H克隆载体

目的基因T载体克隆实验步骤目的基因T载体克隆实验步骤PCR产物的T载体克隆一. 重组质粒的构建：重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。

但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

连接反应通常将两个不同大小的片断相连。

很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。

pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。

这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。

但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。

因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶二. 感受态制备原理细菌在0 C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。

三. β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。

DNA
细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的 插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；7
精品文档
基本性质
克隆载体
基本特征（或载体的构建）
原理机制
常用的载体
质粒载体
质粒能利用寄主细胞的 DNA 复制系统进行自主 复制；不相容性；可转 移性（基因工程中采用 非接合性质粒）
（1）具有合适的复制起始位点（ORI） 当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体
（2）具有合适的选择性标记基因（3） 菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能
建的含有 λ-DNA cos 序 粒。 cos 序列是 噬菌体 DNA 中将 点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具
列和质粒复制子的的特 DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 有 cos 位点的任何 DNA 分子只要在长度相当于噬菌
殊 类 型 载 体 。 能 像 序列。黏粒的组成包括质粒复制起点 体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似 -DNA 那 样 进 行 体 外包 （colE1），抗性标记（ampr）， cos 位 噬菌体λ的颗粒。因此外源 DNA 片段的克隆或替换位点（2）
单链，即 cos 位点。有 在 DNA 的非必需区插入选择标记：lacZ
可替代区，即非必需区。 基因；基因 cⅠ 失活（cI 基因：溶源
用外源 DNA 片段替代这 过程控制基因）；Spi 筛选（野生型 λ
个区域，不会影响噬菌 噬菌体在带有 P2 原噬菌体的溶源性
插入式载体
置换型载体 （取代型载 体）
1、以（+）链 DNA 为摸板，合成互补（－）链，该 M13mpn n 双链称复制型 DNA（RFDNA）。2、RFDNA 在宿主细胞 代 表 系 列 数 内能快速增殖，可增加到每个细胞约 200 个拷贝。3、 字 ② 对 单链特异的 DNA 结合蛋白结合在（+）链上，从而阻 M13mp1 的 改 断了其互补链，即（－）链的合成，这样，细胞就 进 加 上 常 用 会不断的合成（+）链 DNA 4、游离出来的（+）链 的酶切位点。 DNA 先与基因 V 的编码产物形成特异的 DNA-蛋白质 M13mp2： 复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因 V 的蛋 LacZ’ 5’端的

pMD18-TVector:•制品说明pMD18-TVector是一种高效克隆PCR产物(TACloning)的专用载体。

本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xbal和Sall识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。

因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

由于本载体以pUC18载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18载体相同的功能。

此外，本制品中的高效连接液SolutionI 可以在短时间内(约30分钟)完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。

本制品中的ControlInsert(500bp)还可以用于Control反应。

•制品内容pMD18-TVector(50ng/gl)20glX1支ControlInsert(50ng/gl)10glX1支SolutionI*30glX5支*使用时请于冰中融解。

•保存：-20°C•纯度■ControlInsert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有InsertDNA片段。

■ControlInsert经克隆后，用双脱氧测序法确认多克隆酶切位点及T碱基的存在。

•用途■进行TA克隆，克隆PCR产物。

■对克隆后的PCR产物使用BcaBESTTMSequencingPrimers、M13Primers进行DNA测序。

HJnd111AccIEciflVIbeI和mH]SmaIXinaIDigesietrb/v•计砒科宙护和。

2、具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测； 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，便于外源基因 插入；
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，