原生质体培养要求和融合

原生质体融合的操作流程和程序下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!原生质体融合是将两个不同物种的原生质体融合在一起，形成杂种细胞的过程。

细菌原生质体融合实验步骤一、实验目的了解原生质体融合技术的原理。

学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。

二、实验原理原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径，但有些微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的限制。

1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。

由于它具有许多特殊优点，所以，目前已为国内外微生物育种工作所广泛研究和应用。

(一)、原生质体融合的优点(1)、克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。

由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。

(2)、基因重组频率高，重组类型多。

原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。

原生质体融合后，两个亲株的整套基因组(包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。

(3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。

(4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。

(二)、原生质体融合步骤(1)、选择亲本选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。

(2)、制备原生质体经溶菌酶除去细胞壁，释放出原生质体，并置高渗液中维持其稳定。

(3)、促融合聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。

聚乙二醇为一种表面活性剂，能强制性的促进原生质体融合。

在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时，更能促进融合。

(4)、原生质体再生原生质体已失去细胞壁，虽有生物活性，但在普通培养基上不生长，必须涂布在再生培养基上，使之再生。

(5)、检出融合子利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。

(6)、融合子筛选产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛选出生产性能良好的融合子。

原生质体融合操作方法
原生质体融合是将两个或更多的细胞融合在一起，以形成单一的细胞。

在实验室中，原生质体融合可用于合成杂交细胞或研究细胞膜蛋白质交互作用。

以下是一种常用的原生质体融合操作方法：
1. 制备原生质体：收获新鲜的植物细胞并环绕其周围的细胞壁。

用酶类解除细胞壁以获得原生质体。

2. 制备混合物：在离心管中将两种原生质体混合并加入缓冲液。

3. 让细胞融合：通过高渗透压或电脉冲使膜破裂或局部破损，让细胞形成互通。

4. 分离融合物：将融合物分离出来，并放在一个合适的培养基上培养。

5. 检测融合结果：使用显微镜观察细胞是否真正融合，或使用特定的抗体标记来检测融合后的细胞表面分子。

需要注意的是，原生质体融合需要谨慎操作，避免损坏细胞结构或引入杂质。

在实验中，需要仔细选择不同类型的原生质体，以确保它们能够融合。

原生质体培养与细胞融合第一节原生质体培养一、原生质体的培养概况1、概念：植物的原生质体：指除去细胞壁以后的裸露细胞。

原生质体培养：是将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进而细胞进行持续分裂形成细胞团，进一步生长形成愈伤组织或胚状体，最后分化或发育形成完整植株的过程。

原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。

原生质培养首先在烟草上获得成功。

2、原生质体培养的意义①比较容易摄取外来的遗传物质（壁中有活性很强的核酸酶）—研究植物原生质体培养和再生植株技术，有可能采用细胞遗传工程的方法培育出新品种。

②便于进行细胞融合，形成杂交细胞—可广泛地重组植物界优良遗传性状，创造新物种和新品种（如能固N的禾本科植物，高光效植物，高抗植物）③原生质体可作为遗传理论研究的材料—细胞生物学、植物生理学、遗传学、分子生物学等，如细胞起源、壁生物合成、胞间相互作用、不亲和性、激素作用机理等3、原生质体培养程序取材→预处理→分离→纯化→活力检测→培养→细胞壁再生→细胞分裂分化→愈伤组织→愈伤分化→再生植株取材：大田叶片（消毒灭菌）、无菌试管苗叶片、愈伤组织或悬浮细胞预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。

二、原生质体的分离和纯化1 原生质体的分离叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。

细胞壁主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质等。

分离原生质的方法主要有以下两种：机械法和酶解法（1）机械法①首先将细胞放在高渗的糖溶液中（水势低），使细胞发生质壁分离（细胞失水），原生质体收缩成球状；②破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。

最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。

（缺点）获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。

一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。

第二节原生质体融合育种一. 原生质体融合育种的特点原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG) 助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生两套基因组之间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重组体。

原生质体融合技术具有7 个方面的优点：杂交频率较高：由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时又加入了融合促进剂PEG ，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。

已知霉菌与放线菌的融合频率为10 -3 ～10-1，细菌与酵母的融合频率亦达到10 -3 ～10-6。

受接合型或致育性的限制较小：由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。

另外，由于原生质体融合是和“性”没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制比较小。

重组体种类较多：由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触，可以有机会发生多次交换，所以可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体。

遗传物质的传递更为完整：由于原生质体融合是两个亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，因此遗传物质的交换更为完整。

原核微生物中可以得到将两个或更多个完整的基因组携带到一起的融合产物，放线菌中甚至能形成短暂或拟双倍体的融合产物，而在真菌中能形成短暂的或稳定的杂合二倍体甚至三倍体或四倍体等多倍体。

可获得性状优良的重组体：与其它的育种方法相结合，将从其它方法获得的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。

例如，唐沢昌彦等将氨基酸生产菌AJ3419(AEC r+ile-)与Bl-4(AHV r +lys-) 的原生质体融合，获得了苏氨酸高产菌AJ11812(AEC r+AHV r+ile-+lys-) ，该菌的苏氨酸产量较亲株提高了1 倍。

植物细胞原生质体的制备与融合。

1、相关概念：（1）原生质体：是指那些已去除全部细胞壁的细胞。

细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。

此外，在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。

（2）原生质体融合：即体细胞杂交。

用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。

若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。

2、原生质体的制备：在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。

在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。

如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。

游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。

基本程序如下：取材→除菌→酶解（加酶、渗透压稳定剂）→原生质体的收集与纯化→洗涤→原生质体活力的测定。

（1）取材与除菌：原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。

但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣。

因为，由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。

常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。

对外植体的除菌要因材而异，悬浮培养细胞一般无需除菌。

对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2-3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。

最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。

（2）酶解：现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。

①配制酶解反应液:反应液应是一种pH值在5.5-5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3%-3.0%以及渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等。

③酶解：除菌绿。

反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。

经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。

原生质体的分离、融合与培养一、实验目的1.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理。

2.掌握植物原生质体分离、融合和培养的基本过程。

3.了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。

二、实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。

其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。

许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法。

PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。

PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。

在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。

三、实验材料、试剂与仪器1．材料新鲜的菠菜叶片2．试剂（1）酶液：依次加入 1.25%纤维素酶、0.3%果胶酶、0.04%甘露醇、20mmol/LKCl和20mmol/L2-吗啉乙磺酸（MES），55℃水浴10min，冷却至室温，再加10mmol/LCaCL2、5mmol/Lβ-巯基乙醇和0.1%BSA，0.45um微孔滤膜过滤，溶液呈透明橙色。

（2）PEG溶液：4GpPEG4000\3mL去离子水、2.5mL0.8mol/L甘露醇和1mL1mol/L CaCL2。

（3）MMg溶液：0.4mol/L甘露醇、15mmol/LMgCl2、mmol/LCaCl2和4mmol/LMES。

细胞生物学综合性实验课程名称: 细胞生物学实验姓名:班级:学号:时间: 年月日植物原生质体的分离、纯化及融合1 材料、试剂与方法1.1材料菠菜叶片,唐古特白刺愈伤组织,金盏菊花瓣。

1.2 试剂5%次氯酸钠,无菌水,酶液A,0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液,20%蔗糖溶液，0.16 mol/L的Cacl2.2H2O溶液，酶液B,12%蔗糖溶液，PEG溶液，高PH高钙稀释液。

1.3方法1.3.1菠菜叶片和金盏菊花瓣的消毒处理称取金盏菊花瓣1.5g或菠菜叶1g,用自来水冲洗;分别用5%次氯酸钠溶液浸泡10分钟，再用无菌水洗4次。

1.3.2 原生质体的分离1.将消毒后的金盏菊花瓣用镊子撕成细丝。

2.酶解：加5ml酶液A,封口，保持28℃,3-6小时。

3.过滤及离心：600r/min离心5min,弃去上清液保留沉淀。

1.3.3 原生质体的纯化1.将沉淀用2ml 0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮。

2.用注射器缓缓向离心管底部6ml 20%蔗糖溶液,600r/min离心5min,得到原生质带。

3.用注射器吸出管底杂质和蔗糖及上部Cacl2.2H2O溶液。

4.留下的原生质带用5ml 0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮, 600r/min离心5min。

5.用3ml 0.16mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮。

1.3.4 原生质体的融合1.将菠菜叶和金盏菊的原生质体悬液等量混合。

2.用吸管将混合的原生质体混合液滴在培养皿中，7-8滴每皿，静置10min,使其贴壁。

3.用吸管将等量的PEG溶液滴在原生质液滴上，静置10-15min 观察细胞的粘连。

4.用刻度吸管向原生质液滴慢慢加入高PH高钙稀释液。

第一次0.5ml,第二次1ml，第三四次各2ml,每次间隔5min。

5.平皿微倾斜，吸取上清液，缓缓加入4ml高PH高钙稀释液,静置5min后弃去上清液。

6.加入MS培养基4ml, 静置5min后弃去上清液。

原生质体融合注意事项
（1）事先做好两种原生质体融合的识别标记，如色素、缺陷型、抗性标记等。

（2）原生质体或细胞密度应在105个/ml，两种原生质体或细胞按1： 1等量混合
（3）PEG诱导融合的效果，同分子量大小及浓度高低密切相关。

分子量和浓度愈大，促进细胞融合的能力愈高，而其粘度及对细胞的毒性也随之增大，故通常以选用分子4000-6000浓度30-50%的PEG进行融合为宜。

（4）PEG使细胞融合或致死剂量界限很狭小，为达到成功有效的融合，还必须严格掌握PEG的处理时间。

一般加入PEG 后，24 T培育10-20min （注意时间宜短不宜长，过长使原生质体周围包裹一层膜形成凝集体，降低融合率），缓缓加入高钙离子溶液15min后用冲洗液清洗，离心收集细胞或原生质体。