枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化

毕业设计(论文)课题名称枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究2014 年 5 月 15 日目录摘要 (2)Abstract (3)1 前言 (4)2 材料与方法 (7)2.1 实验试剂与材料 (7)2.2 主要仪器与设备 (7)2.3 试验方法 (8)3 结果与分析 (8)3.1枯草芽孢杆菌的标准曲 (9)3.2单因素试验结果 (10)3.3 正交试验结果分析 (13)4 结论和讨论 (15)5参考文献 (16)6致谢 (17)枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究摘要本文通过单因素实验和正交试验研究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的发酵条件（PH、温度、时间、接种量）对枯草芽孢杆菌生长量的影响。

本实验的枯草芽孢杆菌在BPG液体培养基上培养，通过单因实验及正交试验得到最佳的发酵培养条件为：初始pH 7.0；温度35℃；时间20h；接种量为5%。

在此培养条件下的活菌液量为 3.785×107CFU/ml，相比在LB培养基下培养时的活菌液量3.2×106CFU/ml提高了10倍左右。

关键字：枯草芽孢杆菌；正交试验；生长量Optimization study of bacillus subtilis cultureconditionsAbstractIn this paper, we study Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) fermentation conditions (PH, temperature, time, quantity of) the impact on the growth of Bacillus subtilis. The experiment of bacillus subtilis in combined cultivated in liquid medium, is obtained by single for experiment and the orthogonal experiment the best fermentation culture conditions as follows: the initial PH 7.0. Temperature 35 ℃; Time 20 h; Inoculation quantity was 5%. Under the condition of the cultivation of the best amount of bacterium fluid is 3.785 x 107 cfu/ml, compared to when cultured in LB medium under the microbial quantity: 3.231 x 107 cfu/ml by about 10 times.Key words: Bacillus subtilis; Culture conditions; increment1前言枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种好氧性产芽孢杆状细菌(G+)[1]，其基本特征：杆菌：一般0.7-0.8×2.0-3.0 µm，电子显微镜测量为0.5-0.6×1.1-3.5 µm，着色均匀，无荚膜，周生鞭毛，能运动。

枯草芽孢杆菌HS09产芽孢发酵培养基的优化作者：***来源：《福建农业科技》2020年第10期摘要：枯草芽孢桿菌HS09具备较好益生菌性能，已作为微生态菌剂应用于水产养殖业。

为了提高菌株HS09产芽孢发酵水平，以芽孢产量为指标，通过单因素试验及正交试验对枯草芽孢杆菌HS09产芽孢发酵培养基的碳源、氮源进行筛选及优化，确定最佳发酵培养基。

结果表明：影响枯草芽孢杆菌HS09芽孢产量的主次因素为玉米粉>硫酸铵>葡萄糖。

枯草芽孢杆菌HS09产芽孢发酵优化培养基为葡萄糖10 g·L-1、硫酸铵8 g·L-1、玉米粉15 g·L-1、硫酸镁0.5 g·L-1、硫酸锰0.5 g·L-1、磷酸氢二钾1 g·L-1 、磷酸二氢钾2 g·L-1、碳酸钙3 g·L-1;以最佳产孢发酵培养基进行200 L发酵罐放大发酵，发酵有效菌落数可达4.3×109 cfu·mL-1，实现芽孢90%高转化率。

该研究结果可为菌株工业化生产提供参考依据。

关键词：枯草芽孢杆菌;培养基;优化;正交试验中图分类号：TQ920文献标志码：A文章编号：0253-2301（2020）10-0016-06DOI： 10.13651/ki.fjnykj.2020.10.03Abstract： Bacillus subtilis HS09 has good probiotic performance and has been used as a microbial agent in aquaculture industry. In order to improve the spore-producing fermentation level of the strain HS09， with the spore yield as the index， the carbon and nitrogen sources of the fermentation medium of spore produced by Bacillus subtilis HS09 were screened and optimized by single factor tests and orthogonal experiments to determine the best fermentation medium. The results showed that the primary and secondary factors affecting the spore yield of Bacillus subtilis HS09 were in order as follows： corn flour， ammonium sulfate and glucose. The optimized fermentation medium of spore produced by Bacillus subtilis HS09 was as follows： glucose 10 g·L-1，ammonium sulfate 8 g·L-1， corn flour 15 g·L-1， magnesium sulfate 0.5 g·L-1， manganese sulfate 0.5 g·L-1， dipotassium phosphate 1 g·L-1， monopotassium phosphate 2 g·L-1， and calcium carbonate 3 g·L-1. The optimal spore-producing fermentation medium was used for the amplified fermentation in 200 L fermentation tank， and the effective clump count of fermentation could reach 4.3×109 cfu·mL-1， achieving a high conversion rate of 90% of spore. The results of this study could provide reference for the industrial production of the strains.Key words： Bacillus subtilis;Culture medium;Optimization;Orthogonal experiment枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis是芽孢杆菌属的一种腐生细菌，由于发酵能够产生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶等十几种酶[1]，是重要的微生态益生菌。

产鸟苷的枯草芽孢杆菌G3发酵特性分析及条件优化鸟苷是食品增味剂鸟苷酸和抗病毒药品(如利巴韦林等)的前体物,具有广阔的市场前景。

由于微生物发酵法具有成本低、环境污染小且经济效益高等优点,已成为鸟苷的主要生产方式。

微生物的鸟苷发酵性能受很多因素影响,提高产量并降低成本是鸟苷发酵工业研究热点。

本文以产鸟苷的枯草芽孢杆菌G3为对象,通过分析该菌株的发酵特性,确定主要影响因素,并对这些因素进行优化,以期提高鸟苷产量并降低成本。

取得的主要研究结果如下:(1)建立了鸟苷、次黄嘌呤及肌苷的高效液相检测方法。

确定采用ZORBAX SB-Aq C18柱,流动相为乙腈和水,紫外检测波长248nm,流速为1 mL/min,并优化了色谱条件。

在乙腈和水的比例为1:99的优化色谱条件下,鸟苷、次黄嘌呤和肌苷的理论塔板数分别为50867.37、45515.64和50488.8,三者之间分离度大于1.5,实现了很好的分离。

同时,得到此条件下三种物质的线性范围分别为0.65 mg/L~65mg/L、0.35 mg/L~35 mg/L、0.85 mg/L~85 mg/L,相关系数都在0.999以上,其加样平均回收率分别为102.15%、99.16%、97.31%,且RSD值分别为1.50%、1.02%、1.25%。

上述检测方法可很好地用于鸟苷发酵过程的分析。

(2)较系统研究了枯草芽孢杆菌G3产鸟苷发酵特性。

发现鸟苷合成与菌体生长过程完全相关,确定发酵周期为60 h;同时,发现菌体可较好地利用木糖、蔗糖、甘油、葡萄糖和可溶性淀粉等,其中木糖更利于菌体生长,葡萄糖则更利于鸟苷合成;大豆蛋白胨、玉米浆和酵母浸粉能明显促进菌体生长,而谷氨酸钠、蛋白胨和豆饼水解液则明显抑制菌体生长;该菌株能很好地利用铵盐,利用硝酸盐能力低。

还发现,添加硫酸锰、磷酸二氢钾和硫酸镁均能显著提高鸟苷产量;此外,发现添加鸟苷前体物质次黄嘌呤可提高鸟苷产量。

因此,初步确定了发酵培养基为:葡萄糖140 g/L、玉米浆30 g/L、酵母浸粉15 g/L、硫酸铵9 g/L、硫酸锰0.005 g/L、硫酸镁4 g/L、磷酸二氢钾4 g/L、次黄嘌呤2 g/L。

枯草芽孢杆菌固体发酵条件优化杨婷;廖美德;贺玉广;刘偲嘉【摘要】为研究初始pH、蛋白胨浓度和不同发酵底物对枯草芽孢杆菌生长的影响,对不同发酵底物进行液态和固态发酵试验,结果发现,pH为6.5～7.0时,细菌生长最快,pH为7.5～8.0时,蛋白酶的活性最强;蛋白胨1.6 g·L-1的LB培养基,枯草芽孢杆菌的生长状况最好,蛋白酶的活力也最强;豆粕是优质氮源,能显著促进枯草芽孢杆菌的生长和蛋白酶活性,豆粕20％、豆渣10％、麸皮60％和玉米粉30％作为固态发酵底物,枯草芽孢杆菌的生长速度最快,豆粕10％、豆渣10％、麸皮50％和玉米粉10％为固态发酵底物,枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶活力最强.【期刊名称】《饲料博览》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】4页(P5-8)【关键词】枯草芽孢杆菌;发酵;正交实验【作者】杨婷;廖美德;贺玉广;刘偲嘉【作者单位】华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州510642;华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州 510642;华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州 510642;华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州 510642【正文语种】中文【中图分类】S816.6枯草芽孢杆菌是一类广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性好氧型细菌，常作为益生菌添加在幼小动物日粮中，能够起到改善动物肠道菌群结构、提高消化酶活性、改善机体免疫功能以及提高生产性能的作用，对人畜无毒害作用，不污染环境[1-2]。

枯草芽孢杆菌可产生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等，对提高动物的饲料转化率、促进营养的消化吸收和预防疾病起到重要作用[3-5]。

目前，在工业化生产中，仍然存在发酵周期长、芽孢形成率低、成本高等问题。

本文在前人的研究基础上，以玉米粉、麸皮、豆粕、豆渣为原料，旨在寻找出一种高效经济的发酵底物，获得较高的枯草芽孢杆菌产量和酸性蛋白酶活力。

第14卷第20期 南方农业 2020年7月Vol.14 No.20 South China Agriculture Jul. 2020农田中许多病害严重发生，化学防治使病原菌的抗药性增强、不断分化出新的生理小种，同时造成药物残留，对食品安全造成隐患，破坏环境。

目前，从微生物代谢物中筛选出防治有害生物的生防农药成为新农药研究的重要方向。

生物农药具有高效低毒的优点，越来越受到人类的青睐。

迄今为止，具有生物防治功能的细菌有100多种，我国和世界上许多国家已有商品化微生物农药产品。

但是，多数菌剂在田间应用过程中防效不稳，制约微生物菌剂开发应用。

此外，多数研究只是针对某一种病害，具有广谱抗性的菌株很少。

芽孢杆菌是我国农业部正式批准使用的益生菌，对抗生素无耐药性，对人畜无毒无害，绿色环保，对环境无污染，对作物安全，可产生多种抗生素，包括脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类等物质，对多种动、植物与人类病原菌具有较好的抑制作用。

而且该菌还具有很强的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶活性，并具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。

枯草芽孢杆菌作为有益的根际微生物，越来越得到人们的重视，目前在辣椒、玉米、黄瓜、水稻等农作物的病害上具有较好的生防效果。

其芽孢可以制成粉剂、添加剂等各种制剂应用于工农业等各个方面。

但是在目前的工业化生产中，常用的发酵方法中存在周期长、芽孢数含量低、成本高等诸多问题。

因此，作为微生物制剂，枯草芽孢杆菌发酵工艺的研究对其应用具有非常重要的意义。

本试验通过单因素筛选对该菌株的发酵工艺与条件进行优化，为该菌株生防菌肥的工业化生产提供参考数据。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种枯草芽孢杆菌由黑龙江农业职业技术学院分析检测中心微生物实验室筛选保存。

1.1.2 培养基种子培养基与基础发酵培养基均为LB ，即蛋白胨 10 g·L -1，酵母浸出物5 g·L -1，氯化钠10 g·L -1，自然pH 。

枯草芽孢杆菌发酵芽孢形成过程初探及干燥温度优化枯草芽孢杆菌微生态制剂因其能够产生芽孢而具有较好的适应性和抗逆性,被广泛应用于动物养殖,植物防病和水体净化等多个领域。

目前对枯草芽孢杆菌制剂的研究主要集中于如何提高有效生物量产量,但是在制备过程中培养基理化性质变化以及芽孢形成的分子机制的研究相对较少。

本文主要研究了固态发酵过程中,培养基理化性质的动态变化,芽孢形成调控基因的表达,并探讨了其与活菌数,芽孢数以及芽孢率的关系。

此外,通过优化干燥温度以进一步提高枯草芽孢杆菌有效生物量。

主要研究结果如下:（1）固态发酵体系中,发酵前48h枯草芽孢杆菌生长繁殖迅速,活菌数量达8.34×10⁹ cfu/g。

发酵24-48h过程中,菌体利用了培养基中的大量葡萄糖,葡萄糖含量由13.6 mg/g下降到6.38mg/g。

低场核磁结果表明,T₂₁峰在发酵过程中向左移动,表明菌体代谢改变了培养基结构,使得T₂₁水与培养基结合更加紧密。

发酵48-72h过程中,芽孢数增加,芽孢率达到72%,菌体对培养基中营养物质利用率降低,培养基理化性质变化较小。

（2）枯草芽孢杆菌发酵48h后芽孢数持续增加,营养体数目减少,说明菌体繁殖方式发生明显变化。

调控芽孢形成的sigF基因在发酵中期表达量提高,spo0A基因和sigE基因在发酵后期表达量提高。

以24h的基因表达量为对照,sigF基因在发酵48h时的表达量是其1.58倍。

发酵72h后spo0A基因表达量较24h提高了1.92倍,sigE基因表达量提高了89%。

（3）在60℃、70℃、80℃和90℃四种温度下对枯草芽孢杆菌制剂进行热风干燥,结果表明80℃干燥条件下,2h后有效生物量为4.85×10⁹cfu/g,明显高于其他温度。