TAT-PTD的研究进展
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TAT-PTD的研究进展郭娜赵砚丽河北省人民医院麻醉科蛋白质转导结构域(protein transduction domain, PTD)或称细胞穿膜肽(cell penetrating peptides, CPPs)是一条以肽为载体的有效运输各种物质进入细胞及细胞核的系统[1]。
通过PTD携带的物质有全长蛋白质、DNA、化学药物、寡核苷酸、40 nm 磁珠和200 nm 脂质体等[2]。
目前已知的具有细胞穿膜效应的多肽序列如表1所示。
表1 具有细胞穿膜效应的多肽序列最常用的蛋白质转导结构域如：Antp43-58 (Antenapedia, 黑腹果蝇触足肽) 、TAT47-57 ( transactiviting protein, HIV-1 反式激活蛋白) 、VP22 (单纯疱疹病毒转录调节蛋白) 和Arginine-rich peptides (精氨酸富含肽) 等。
本文主要介绍TAT-PTD。
1 HIV-1 TAT-PTDTAT蛋白是HIV后期转录的调控子，是HIV-1的LTR 反式激活基因所表达的一种蛋白，可以正调控HIV-1基因组的转录和复制，在HIV 的生活史中起着极其重要的作用，对HIV的复制是必须的，TAT 有86个氨基酸残基，由长为72个氨基酸与14个氨基酸的2个外显子组成。
上个世纪80 年代末，Green和Frankel两个独立的小组同时发现TAT蛋白能够穿过培养的细胞膜进入到其他细胞中。
TAT 可以有效地介导外源物质进入细胞。
1988 年，Maurice 和Paul发现TAT 蛋白能够穿过细胞膜。
1994 年，Stephen将TAT 蛋白与其他外源蛋白用化学方法交联，成功地将外源蛋白质导入到了体外培养的细胞以及动物组织中，但以这种化学键连接后的融合蛋白在脑组织和肾脏中没有活性。
1997 年，Eric Vives 等发现剪切后的TAT 蛋白能够穿过细胞膜并在细胞核中聚集，并确定该蛋白转导的基本区段(basic domain) 为TAT 37～72 。
到1998 年，Hikaru发现TAT蛋白的PTD 区段(protein transduction domain) 与其他蛋白融合表达的蛋白质(TAT-蛋白质) 能够高效地进入体外培养的细胞，并且表现出生物学功能，具有生物学活性。
1999 年，Schwarze S. R.[3]研究发现：TAT 蛋白能够通过血脑屏障，积累到一定浓度并表现出蛋白的活性。
2000 年，Lewin 等利用TAT蛋白将直径为45nm 的包裹有磁性微球的葡聚糖导入到细胞中。
2001 年，Akiko Eguchi 等[4]利用TAT蛋白将外源基因导入到细胞，并且检测到较强的外源基因所表达的萤光素酶的活性。
近些时候，严世荣、李敬风等将TAT蛋白的PTD 区段编码基因与外源蛋白基因连接表达融合蛋白，再将其转入小鼠体内，发现融合蛋白可以快速到达体内各组织，且表现出较强生物活性。
2 机制关于蛋白质转导结构的透膜机制目前仍不十分清楚，但是已证明这种穿膜方式是不依赖于受体、通道、能量及胞吞作用。
最近一些研究表明，用D-型氨基酸替代TAT(48 - 60)的L-型氨基酸，结果发现转导效率增强了；用TAT的颠倒结构同原始结构有同样作用；而且发现在变性条件下，蛋白质转导的能力增强；人工合成的分枝多肽(Rn) 4 中精氨酸的数目与其转导效率有关；带有胍基的拟肽也有同样作用，均可转导多种类型的细胞，均说明并非受体、配体作用模式。
还有研究发现TAT(48 - 60)可以在细胞不能进行内吞的4 ℃条件下转导，用内吞作用的多种抑制剂，均不能抑制其转导作用，说明蛋白转导不是通过胞吞作用的。
另外，用叠氮钠和鱼藤酮阻止ATP产生，也不能抑制TAT(48 - 60) 衍生肽的转导作用，说明蛋白质转导并非能量依赖性。
用药物阻断细胞通道，如brefelclin A(一种高尔基体蛋白转运抑制剂) ，仍不能抑制蛋白的转导。
用PTD 碱性多肽处理细胞，并未发现细胞内乳酸脱氢酶外漏，可能不是通过膜通道进入细胞。
实验证明，在4 ℃时尽管胞吞作用已失活，但是PTD和PTD 融合蛋白仍能快速有效地进入细胞。
热力学实验证明，TAT-PTD 与细胞表面糖胺聚糖的解离系数约为1μmol/L，比同样带有负电荷的脂质膜大3个数量级。
因此，TAT-PTD 与细胞表面糖胺聚糖的结合比脂质双层膜更为可能；PTD 与三个不同的糖氨聚糖(硫酸肝素、肝素和硫酸软骨素B) 有相似的热动学结合常数( K)，但结合点数目大致与硫酸化程度有关。
研究表明，使用糖氨聚糖裂合酶选择性地降解硫酸肝素侧链，可竞争性抑制TAT 的转导。
相反，如果加入的是主要作用于肝素而基本上不作用硫酸肝素的肝素酶，只有当该酶达到较高浓度时才能对TAT的转导起抑制作用。
可以分解各种硫酸软骨素的软骨素酶A 、B 、C，以及特异性分解硫酸软骨素A和C 的软骨素酶A和C，对TAT-PTD 的转导能力没有影响。
以上结果也提示，生物膜上的糖氨聚糖可能是PTD及相关蛋白的结合位点。
细胞表面的硫酸肝素是跨膜的硫酸肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans , HSPG) 的膜外部分，这些HSPG可能是多种生物活性物质的共同受体。
在无配体存在时，HSPG在细胞表面随机分布。
当有特异性配体时，HSPG发生聚集并与细胞浆中的其他成分共同作用。
在硫酸肝素上，可能存在有PTD阳性肽的几个独立的结合位点，PTD与硫酸肝素的紧密结合并形成中性PTD-糖氨聚糖复合物，为PTD的跨膜转导提供了固相化基础，并通过HSPG相互交联，激活细胞的摄取。
这也解释了以PTD为载体介导的转运效率与细胞类型有关，因为有些细胞表面仅有少量的HSPG。
最近的一些研究表明，在细胞内PTD及其复合物存在于内吞体内。
提示细胞对PTD及其复合物的摄取可能通过细胞膜快速的静电作用，随后内吞到细胞内。
但并不排除尚存在其他摄取机制。
3 TAT-PTD与被转导物质的连接方式PTD与蛋白质、肽、寡核苷酸、DNA 及肽核酸等连接的方式有两种：非共价连接和共价连接。
非共价连接，与脂质体转运方法相似简单易行，PTDs 与寡核苷酸或DNA按一定比例混合，在室温共同孵育加入到培养细胞中，PTDs可携带寡核苷酸或DNA进入细胞。
共价连接主要有3种方法：1)化学合成，用共价键连接形成复合物或采用T4连接酶，如TAT(47-57)通过二硫键与肽核酸或锁核酸连接，进入细胞后二硫键断裂，释放出化合物发挥反义作用，在体内不被巨噬细胞吞噬，血液成分也不影响其摄取过程，在细胞内的作用时间延长；2) 间接连接途径，构建含有VP22 的目的蛋白的cDNA 表达载体，转染细胞12～24 h后，表达出融合蛋白能从转染的细胞进入周围其他细胞；3) 体外构建融合聚肽，其N端或C端带标签序列，通过大肠埃希菌表达载体产生大量的PTDs重组蛋白，进入细胞后，PTDs与蛋白质间的连接断裂，释放出的蛋白质重新折叠。
利用这种方法，已得到大量不同相对分子质量与PTDs连接的蛋白质，细胞毒性检测复合物几乎没有毒性。
4TAT-PTD 融合蛋白的制备TAT融合蛋白一般用以下的程序制备。
首先，将编码TAT-PTD 的cDNA 插入质粒(如pET32a) 中，构建TAT-PTD 的表达载体。
再将编码目的蛋白质或多肽的cDNA 插入到该载体的TAT-PTD 序列框架的下游，再将其转化入大肠杆菌中，即可表达TAT-PTD 融合蛋白。
TAT-PTD 融合蛋白少数以一种可溶的形式在细菌中被表达，但大多数是以不可溶形式出现在细菌的包含体内。
尿素可使贮存在包含体内的蛋白变性溶解。
用含有尿素的Ni2+-NTA 琼脂糖亲和柱来纯化蛋白，再用离子交换柱或凝胶过滤法除去尿素。
可以观察到变性的TAT-PTD 融合蛋白能进入几乎所有的细胞[5]。
5 TAT-PTD的不同应用目前将基因、蛋白导入细胞的方法包括磷酸钙共沉淀法、显微注射法、电击穿孔法、穿孔蛋白、ATP 处理、脂质体法、脂质转染法、细胞融合法、病毒载体转染法等，但这些方法存在着以下问题：大量细胞能否在相当长的一段时间内接受试剂的处理、是否需要外界的作用(如运用电场)、进入细胞的蛋白量有多少、各个细胞吸收的剂量是否相同、技术的可重复性有多大；细胞在处理中是否受到伤害或发生改变、效率低、需要昂贵的试剂、特殊的设备、技术复杂不易掌握、安全性等。
以上问题在一定程度上限制了这些方法的应用。
目前，大量研究表明PTD具有强大的运载潜能。
PTD 不仅可以携带多肽、GFP、RNase A、半乳糖苷酶等蛋白质，而且可以携带DNA、反义核酸、FITC、有机分子、脂质体、以及铁颗粒等无机物。
运载能力可以达到120 kD (如半乳糖苷酶)、40 nm (如铁颗粒) ，没有明显的证据表明PTD有运载极限[2]。
某些药用生物分子，如：蛋白质、DNA 及小分子化合物进入细胞内或细胞核内都要受到这些物质本身理化性质的影响。
其穿膜能力主要受以下几方面影响：脂溶性、极性、分子量。
脂溶性大、分子量小的生物分子容易穿过细胞膜；反之，极性大、分子量大的生物分子不易穿过细胞膜。
有些化合物不能直接进入细胞、细胞核内，限制了这些化合物作为药物的使用。
许多疾病的治疗需要大分子物质，如脑血管疾病常常需要神经生长因子、超氧化物歧化酶等保护剂，由于其难以透过血脑屏障，不能达到有效的治疗浓度。
因此，建立和发展高效、安全、可控、简便、实用的细胞内生物大分子导入系统和核转移体系，已经成为疾病防治的一个重要课题。
对于开发上述这些药物，PTD的发现极具意义，有着广泛的作为药物传递的前景。
在细胞及器官移植领域，目前多采用腺病毒基因转染等方法研究一些有保护作用的蛋白，但均因其病毒源性、转染复数低等问题限制其广泛应用。
PTD已经应用于AIDS 的研究，TAT-胱天蛋白酶原3 (TAT-procaspase-3) 进入到HIV感染的细胞后能够在HIV编码的特异蛋白酶的作用下切割为成熟的胱天蛋白酶3 ( caspase-3 ) ，从而诱导细胞凋亡。
在癌症研究方面，已经利用PTD携带P53蛋白诱导癌细胞的调亡，另外，在体内和/或体外还成功进行了PTD转运HSV-1 胸苷激酶、周期蛋白A(cyclin A) / cdk2 抑制肽、脂质体包被的阿霉素(Doxrubicin) 等肿瘤抑制药物的实验。
外源性GDNF能使缺血大鼠脑梗死灶体积缩小，脑水肿减轻。
Kilic 等[6]采用C57BL/6j 鼠制作MCAO 30min 再灌注模型，再灌注后10 min 尾静脉注射TAT-GDNF，3 d后处死大鼠，TTC 染色发现梗死体积明显小于GDNF组，免疫组化显示TAT-GDNF 组纹状体胱冬酶-3活性降低，存活神经元较对照组增多。
