(PPT)第六节动物胚胎干细胞的分离培养技术EmbryonicStemcells

胚胎干细胞的体外培养胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES cell)也称ES细胞,是一种存在于着床前早期胚胎中的具有全能性的细胞。

全能性即分化发育成三个胚层的组织细胞的能力。

胚胎干细胞能在体外进行培养传代,保持未分化二倍体状态以及其全能性，具有形成嵌合体动物(chimeric animal)的能力。

胚胎干细胞最早由Evans和Kaufman(1981)两人以及Martin(1981)分别从小鼠早期胚胎中分离培养成功并建立细胞系。

由于其具有全能性,故广泛用于胚胎发育及胚胎工程方面的研究。

例如在培养液中加入不同的分化因子,可定向诱导其分化发育成心肌细胞、淋巴细胞以及神经细胞,甚至可用它培养出器官；可用不同的外源性基因转染胚胎干细胞,或在胚胎干细胞水平上进行基因敲除或基因打靶,经体外筛选后建立带有目的基因的细胞系或将筛选后带有目的基因的胚胎干细胞注射到宿主着床前胚胎内,并移植到假孕母体子宫腔内使之发育成个体。

从而建立转基因动物、基因敲除动物和基因打靶动物，研究基因在分化发育过程中的表达与调控以及制备人类疾病动物模型等。

由于胚胎干细胞在体外培养过程中极易分化和失去正常二倍体核型，进而失去全能性和丧失形成嵌合体动物的能力，故需要特殊的培养条件。

目前, 由于小鼠胚胎干细胞体外培养技术最为成熟，本文将以此为例，较详细地介绍胚胎干细胞体外分离培养和鉴定等实验技术。

一、胚胎干细胞体外培养原理胚胎干细胞体外培养的原则是: 在促进胚胎干细胞增殖的同时，维持其未分化二倍体状态。

胚胎干细胞一旦分化即失去其全能性，失去二倍体正常核型的细胞则会大大降低形成嵌合体(chimera)的能力，特别是进入种系形成生殖细胞的能力。

目前体外培养胚胎干细胞的方法归纳起来有二大类：有饲养层培养法和无饲养层培养法。

有饲养层培养法主要应用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞作为饲养细胞；经丝裂霉素-C或γ-射线处理终止其分裂后制备成饲养单层(feeder layer)，将胚胎干细胞种植在这样的单层上。

.优点
干细胞应用前景非常广阔，比如可用于细胞治疗、基 因治疗、药物筛检和毒性的检测、生物体发育机制研究 等。其中最吸引人的应用，是将干细胞分化成某一特定 的细胞、组织，甚至器官，通过移植，使之再建起受损 的组织，甚至器官。比如，将干细胞在体外分化为胰岛 素细胞，注入病人胰脏中，通过增殖，构成病人新的胰 岛组织，它就可以替代病人受损的胰岛组织，使依赖注 射胰岛素维持生命的病人得到根治。人们预言，干细胞 有可能用于治疗人类几乎所有的组织坏死性或退化性疾 病，它将是人类医疗史上的一次革命。
的发生. (二)临床表现 1,有1—6个月的服药史 2,部位全口牙龈,以上下前牙区较重 3,增生呈实质性,分叶状,可覆盖大部分或全部牙冠
(三)别诊断 1,遗传性牙龈纤维瘤病: 2,增生性龈炎 (四)治疗 1,停止服用引起牙龈增生的药物是对药物性
牙龈增生的最根本的治疗. 2,去除局部刺激因素 3,局部药物治疗 4,手术治疗 5,口腔卫生宣教
随着组织工程技术的发 展，通过ES细胞体外诱导分化，还 可以培育出人造组织器官，解决目 前临床上存在的供体器官不足和器 官移植后免疫排斥的问题。
（3）ES细胞也是研究体外细胞分化 的理想材料。
ES细胞在饲养层细胞上， 或在添加抑制因子的培养液中，能 够维持不分化的状态。
在培养液中加入分化诱导因 子,就可以诱导ES细胞向不同类型的 组织细胞分化.
分 – 能发育成完整个体 类 • 多能干细胞(成体干细胞)
– 能分化出动物体内的多种组织（造血干细胞）
• 专能干细胞
– 如成肌细胞、皮肤生发层细胞等 – 能分化出特定的（一种或两种）组织
.分别指什么, 分化程度, 潜能；核全能性；目前初始化
.应用
.
.分类
干细胞可以通过以下四个途径获得： (1)从体外培养的胚胎获得； (2)从早期流产的胎儿中获得； (3)从克隆的胚胎中获得； (4)从成体中获得。

常用的排除微生物污染的方法
抗生素排除法：采用5～10倍于常用量的冲击法，加入高浓 度抗生素后作用24～48h，再换入常规培养物，有时可能奏 效。
加温除菌：根据支原体不耐热的特点，可将受支原体污染的 细胞至于41摄氏度作用5～10h（最长可达18h），以杀灭支 原体。
动物体内接种：受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或 腹腔内，利用动物的免疫功能消灭污染的微生物，而肿瘤细 胞却能在动物体内继续生长，待一定时间后从体内取出肿瘤 细胞进行培养
2、上皮型细胞：
名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同
来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：皮肤及其衍 生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤
形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形， 中有圆形核
生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层— 铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个 活动
3、游走细胞型：
呈散在生长，一般不连成片，胞质常 突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规 则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细 胞相区别。
4、多型细胞型：
有一些细胞，如神经细胞难以确定其 规律和稳定的形态，可统归于此类。
（二）悬浮型：
见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。 胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易 大量繁殖。
(二) 细胞的营养
培养基：合适的细胞培养基是体外细胞生长增 殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞 营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还 提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。
血清：血清是细胞培养液中最重要的成分之一， 含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养 成分 。
其它成分（条75%酒精泡2—3秒钟 （时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再 用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置 平皿中。

干细胞的生物学表现
远合性 干细胞向远位组织或器官内的迁移及嵌合于其内 分化性 分化性包括神经系统损伤区域内局部的微环境影响干细胞移植后的分化;骨髓和脐血 间充质干细胞向神经样细胞的分化 低抗原性 干细胞是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，具有低免疫源性
干细胞的分类-功能
1、全功能干细胞(totipotent stem cell,TSC) 由卵和精细胞的融合产生受精卵。而受精卵在形成 胚胎过程中分裂至64个细胞左右的任一细胞皆是全 能干细胞。具有发展成独立个体的能力也可以发育 成为身体内200多种细胞类型中的任何一种。 2、多功能干细胞（pluripotent stem cell） 无法发育成一个个体，但具有可以发育成多种组织 的能力的细胞 。 3、专功能干细胞（unipotent stem cell） 只能产生一种细胞类型；但是具有自更新属性。
造血干细胞
定义：造血干细胞是所有血细胞的原始细胞。 所有的血细胞都是由造血干细胞定向分化、增 殖而成 来源：主要存在于骨髓、外周血、脐带血中 特点： 造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源 形态不一致 造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天 性遗传疾病以及多发性转移性肿瘤疾病的最有 效方法。
间充质干细胞
干细胞，医学的第二次革命！
人类干细胞的分离、培养和应用研究可能是人 类生命科学研究上划时的进步，它几乎涉及所 有的生命科学和生物医药学领域。 临床疾病治疗 人造器官移植 生物制药 医疗美容
疾病
1 干细胞治疗心力衰竭 2 干细胞治疗肝硬化 3 干细胞治疗糖尿病 4 干细胞治疗小儿脑瘫 5 干细胞治疗中风后遗症 6 干细胞治疗系统性红斑狼疮
病理条件下才显出一定的自我更新潜能
增殖能力较弱，故不能完全取代胚胎干细胞