椪柑原生质体再生中具有重要

调控作用。

关键词 原生质体，活性氧，DPI，NaN3

1. 引言 原生质体是采用机械法或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞。目前已知植物原生质体及其衍生系统便于进行各种细胞及遗传操作，已成功用于体细胞杂交、遗传转化、基因瞬时表达、蛋白质互作等方面[1]-[3]。但是由于不同植物之间、不同基因型之间、不同外植体之间原生质体再生能力存在很大差异，不少植物(一些禾谷类作物、部分豆科作物、银杏等)、某些基因型(葡萄与梨主要栽培种等)、常用外植体(大多数禾谷类作物叶片、柑橘叶片等)的原生质体目前尚不能再生或再生难。因此，植物原生质体的再生能力问题已成为限制了这项技术广泛应用的关键瓶颈。 柑橘原生质体主要由愈伤组织和叶片分离而来，但只有愈伤组织来源的原生质体能持续分裂并再生植株，叶肉原生质体目前不能分裂再生，还不可单独用于柑橘遗传改良[4] [5]。迄今，这两种类型原生质体再生能力差异的机制尚不清楚。已有研究表明，ROS引起的氧化胁迫可能是造成不可再生型原生质体再生难的原因，然而另一方面ROS作为信号分子，对原生质体再生具有重要的调控作用，抑制其产生会导致原生质体不可分裂再生[6]-[9]。本文采用荧光标记法分析了ROS在椪柑原生质体分离与培养中的动态变化，同时通过ROS抑制剂处理探究了其ROS的来源，以期了解ROS在柑橘原生质体中的作用，为调控原生质体再生奠定理论基础。

2. 材料与方法 2.1. 植物材料 椪柑(Citrus reticulata Blanco)胚性愈伤组织在液体培养基(MT + 0.5 mg/l ME + 1.5 mg/l谷胺酰氨 + 50 g/l蔗糖)悬浮培养4代后用于原生质体分离；从椪柑果实中挑出饱满种子接种于MT培养基上，取充分展开的叶片用于原生质体分离。

2.2. 椪柑原生质体分离与培养 原生质体的分离与纯化参照Xu等[9]的方法，稍作修改。 徐小勇 等 69 愈伤组织原生质体的分离：取适量愈伤组织于培养皿中，分别加入2 mL的0.7 mol/L EME培养基(MT + 0.7 mol/L蔗糖 + 0.5 g /L ME)和酶液(2%纤维素酶R-10 + 2%离析酶R-10 + 12.8%甘露醇 + 0.011% NaH2PO4 + 0.12% MES + 0.36% CaC12∙2H2O)。封口膜封口，28℃暗条件下酶解18~20 h。

叶肉原生质体的分离：用手术刀片将试管苗叶片切成1~2 mm宽的条状，之后放入预先加入2 mL 0.6 mol/L EME (MT + 0.6 mol/L蔗糖 + 0.5 g/L ME)培养基中，最后加入2 mL酶液(2%纤维素酶R-10 + 2%离析酶R-10 + 10.9%甘露醇 + 0.011% NaH2PO4 + 0.12% MES + 0.36% CaC12∙2H2O)。封口膜封口，28℃暗条

件下酶解20~24 h。 酶解完成后的原生质体(酶解混合物)通过孔径为45 μm的不锈钢筛网过滤，并用CPW13洗涤、离心。然后采用CPW13/CPW26界面梯度离心，用吸管将两液面间的原生质体带吸出。最后将原生质体悬浮于液体培养基MA (MT + 0.15 M蔗糖 + 0.45 M甘露醇 + 40 mg/L腺嘌呤)中，封口转入28℃恒温培养箱培养。

2.3. 原生质体分离与培养中ROS的动态分析体分离与培养 使用荧光探针2，7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸(H2DCF DA)分析细胞中ROS分布与水平。先取1 mL原生质体悬浮液，加入5 μL的0.2 mM H2DCF DA溶液，混匀避光孵育15~20 min。然后用缓冲液洗去原

生质体表层的多余探针，重复两次。取一滴原生质体溶液于干净载玻片上，加盖玻片后，迅速用激光共聚焦显微镜(激发波长K = 460~490 nm，发射波长K = 510~520 nm)观察，拍照。实验重复3次，选择其中有代表性样本进行分析。荧光亮度采用Image J软件进行分析，数据采用SPSS软件进行差异显著性分析。

2.4. ROS抑制剂处理观察原生质体的活性氧变化 取1.5 ml原生质体悬浮液，加入1 μL的25 mM NADPH氧化酶特异性抑制剂二苯基氯化碘盐(Diphenylene iodonium, DPI)或1 μL的5 M过氧化物酶抑制剂叠氮化钠(NaN3)，混匀培养10 min或30 min

后，1000 rpm离心10 min，弃上清，留原生质体沉淀，再用MA培养液离心洗涤1次。对处理后的原生质体悬浮液，加入5 μL H2DCF DA溶液，混匀避光孵育15~20 min。同上步骤进行活性氧的观察与分析。

3. 结果与分析 在不少植物原生质体分离与培养过程，研究人员发现ROS积累现象[9]-[12]。因此，本研究以椪柑原生质体分离与培养过程中的五个重要时间点进行了ROS相关分析，包括酶解2小时、酶解4小时、酶解6小时、培养4天和培养8天。

3.1. 原生质体分离与培养中ROS的亚细胞定位与时空变化研究 在植物细胞中，叶绿体、线粒体和过氧化物体是产生ROS的主要部位，其他一些具有高度氧化活性或强烈电子传递作用的细胞器或部位也都可以产生ROS。在椪柑愈伤组织原生质体分离过程中(图1(a)~(c))，原生质体的细胞质和细胞膜上检测到较弱的ROS荧光信号；而培养的4~8天内，ROS荧光信号在细胞膜和细胞器中较强(图1(d)，图1(e))。叶肉原生质体在分离与培养过程中，ROS荧光信号未有明显变化，且多数出现在细胞质和细胞膜上，叶绿体上较少(如图2)。 利用ROS荧光探针，使用共聚焦显微镜检测，既可以定位ROS，通过细胞内的荧光强度分析也能反映细胞的总体ROS水平。本研究采用Image J软件分析了原生质体ROS荧光强度。结果表明，在愈伤组织原生质体分离过程中，原生质体内ROS水平降低，在培养过程中呈先上升后下降，培养阶段的原生质体与分离阶段的原生质体其ROS水平之间存在显著差异；叶肉原生质体在分离阶段ROS水平显著高于

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柑橘内生细菌分离、鉴定及分布特性

柑橘内生细菌分离、鉴定及分布特性

柑橘内生细菌分离、鉴定及分布特性孙大光1,2，郑雪芳2，刘波2 ，阮传清2，范国成2，夏育陆3，Hall D.4，段永平4（1福建师范大学生命科学学院，福州350108；2福建省农业科学院柑橘黄龙病研究中心，福州350003；3美国北卡州立大学有害生物综合治理研究中心, 美国；4美国农业部佛罗里达园艺试验室，弗罗里达34945）摘要：对红心柚、蜜桔、金桔内生细菌进行分离鉴定并做多样性分析，为研究柑橘内生细菌与柑橘病害的生物防治奠定基础。

平板分离法分离柑橘不同器官内生细菌，采用美国MIDI微生物鉴定系统鉴定菌株，对内生细菌数量进行统计、分类，并作群落多样性分析。

3种柑橘共分离得到的内生细菌属于32个种，隶属于17个属。

红心柚、蜜桔、金桔分别分离得到内生细菌10个属13个种，14个属22个种，12个属21个种。

不同种类细菌中芽孢杆菌属细菌含量最高，3种柑橘中金桔的内生细菌含量最高，不同器官中根部的内生细菌含量最高。

柑橘内生细菌进行聚类分析表明，。

在不同柑橘和不同器官中内生细菌的种类、数量和群落多样性存在较大差异。

蜜桔叶片内生细菌的SIMPSON（D）指数最高；蜜桔叶片内生细菌的SHANNON（H1）指数最高；蜜桔根部内生细菌Pielou指数最高。

本研究丰富了柑橘内生细菌资源，为柑橘内生细菌的利用提供了物质基础，并对科学说明生防作用机理具有重要价值。

关键词：柑橘内生细菌PLFA多样性分布S eparation, identification and distribution of endophytic bacteria in citrusSUN Da-guang1，2，ZHENG Xue-fang2，LIU Bo2*,RUAN Chuan-qing2, FAN Guo-cheng2, XIA Yu-lu3, Hall D.4, DUAN Yong-ping41. College Of Life Science Fujian normal university, Fuzhou 350108, China;2.Citrus Huanglongbing Research Center, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China；3. The Center of Integrated Pest Management, North Carolina State University, North Carolina, USA；4. Horticultural Research Laboratory (USDA/ARS), Florida, 34945, U.S.AAbstract: In order to ascertain the connection between citrus endopphytic bacteria and the Biological control about citrus Disease, the study on the citrus endophyte’s number, bacteria’s identification and community multiplicity analysis were conducted. The endophytic bacteria were isolated using the culture method and identified by Microorganism Identification System (MIDI system produced by USA). 32 microbial species identified belonging to 17 genera of bacteria were detected from endophytic bacteria in Citrus grandis Osbeckcv, Chinese honey orange and Cumquat. The content of Bacillus was the most in all endophyte, Cumquat’s endophyte was the most among 3 these citrus and the number of endophytic bacteria in root was more than other organs. The cluster analysis results showed that 32 strains could be separated into 7 groups. The community multiplicity and diversity of endophytic bacteria were significant different in 3 different citrus.Keyword：citrus；endophytic bacteria；PLFA；community multiplicity柑橘是世界第一大果树品种，全球有135个国家和地区生产柑橘，2008年我国成为世界柑橘第一大国[1, 2]。

靖安椪柑生物学特性观察及栽培技术要点

靖安椪柑生物学特性观察及栽培技术要点

靖安椪柑生物学特性观察及栽培技术要点作者：舒桂南熊尚知来源：《现代园艺》2008年第04期靖安椪柑是从实生椪柑选育发展而成。

1962年经江西省农科院鉴定，该品种与福建省芦柑相比，有显著不同，与四川江津椪柑相比，稍有相似。

为了区分品系，定名为“靖安椪柑”。

该品种曾多次获上级有关部门的嘉奖。

2000年，中国名优产品协会授予靖安为“中国椪柑之乡”。

1 品种特征特性1.1 生物学特性靖安椪柑主枝角度小，枝条生长稠密，具有直立向上的特性。

其树冠呈圆头形。

幼龄树抽发的夏秋梢多而长，树冠扩大快。

主干有棱，徒长枝有刺。

花多为有叶单花枝，白色，为完全花。

根系分布比较深广，侧根发达，须根大多分布在20~50cm的土层之间，根系的吸收和再生能力强。

根系生长有3次高峰：第1次在春梢生长之后至夏梢未抽发之前，为全年发根最多最好的1次；第2次在夏秋梢抽发之间，发根量很少；第3次在秋梢抽发之后至采果之前，发根数量和质量介于前2次之间。

1.2 物候期及生长习性一年抽梢3~4次。

春梢抽梢期在3月下旬至4月下旬，生长期约1个月。

夏梢抽梢在5月中旬至7月中旬，有早夏梢和夏梢之分，为期2个月。

秋梢抽梢期一般在8月上旬至9月上旬。

9月中旬至10月抽的梢为晚秋梢。

一般在4月上旬出现花蕾，盛花期在4月下旬，末花期在5月初。

花量中等，坐果率较高，一般情况下为3%~5％。

生理落果期为2次，第1次自谢花开始至５月下旬止，第2次自6月中旬开始到7月上旬止。

1.3 结果习性结果母枝以秋梢为主，壮年树结果母枝上的结果枝结果后，翌年结果母枝仍可抽生结果枝结果，因而结果部位比较固定。

结果量在树冠下层占23.5％，中层为48.3％，上层为28.2％。

同时，内膛枝结果亦较多，占结果量的25.4％。

立体结果性比较强，丰产稳产性能好。

靖安椪柑定植后，一般第4年开始结果，第5年单株产量在10kg以上。

7~8年后进入盛果期，单株产量可在50kg以上。

1.4 果实品质靖安椪柑果实呈高腰圆形，成熟期一般在11月下旬至12月上旬。

4类重庆柑橘乙醇提取物类黄酮分析及其体内外抗氧化评价

4类重庆柑橘乙醇提取物类黄酮分析及其体内外抗氧化评价

4类重庆柑橘乙醇提取物类黄酮分析及其体内外抗氧化评价[目的]研究4類重庆柑橘乙醇提取物的类黄酮成分及其体内外抗氧化活性。

[方法]以4种重庆产区柑橘果实（梁平柚、奉节脐橙、万州大红袍红橘和潼南尤力克柠檬）为研究材料，利用Xevo G2-S Qtof高分辨四级杆飞行时间质谱仪中的超高效液相色谱仪（Ultra-performance liquid chromatography with a photodiode array detector，UPLC-PDA）对柑橘果皮和果肉的乙醇提取物中主要的10种类黄酮（橙皮苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、地奥司明、橘皮素、川陈皮素、圣草次苷、甜橙黄酮、异橙黄酮和山柰酚）进行了定性和定量分析，并用3种体外抗氧化测定方法（DPPH、ABTS、FRAP）评价柑橘果实乙醇提取物的抗氧化活性。

同时，以酿酒酵母BY4742菌株为试验模型，检测用低、中、高浓度的4类柑橘果实乙醇提取物处理后酵母菌胞内活性氧（Reactive oxygen species，ROS）含量。

[结果]不同柑橘、同种柑橘不同部位的类黄酮种类和含量都存在差异。

总体而言，柑橘果皮类黄酮物质的种类与总含量高于果肉，果皮提取物的内外抗氧化能力高于果肉提取物。

其中，梁平柚果实中含量最高的是柚皮苷，奉节脐橙、万州大红袍红橘和潼南尤力克柠檬果实提取物中含量较高的是橙皮苷。

此外，圣草次苷大量存在于潼南尤力克柠檬果实中，川陈皮素大量存在于万州大红袍红橘中，芸香柚皮苷大量存在于奉节脐橙中，山柰酚主要分布于梁平柚果皮中，地奥司明主要分布于柠檬和柚子的果肉中。

[结论]奉节脐橙具有较好的营养价值。

与其他3种柑橘果肉相比，奉节脐橙果肉含有最高的类黄酮含量、综合抗氧化活性和较高的活性氧清除能力。

我国是柑橘属植物最重要的起源地，拥有丰富的柑橘资源[1-2]。

柑橘作为类黄酮含量丰富的水果之一，具有重要的的营养、保健、医学和经济价值[3-5]。

目前已从柑橘中鉴定出超过60种类黄酮物质，主要是黄烷酮类、黄酮、黄酮醇和花色苷[6]，其具有重要的抗氧化活性[7]。

红肉脐橙发育过程中抗氧化系统与活性氧的变化

红肉脐橙发育过程中抗氧化系统与活性氧的变化

红肉脐橙发育过程中抗氧化系统与活性氧的变化
黄仁华;夏仁学;陆云梅;胡利明
【期刊名称】《园艺学报》
【年(卷),期】2006(33)6
【摘要】以红肉脐橙果肉为材料,比较了不同时期谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸(AsA)含量及相关酶活性和活性氧(AOS)产生速率的变化。

结果表明:果肉在整个发育过程中,脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性在很大程度上可以促进AsA积累,两者呈显著的正相关(r=0.870,P<0.05),并且与抗坏血酸过氧化物酶(AsA-POD)活性在动态上彼此消长;谷胱甘肽还原酶(GR)的变化趋势与GSH相同,呈单峰型的变化,两者的相关系数为r=0.978(P<0.01);AsA/DHAsA和GSH/GSSG比率在整个发育过程中呈下降的趋势,而活性氧(H2O2,O.2)水平一直呈上升变化。

【总页数】4页(P1287-1290)
【关键词】脐橙;谷胱甘肽;抗坏血酸;酶活性;活性氧
【作者】黄仁华;夏仁学;陆云梅;胡利明
【作者单位】华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】S666.4
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1.纽荷尔脐橙果实发育过程中类黄酮变化与体外抗氧化活性的关系 [J], 黄仁华;陆云梅;夏仁学
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5.红肉脐橙果实中抗氧化物质含量及其抗氧化活性变化 [J], 陆云梅;黄仁华;夏仁学因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。