原生质体的分离、融合与培养
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植物原生质体的分离及融合
植物原生质体的分离及融合生93沈睿2009012372同组：古梦婷实验日期：2011年11月2日一．实验原理1.原生质体分离原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。
细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。
2.原生质体融和诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。
本实验用PEG诱导原生质体融和。
PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。
PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。
当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子。
Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。
高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。
普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。
PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。
二．实验步骤1.原生质体的制备（1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。
（2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。
（3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。
（4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。
修改第八章原生质体培养和融合
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8
使用的酶主要有： 纤维素酶(Cellulase)、 果胶酶(Pectolyase)、 离析酶(Macerozyme )、 半纤维素酶(Hemicellulase) 崩溃酶(Driselase)， 其中纤维素酶和果胶酶是最必要的。
a
9
酶液中的渗透压是原生体分离的另一个因素，植物细 胞去壁后，必须由合适的渗透压替代细胞壁维持的机械压力， 酶液中的渗透压过低会使细胞吸涨而破裂；渗透压过高，细 胞除受到渗透压力而破裂外，还会损害细胞生长代谢 。
培养基，将适当密度的原生质体悬浮液加在含琼脂的培养基上。 液层较浅，有利于通气，而且固体培养基中的养分可以释放到 液层中去，以补充培养物对养分的消耗。另外培养物中的代谢 产物对原生质体的生长不利，可以为固体层所吸收，降低或消 除毒害。
a
14
13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
原生质体纯化(以柑桔原生质体为例，界面法)
a
15
果胶酶和 纤维素酶
过滤、离心
原生质体制备流程（以叶片为例）图
a
17
第二节 原生质体的培养
一、原生质体培养的方法 1. 液体培养
培养基中不加凝固剂，仅仅用液体培养基按所需植板密度重悬 原生质体后，直接植板在培养皿中即可。 液体浅层培养法是目前 原生质体培养中广泛应用的方法之一。 优点：操作简便，对原生质体伤害小，有利于通气。 缺点：容易使原生质体互相粘连、聚集，导致原生质体损坏；并且 难于定点观察监测单个原生质体的发育过程。
a
13
***沉降法：利用密度不同沉降速率不同的原理，低速离心使 原生质体沉于离心管底。此法方便，但不易除尽一些完整的 细胞或破碎的原生质体。 ***界面法利用原生质体和破碎细胞比重不同，低速离心条件 下完整的原生质体漂浮于密度不同的两相分界处，碎片留在 低层相中，可从两相界面收集到高纯度原生质体。
原生质体无菌分离培养与融合
然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。由于比重不同， 蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面(注意要有明显界 面). (2) 1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚 集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界 面处，
(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离 心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心收集沉淀，用13%CPW 的CPW重新悬浮。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高pH法
头，滤膜（*4） 和电融合法。
（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液4ml加入另外一支离心管底部，然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。 加1ml13%CPW洗液悬浮。
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤头，滤膜（*4）
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主 质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有
效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高 pH法和电融合法。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而 具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一 些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够 长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥 而使之粘连。
材料灭菌：解剖刀，长短镊子，烧杯（4 CPW洗液以及含13％甘露醇的CPW
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 原生质体的酶解与分离（无菌条件）
个），玻棒，滤纸若干张，培养皿（1个） (2) 1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处， 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤 CPW洗生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。
(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离 心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心收集沉淀，用13%CPW 的CPW重新悬浮。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高pH法
头，滤膜（*4） 和电融合法。
（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液4ml加入另外一支离心管底部，然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。 加1ml13%CPW洗液悬浮。
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤头，滤膜（*4）
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主 质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有
效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高 pH法和电融合法。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而 具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一 些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够 长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥 而使之粘连。
材料灭菌：解剖刀，长短镊子，烧杯（4 CPW洗液以及含13％甘露醇的CPW
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 原生质体的酶解与分离（无菌条件）
个），玻棒，滤纸若干张，培养皿（1个） (2) 1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处， 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤 CPW洗生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。
植物原生质体的分离与融合(3)
细胞工程实验六植物原生质体的分离与融合实验概要本实验介绍了原生质体分离的方法及利用PEG原生质体融合的原理和方法。
实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。
其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。
由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。
其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。
测定原生质体的活性有多种方法。
荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。
一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。
它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原生质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇（PEG）法、高钙高pH法和电融合法；聚乙二醇（PEG）作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高钙高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。
聚乙二醇（PEG）诱导如何的机理：聚乙二醇（PEG）由于含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当聚乙二醇（PEG）分子足够长时，可作为临近原生质表面之间的分子桥而使之粘连、聚乙二醇（PEG）也能连接钙等阳离子，钙可在一些负极化基团和聚乙二醇（PEG）之间形成桥，因而促进粘连。
从而引起原生质体融合：高钙高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时渗透压冲击也可能起作用。
原生质体分离纯化后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。
原生质体融合操作方法
原生质体融合操作方法
原生质体融合是将两个或更多的细胞融合在一起，以形成单一的细胞。
在实验室中，原生质体融合可用于合成杂交细胞或研究细胞膜蛋白质交互作用。
以下是一种常用的原生质体融合操作方法：
1. 制备原生质体：收获新鲜的植物细胞并环绕其周围的细胞壁。
用酶类解除细胞壁以获得原生质体。
2. 制备混合物：在离心管中将两种原生质体混合并加入缓冲液。
3. 让细胞融合：通过高渗透压或电脉冲使膜破裂或局部破损，让细胞形成互通。
4. 分离融合物：将融合物分离出来，并放在一个合适的培养基上培养。
5. 检测融合结果：使用显微镜观察细胞是否真正融合，或使用特定的抗体标记来检测融合后的细胞表面分子。
需要注意的是，原生质体融合需要谨慎操作，避免损坏细胞结构或引入杂质。
在实验中，需要仔细选择不同类型的原生质体，以确保它们能够融合。
原生质体的分离与融合
原生质体融合技术体系大致包括三大环节：
02
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简意赅地阐述观点。
诱导原生质体融合
03
杂种植株的再生与鉴定
选择融合体或杂种细胞
(一) 原生质体融合
原生质体融合（Protoplast fusion）是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。 自然融合（Spontaneous fusion） 来源于分裂旺盛细胞的原生质体，自发融合的频率较高。小孢子来源的原生质体融合率可高达50~70%。实际上自然条件下受精就是一种自发融合。
2.酶法
原生质体的分离
01
二、影响原生质体分离的因素
01
原生质体分离时主要考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透
02
压、酶解时间、温度等。
03
组织和细胞材料的生理状态
04
植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体
05
的最方便、最合适的植物材料。叶肉细胞排列松散，酶试剂很
06
容易达到细胞壁。用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮细胞应
添加标题
质杂种。
体细胞杂交
物种间生殖隔离阻碍了物种之间的基因交流，从而给作物育种带来很大的局限性。原生质体融合技术是实现基因重组的一条新途径，目前利用细胞融合已从很多物种、属间，甚至科间获得体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型。
01
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01
体细胞杂种的应用
一、体细胞杂种的应用潜力
添加标题
植物育种中的核质替换
添加标题
细胞质杂种的获得
添加标题
远缘杂交创造新物种
02
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诱导原生质体融合
03
杂种植株的再生与鉴定
选择融合体或杂种细胞
(一) 原生质体融合
原生质体融合（Protoplast fusion）是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。 自然融合（Spontaneous fusion） 来源于分裂旺盛细胞的原生质体，自发融合的频率较高。小孢子来源的原生质体融合率可高达50~70%。实际上自然条件下受精就是一种自发融合。
2.酶法
原生质体的分离
01
二、影响原生质体分离的因素
01
原生质体分离时主要考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透
02
压、酶解时间、温度等。
03
组织和细胞材料的生理状态
04
植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体
05
的最方便、最合适的植物材料。叶肉细胞排列松散，酶试剂很
06
容易达到细胞壁。用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮细胞应
添加标题
质杂种。
体细胞杂交
物种间生殖隔离阻碍了物种之间的基因交流，从而给作物育种带来很大的局限性。原生质体融合技术是实现基因重组的一条新途径，目前利用细胞融合已从很多物种、属间，甚至科间获得体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型。
01
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简意赅地阐述观点。
01
体细胞杂种的应用
一、体细胞杂种的应用潜力
添加标题
植物育种中的核质替换
添加标题
细胞质杂种的获得
添加标题
远缘杂交创造新物种
原生质体培养与融合
飘浮法
采用比原生质体密度大的高渗溶 液（蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生质体漂浮在液体表层的纯 化方法。 优点： 可以避免分离的原生质体因震 荡被组织碎片撞击而破损。 所用药品简单，成本低。 缺点及补救措施： 对离心力要求比较严格，掌握不 好，原生质体则不易漂浮。可采 用不同浓度和不同离心速度分次 漂浮的方法。
影响原生质体培养的因素
培养条件
温度，光照
植物材料和基因型
柑桔，葡萄，桃
供体细胞的生长同步性
原生质体再生过程
原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质 体在适当的培养方法和良好的培养条件下， 很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细 胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分 化出完整植株的过程。 细胞壁再生 细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 植株再生
胡萝卜培养 6d 细胞
8~10d形成细胞 10~ 5~30 团，4周后形成 20 胚状体
矮牵牛愈伤 4d 组织 2~ 油菜叶片 3d
10
马铃薯子叶 48h 46.1 马铃薯花粉 2h
2周后形成20~25 个细胞的细胞团 15d形成细胞团 28d愈伤组织 9~10d形成16个 细胞的细胞团 15d形成细胞团
影响原生质体培养的因素
原生质体的活力
原生质体的起始密度
适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生
质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能 分裂一、二次，密度在104个／ml以上，植板率 常显著提高。
渗透压稳定剂 培养基营养
原生质体培养经常使用的KM-P培养基就
是以B5培养基为基础；N6培养基则以MS 培养基为基础 改进的。
渗透压稳定剂
原生质体培养及融合
要是原生质体，可以采用下述两种方法进行进一步的纯化。
主要方法： 漂浮法、界面法和沉降法等。
30
A. 漂浮法：使用的飘浮剂有蔗糖、Percoll（珀可，是由聚乙烯
吡咯烷酮包被的SIO2颗粒的无菌胶体悬液）、Ficoll（菲可，水溶 性聚蔗糖）。
原理：采用比原生质体比重高的渗透溶液，使原生质体漂浮在 溶液表面，具体方法为：
子叶/叶片 下胚轴
39
五、原生质体培养
培养密度很重要（原因）：一般以104-105个/ml为宜。 常用的培养方法：液体浅层培养、固体平板培养、 固－液双层培养
40
1) 原生质体的培养方法
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进 行培养。
优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养 基和转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现 象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个 细胞的发育情况。
9
4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可以进行亚细胞水平的操作 研究。如叶绿体、线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄取细胞 器后进行培养，获得再生植株，根据再生植株的表现，即可进行遗 传分析，研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
也可以通过细胞器的转移，使物种获得相应的性状。
10
胞质体( cytoplast ) ：不含细胞核，只有细胞质。 微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条染色体的情况。
4
细胞膜
细胞壁
原生质体
植物细胞
细胞核
染色体
微小原生质体 小原生质体 （核质体） 胞质体
5
原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。是指将植物的不同 种、属甚至科间的原生质体，通过人工方法诱导融合，然后进行离 体培养，使其再生成为杂种植株的技术。
主要方法： 漂浮法、界面法和沉降法等。
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A. 漂浮法：使用的飘浮剂有蔗糖、Percoll（珀可，是由聚乙烯
吡咯烷酮包被的SIO2颗粒的无菌胶体悬液）、Ficoll（菲可，水溶 性聚蔗糖）。
原理：采用比原生质体比重高的渗透溶液，使原生质体漂浮在 溶液表面，具体方法为：
子叶/叶片 下胚轴
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五、原生质体培养
培养密度很重要（原因）：一般以104-105个/ml为宜。 常用的培养方法：液体浅层培养、固体平板培养、 固－液双层培养
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1) 原生质体的培养方法
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进 行培养。
优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养 基和转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现 象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个 细胞的发育情况。
9
4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可以进行亚细胞水平的操作 研究。如叶绿体、线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄取细胞 器后进行培养，获得再生植株，根据再生植株的表现，即可进行遗 传分析，研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
也可以通过细胞器的转移，使物种获得相应的性状。
10
胞质体( cytoplast ) ：不含细胞核，只有细胞质。 微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条染色体的情况。
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细胞膜
细胞壁
原生质体
植物细胞
细胞核
染色体
微小原生质体 小原生质体 （核质体） 胞质体
5
原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。是指将植物的不同 种、属甚至科间的原生质体，通过人工方法诱导融合，然后进行离 体培养，使其再生成为杂种植株的技术。
原生质体的分离和培养
时间 30min-------20h
4.木、草本植物使用时间不同
5.时间 4~24h 1g材料+10ml
二 原生质的培养
1.过程:原生质---细胞再生---细胞分裂--细胞团芽和根
2.培养方法
细胞植板法 半固体培养基 琼脂糖
优点:位置固定,方便观察 琼脂上细胞不易分裂 可降低渗透压
多用液体培养基: 可更换培养基 可降低细胞密度
----胚状体---植物
方法:(1)原生质悬浮液0.5ml,置于10mm×100mm的小 管中;
(2).加入贮于00C,含2mg/L的 FDA的丙酮溶液成 质量分数为0.01%,混匀;
(3).置于室温下5min后
用荧光显微镜观察
有活力: 荧光 无活力:无荧光
2.检测细胞壁是否除净荧光增白剂
用荧光显微镜观察 培养基
有细胞壁 绿色荧光
无细胞壁:红色
将纯化后收集的原生质加入0.1%--0.05%的荧光增
白剂,染色5~10min.离心3min,再用0,7mol/L甘露洗去
多余染料,如此重复3次.
1.营养成分 无机盐 有机物
激素
条件培养基:将生长迅速的细胞在液体培养基中培 养一段时间,除去细胞后收集的培养基.
Ph值 5.6~5.8
2.原生质体的培养方法
2.酶解:
苄烷铵0.1%+酒精10%-- 5min 01
1.表面消毒:
60%~70%酒精消毒30s--- 0.1%HgCl2- 无菌水冲洗 3~5次 02 撕去叶片下表皮(向下)--- 漂浮于酶液中----------------纤维素酶:消化细胞壁纤维素
酶的选择: 静止 轻摇 易获得 酶处理简便
酶解法:漆斑霉产生的纤维素酶(粗制剂)---分离番茄根尖 细胞原生质体
第五章 植物原生质体的分离与培养
原生质体融合二杂种细胞的选择与细胞杂种的鉴定体细胞杂种的鉴定这种鉴定不但在于确认细胞杂种的杂种性而且必须弄清楚融合亲本的双方各贡献了哪些遗传成分因为在杂种细胞发育成完整植株的过程中往往有一方的染色体更易消减掉
第五章 植物原生质体的分离、培养与杂交
杨柏云
南昌大学生命科学与食品工程学院
精选2021版课件
值得注意的是，在考虑分离植物原生 质体时，既要采用容易获得原生质体的 植物材料，但更重要的是要选用易于再 生完整植株的细胞。
详见图2
精选2021版课件
10
精选2021版课件
11
四. 植物原生质体的分离和纯化
(一) 原生质体的分离 旱在1892年就有人用机械法分离原生质
体。直到1960年，英国的科金(Cocking) 首先采用酶解法分离原生质体，这一重 要发现开辟了细胞工程研究的许多领域， 作出了巨大的贡献。
精选2021版课件
21
精选2021版课件
22
精选2021版课件
23
五. 影响原生质体分离的几个因素
1.材料不同其细胞壁的组成和结构也有差 异。因此分解细胞壁的酶的种类和浓度 也不相同，如分离根尖细胞的原生质体 要有较多的果胶酶。
2.渗透压稳定剂的种类和浓度也因材料不 同而有变化。
3.在酶液中加入适量的氯化钙和磷酸二氢 钾作为原生质体稳定剂，可增强质膜的 稳定性。
精选2021版课件
19
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20
(三) 原生质体的活力测定
用于培养和细胞工程操作的必须是健康 的有活力的原生质体。
方法有二：
一是凭借形态可识别原生质体的存活性。 二是采用特异的染色方法来确定，可用 0.1%酚藏花红液染色，活的原生质体能 着红色；最好是采用荧光素双醋酸酯 (FDA)染色。有活力的原生质体带有荧光， 无活力的不产生荧光。
第五章 植物原生质体的分离、培养与杂交
杨柏云
南昌大学生命科学与食品工程学院
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值得注意的是，在考虑分离植物原生 质体时，既要采用容易获得原生质体的 植物材料，但更重要的是要选用易于再 生完整植株的细胞。
详见图2
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四. 植物原生质体的分离和纯化
(一) 原生质体的分离 旱在1892年就有人用机械法分离原生质
体。直到1960年，英国的科金(Cocking) 首先采用酶解法分离原生质体，这一重 要发现开辟了细胞工程研究的许多领域， 作出了巨大的贡献。
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五. 影响原生质体分离的几个因素
1.材料不同其细胞壁的组成和结构也有差 异。因此分解细胞壁的酶的种类和浓度 也不相同，如分离根尖细胞的原生质体 要有较多的果胶酶。
2.渗透压稳定剂的种类和浓度也因材料不 同而有变化。
3.在酶液中加入适量的氯化钙和磷酸二氢 钾作为原生质体稳定剂，可增强质膜的 稳定性。
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(三) 原生质体的活力测定
用于培养和细胞工程操作的必须是健康 的有活力的原生质体。
方法有二：
一是凭借形态可识别原生质体的存活性。 二是采用特异的染色方法来确定，可用 0.1%酚藏花红液染色，活的原生质体能 着红色；最好是采用荧光素双醋酸酯 (FDA)染色。有活力的原生质体带有荧光， 无活力的不产生荧光。
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• PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效 应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质 体融合得以完成。
• PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水 化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可作为邻近原 生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可 在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接 在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从 而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高 了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。
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– 实验材料：黄瓜种子。
– 实验用品： ①实验器具：三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解 剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、滤 器、培养瓶、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、 超静工作台。
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②试剂：
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(1)酶液
(2)PEG融合液
(3)13％CPW洗液
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实验十二 原生质体的分离、 融合与培养
指导教师：唐颖
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1.实验目的
• 了解植物原生质体分离、融合和培养的基 本原理。
• 掌握植物原生质体分离、融合和培养的基 本过程。
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2.实验原理
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概述
• 物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义， 它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，可望成为 作物改良的有力工具之一。
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• 观察
➢ 两种原生质体加入PEG融合液后，只发生粘连，在洗涤过程中才发生 膜融合．核融合通常于融合体第一次有丝分裂过程中发生。
• 培养
➢ 将原生质体或融合体悬液铺于愈伤组织诱导培养基（固体）上进行浅 层培养，在温度25±2℃，光照度1000Lx,光照4～16h/d 的条件下 培养，经1-2个月后在培养基上出现肉眼可见的细胞团。细胞团长到 2～4mm左右，即可转移到分化培养基上，诱导分化芽和根，长成小 植株。
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• 原生质体的分离
➢ 取黄瓜无菌苗子叶，切成薄片后，置于酶液中和摇床上（60～70rpm），在 25～28℃黑暗条件下，酶解5～7h,用200目网过滤除去未完全消化的残渣。 在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清。加入3～ 4ml l3％CPW洗液，相同 条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液。用滴管将混有原生质体的1ml洗 液吸也，轻轻铺于20％蔗糖溶液上(5ml离心管装3m120％蔗糖溶液)，在 1000rpm条件下离心5—10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态 好的原生质体漂浮在20％的蔗糖与13％ CPW之间，破碎的细胞残渣沉入管 底。
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原生质体融合后培养
• 原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上 应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动 细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织 或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的 培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是 最关键的环节。
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3.实验材料、用品
• 植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露 细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离 原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要 由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、 半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
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原生质融合
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• 许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证 明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法：
(9) 0.1% HgCl2
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4.实验步骤
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• 溶液及培养基的配制
• 黄瓜无菌苗的培养
➢ 精选饱满的黄瓜种子，浸种20～30min后，用0.1% HgCl2表面消毒8～10min，无菌水洗涤4～5次，剥皮， 种子接入1/2MS培养基中。置于温度25±2℃，光照度 1000Lx,光照14～16h/d 的条件下培养。培养时间约1周。
KH2PO4 101.0 mg／L KNO3 1480．0 mg／L
CaCl2·2H2O 246．0 mg／L
MgSO4 0．16 mg／L KI 0．025 mg／L
CuSO4 13％ W／V甘露醇
pH 6.0
(4)20％蔗糖溶液 (5)黄瓜种子萌发与生根培养基 （固体）：1/2MS（注：MS无 机成份减半，蔗糖0.2%,琼脂 0.7%） (6)黄瓜原生质体形成愈伤组织培 养基(固体和液体)： MS+0.05mg/L NAA+1mg/L BA (7)黄瓜原生质体愈伤组织分化培 养基(固体)：MS+5mg/L NAA (8) 无菌蒸馏水
1％纤维素酶 1％果胶酶 0.7mol/L甘露醇
0.7mmol/LKH2PO4 10mmol/LCaCl2·2H 2O pH6.8—7.0
40% PEG (MW 1500-6000) 0.3 mol/L葡萄糖 3.5mmol/L CaCl2·2H2O 0.7mm0l/L KH2PO4
27．2 mg／L
➢ 用200μl移液器轻轻将状态好的原生质体吸出(注意尽可能不要吸入下层的蔗 糖溶液)，放入另一干净的离心管中．加4ml l3％CPW洗液，1000rpm离心 2-5分钟，弃上清．用血球计数板调整原生质体密度为105一106/ml之间。
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• 原生质体融合
➢ 将1-2滴原生质体混合物（密度分别为105一106/ml）滴 入小培养皿，静置8—10分钟。相对方向加入2滴40％的 PEG溶液，静置10分钟，依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml含13％甘露醇的CPW洗液洗涤，注意在第二、 三次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸 干，否则原生质体破碎死亡；最后用液体培养基洗l一2次 即可进行培养：