实验四-大肠杆菌发酵培养基的优化解答

重组大肠杆菌DE-pET-P46的培养基优化和高密度发酵沈青春;宁宜宝;王芳;张纯萍;高和义;宋立;李聪研;魏晶晶;宋萧婷;苏鹏【摘要】为提高重组蛋白的生产效率，利用响应面试验设计技术，对表达猪肺炎支原体P 46蛋白的重组大肠杆菌DE-pET-P46的培养基进行了优化，确定了培养基各营养成分及其最佳配比。

在相同培养条件下，优化培养基比LB培养基的菌体浓度高出一倍。

在生物反应器中利用优化培养基发酵培养该重组大肠杆菌，培养物的湿菌重达39．5 g/L。

SDS-PAGE电泳结果显示，高密度发酵对重组大肠杆菌DE-pET-P46的rP46的表达和占细胞总蛋白比例均没有明显的改变。

%For higher efficiency and lower cost of the protein production, response surface analysis(RSA) was used for culture optimization of the recombinant E. coli which could express Mycoplasma hyopneumoniae P46 protein, and the best ratio of each medium component was determined. Under the same culture conditions, the cell concentration of the optimized culture is twice higher than LB medium. The medium used in a bioreactor for the recombinant E. coli DE-pET-P46 culture fermentation, the wet bacteria weight of the culture is up to 39.5 g/L. SDS-PAGE electrophoresis showed that there is no obvious difference on the rP46 expression of the recombinant E. coli DE-pET-P46 between cultivated with bioreactor and with shaking incubator.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2014(000)008【总页数】8页(P10-17)【关键词】猪肺炎支原体;P46蛋白;高密度发酵;响应面【作者】沈青春;宁宜宝;王芳;张纯萍;高和义;宋立;李聪研;魏晶晶;宋萧婷;苏鹏【作者单位】北京中海生物科技有限公司，北京100081; 中国兽医药品监察所，北京100081;中国兽医药品监察所，北京100081;中国兽医药品监察所，北京100081;中国兽医药品监察所，北京100081;中国兽医药品监察所，北京100081;中国兽医药品监察所，北京100081;北京中海生物科技有限公司，北京100081;北京中海生物科技有限公司，北京100081;北京中海生物科技有限公司，北京100081;北京中海生物科技有限公司，北京100081【正文语种】中文【中图分类】TQ92重组DNA技术和发酵工程的快速发展和结合，使得大量制备某种特定蛋白成为可能。

工业发酵进展微生物发酵培养基的优化微生物发酵培养基的优化方法对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。

面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期到达生产最大发酵产物的目的。

发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。

能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。

以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度〔便于下游处理〕，较高的底物转化率〔降低原料成本〕和较高的生产强度〔缩短发酵周期〕。

设计发酵培养基时还应时刻把工业应用的目的留在脑海里。

一.发酵培养基的成分现代别离的微生物绝大部分是异养型微生物，它需要碳水化合物、蛋白质和前体等物质提供能量和构成特定产物的需要。

其营养物质一般包括碳源、氮源〔有机氮源、无机氮源〕、无机盐及微量元素、生长因子、前体、产物促进和抑制剂等。

另外，在设计培养基时还必须把经济问题和原材料的供给问题等因素一起考虑在内。

此外，还要考虑所筛选的菌种来源的地点环境，比方本实验室长期从事红树林微生物的别离及其研究工作，红树林的环境处于海洋与陆地之间，所以配制培养基所用的水除了一般的去离子水外还包括陈海水。

如果在知道产物结构或者产物合成途径的情况下，我们可以有意识地加入构成产物和合成途径中所需的特定结构物质。

我们也可以结合某一菌株的特定代谢途径，加入阻遏或者促进物质，使目的产物过量合成。

例如青霉素的合成会受到赖氨酸的强烈抑制，而赖氨酸合成的前体α-氨基已二酸可以缓解赖氨酸的抑制作用，并能刺激赖氨酸的合成。

这是因为α-氨基已二酸是合成青霉素和赖氨酸的共同前体。

如果赖氨酸过量，它就会抑制这个反应途径中的第一个酶，减少α-氨基已二酸的产量，从而进一步影响青霉素的合成。

大肠杆菌发酵生产工艺优化设计实验题酶工程本文主要介绍大肠杆菌发酵生产工艺优化设计实验题的相关知识，包括实验目的、原理、方法和操作步骤等内容。

下面是本店铺为大家精心编写的4篇《大肠杆菌发酵生产工艺优化设计实验题酶工程》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。

《大肠杆菌发酵生产工艺优化设计实验题酶工程》篇1一、实验目的本实验旨在通过优化大肠杆菌发酵生产工艺，提高目标酶的产量和纯度，为工业生产提供基础数据和方法。

二、实验原理大肠杆菌是一种常用的表达宿主，广泛应用于酶工程领域。

目标酶是一种重要的工业酶，具有广泛的应用前景。

通过优化大肠杆菌发酵生产工艺，可以提高目标酶的产量和纯度，从而降低生产成本和提高产品质量。

三、实验方法1. 菌种选育：采用基因工程技术构建高产目标酶的大肠杆菌菌株，并通过筛选和鉴定确定最佳菌株。

2. 发酵条件优化：对大肠杆菌发酵生产目标酶的关键条件进行优化，包括温度、pH、碳源、氮源和诱导剂等。

3. 工艺优化设计：采用响应面法 (RSM) 对发酵工艺进行优化设计，确定最佳的发酵条件和操作参数。

4. 目标酶的分离和纯化：通过离心、过滤、沉淀等方法分离和纯化目标酶，并采用 SDS-PAGE、HPLC 等方法进行分析和鉴定。

四、实验操作步骤1. 菌种选育：构建高产目标酶的大肠杆菌菌株，筛选和鉴定最佳菌株。

2. 发酵条件优化：对大肠杆菌发酵生产目标酶的关键条件进行优化，包括温度、pH、碳源、氮源和诱导剂等。

3. 工艺优化设计：采用响应面法 (RSM) 对发酵工艺进行优化设计，确定最佳的发酵条件和操作参数。

4. 目标酶的分离和纯化：通过离心、过滤、沉淀等方法分离和纯化目标酶，并采用 SDS-PAGE、HPLC 等方法进行分析和鉴定。

五、实验结果与分析通过优化大肠杆菌发酵生产工艺，可以显著提高目标酶的产量和纯度。

响应面法 (RSM) 是一种有效的工艺优化设计方法，可以确定最佳的发酵条件和操作参数。

大肠杆菌发酵经验总结大肠杆菌发酵经验总结首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。

其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。

第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。

第四，补料过程中的碳氮比也很重要。

若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。

另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。

根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。

可以适当调整碳氮比。

大家讨论得较多的是关于代副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，现总结以下几点，并作出相应解决措施。

一、代副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。

当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。

大肠菌群培养基灭菌失败的原因分析及解决办法1.培养基配制不当：培养基是培养大肠菌群必不可少的基础。

如果培养基的配制浓度不合适，或者一些关键成分不符合要求，会导致灭菌失败。

例如，培养基的pH值过高或过低、培养基中的氧气浓度过高或过低、培养基中存在有机物残留等都可能导致灭菌失败。

2.灭菌条件不合适：灭菌的目的是杀死或去除培养基中的细菌，但同时也要确保培养基的营养成分和物理化学性质不会发生明显变化。

如果灭菌条件不合适，就会导致细菌存活或者培养基的成分发生变化。

例如，灭菌器的温度、时间、压力等参数设置不正确，或者灭菌器本身存在问题，都可能导致灭菌失败。

3.污染源：灭菌过程中的污染源是引起灭菌失败的常见原因之一、污染源可以来自多个环节，例如培养基原料的污染、试剂及器皿的污染、操作人员的不洁操作等。

一旦存在污染源，就会导致有生命力的细菌残留在培养基中，从而导致灭菌失败。

针对大肠菌群培养基灭菌失败的原因，可以采取以下解决办法：1.仔细检查培养基配制方法：重新检查培养基配制的操作步骤和所使用的试剂，确保按照正确定量、正确定制条件配制培养基。

可以参考相关文献中的配方和操作步骤。

2.购买高质量的材料：培养基原料的质量对于培养基的灭菌效果至关重要。

选择可信赖和供应商信誉好的供应商，购买高质量的培养基原料。

3.确保灭菌条件正确：灭菌器的温度、时间、压力等参数要确保正确。

可以参照灭菌器的说明书或者相关标准操作流程，设置合适的灭菌条件。

4.做好无菌操作：在培养基制备和灭菌过程中，要严格遵守无菌操作规范。

操作前要清洁和消毒操作台、器皿和工具，穿戴合适的无菌操作衣物，使用合适的无菌操作工具，如离心管离心机、孵化箱等，并经常更换工作台面的消毒液。

5.定期检测灭菌效果：定期对培养基的灭菌效果进行检测。

可以采用细菌培养方法或者灭菌指示剂进行检测，确保培养基中不含有活菌。

总结起来，大肠菌群培养基灭菌失败的原因可能是由于培养基配制不当、灭菌条件不合适和污染源等因素引起的。

“大肠杆菌的培养和分离”实验步骤的修正与优化张泽悠　（上海师范大学生命与环境科学学院　２０００３０）　茅英莎　（华东师范大学生命科学学院　上海　２０００６２）陆文妹　（浙江省台州市第一中学　３１８０００）摘　要　以“大肠杆菌的培养和分离”实验为例，修正了实验步骤中的疏漏之处，优化了实验步骤中专业词汇的表述方式，并对学生难以理解的实验步骤和现象做了相应的注释，使整个实验过程更有利于学生的学习和理解。

关键词　大肠杆菌培养与分离　实验步骤　修正优化 高考改革为“３＋３”模式，意味着选修模块的重要性将会逐渐凸显出来。

在生物学科中，选修一枟生物技术实践枠被列入选考范围，所涉及的内容基本为相关实验的原理及操作。

学生了解相关实验操作的步骤及注意事项尤其重要，而教材中的实验步骤是学生学习实验步骤与操作的基础。

本文以（浙科版）枟生物技术实践枠中的“大肠杆菌的培养和分离”实验为例，以教材中的实验步骤为基础，对其中涉及的实验操作———ＬＢ固体平面培养基的制作以及细菌的划线分离的实验步骤进行修正和优化。

１　“大肠杆菌的培养和分离”实验步骤修正在枟生物技术实践枠中详细阐述了大肠杆菌培养和分离的实验步骤，在实际操作后发现，教材介绍的实验步骤需要修正。

１．１　封口膜的使用　教材在实验步骤中提到“在两个２５０ｍＬ的三角瓶中分别装入５０ｍＬＬＢ液体培养基和５０ｍＬＬＢ固体培养基，加上封口膜”。

目前，实验室所用的封口膜材料多为ＰＰ（聚丙烯），遇明火易燃，且燃烧后会熔化，因此在使用过程中应尽量避免接触明火。

而在接下来的实验操作中，出于无菌的要求，所有的操作均要求尽量靠近酒精灯进行，实验又要求在取下封口膜时“在酒精灯旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜”。

在这种情况下，封口膜与酒精灯火焰的距离较近，封口膜可能会被点燃，存在一定的安全隐患。

微生物实验中所用的封口材料要满足密封、无菌、耐高温的要求，且不易点燃。

出于以上要求的考虑，可以在实验中选择由８层纱布绑成的棉塞。