《生物化学》教学课件：基因诊断与基因治疗-1-8

p53 是人类癌症中最常见的基因改变。 点突变、缺失插入等均可发生。 经常伴随有基因表达水平的改变。可以采用 RT-PCR 或 Northern 杂交方法检测。
抑癌基因是显性的，一般只有两个等位基因同 时发生突变才有意义。 也存在突变产物对正常基因产物功能有抑制 作用的现象。
三、外源DNA的检测
等位基因特异性寡核苷酸探针杂交
等位基因特异性寡核苷酸（ASO）：设计针 对正常和突变序列的探针，通过 PCR 技术扩 增待测基因，在严格的杂交条件下分别进行 杂交。
主要应用于固定位点的固定突变类型的检测。
SSCP
单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism):长度相同而 构象不同的单链DNA在非变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳（PAGE）中表现出不同的迁移率， 称为SSCP。
特点： 高效率，可达 10－100％。 稳定性，可介导整合，不发生丢失。 选择性，只感染分裂细胞。
Lentivirus，基于 HIV 的一种载体，具有感染 非分裂细胞的能力。
反转录病毒转移系统的组成
病毒载体：包含反转录病毒的框架的质粒。 LTR：病毒复制、转录、整合等必须。 ψ：包装信号。 外源基因与选择基因：以外源基因与 neor 等抗药性基因取代 gag-pol-env 区域。长度 不大于 8 kb。
基因治疗最初是针对遗传病的根治而提出的。 肿瘤与病毒性基因的基因治疗，导入特定基因
抵抗肿瘤生长或病毒侵袭。 基因治疗的基础：成熟的基因克隆技术以及基
因的导入与表达技术。
一、基因治疗的方法
基因治疗的前提是对疾病相关基因的克隆及其 分子机理的阐明。
有效的基因转移 (或称基因导入) 手段是基因治 疗的基础。

E
－
＋
FG
C +D E F
B A G
（五） DNA序列测定（DNA sequencing）
DNA序列自动分析
橙 ddG 绿 ddA 红
蓝 ddC
ddT
不同荧光素标记
DNA合成
毛细管电泳
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测序结果展示
序列分析用于基因诊断研究
左侧:正常
右侧:突变
（六）生物芯片（biochips）
• 基因芯片（gene chips） • 蛋白质芯片(protein chips)
PCR-SSCP分析原理示意
PCR-SSCP分析
-
+
正常人
纯合突变 杂合突变
（四）限制性片段长度多态性分析
由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切 位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同 长度或不同数量的片段，称限制性片段长度多态性 分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP） 。
2. Northern印迹杂交
RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到 固相支持物上，通过分子杂交检测特定的 mRNA分子的含量与大小。
3. 斑点杂交（dot blotting）
将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤 维素膜或尼龙膜上，用探针检测, 用于基因组 中特定基因及其表达产物的定性及定量的研 究。
（一）核酸分子杂交
按碱基互补原则, 利用标记的探针进行配对, 形 成杂合双链的过程。
核酸分子杂交流程
待测核酸制备 滤膜上核酸固化
杂交 去除未杂交的探针
核酸探针制备 探针标记
加入标记探针
检测杂交信号
1. Southern 印迹杂交

6 问题及展望
• 基因治疗的安全性问题（2次事故）:
– 靶向性；
– 基因整合位点； – 表达调控。
四、基因治疗的临床实验
1 基因标记 2 单基因疾病
基因了解 少量表达矫正作用 过度表达无不良作用 特殊细胞基因缺损 增补基因时效性
3 恶性肿瘤
（1）免疫基因治疗 （2）自杀基因系统 （3）抑癌基因 （4）裂解肿瘤病毒
4 病毒性感染
（1）增强机体的抗HIV免疫反应 （2）抑制HIV的复制
5 心血管疾病
诊断出点突变。
（2）诊断原理
在人群中，个体间DNA的核苷酸序列
存在差异，称为DNA多态性。DNA多态性
可以改变限制性内切酶的切割位点，产生
DNA限制性片段长度多态性（restriction
fragment lenth polymorphism, RFLP）。
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RFLP按照孟德尔方式遗传，在某一特定 家族中，如果某一种致病基因与特异的 多态性片段紧密连锁，就可利用这一多 态性片段作为一种遗传性标志来判断家 族成员或胎儿的基因组中是否携带致病 基因。
③ 针结合处在光胶片上呈阳性斑点
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3）mRNA的检测
（1）原理 通过对mRNA进行定量、检测其 剪接 加工的缺陷以及外显子变异等判断基因能 否转录、转录物（mRNA）是否正常以及 转录效率的高低。
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*mRNA不稳定可将其转为cDNA再用 PCR技术进行研究（RT-PCR）
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（2）应用
视网膜母细胞瘤：Rb基因缺陷
与受检者DNA 进行分子杂交
发生杂交 (纯和子 ）
均可杂交 （杂和子）
与异常 不发生杂交 与正常发生杂交
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目录
目录
基因芯片的应用
1、在诊断中的应用 核酸序列分析、基因表达分析、寻找
新基因、突变基因和基因多态性检测等 2、在药学研究中的应用
药物筛选、药物作用机制研究、耐药 菌株、药敏检测、毒理学研究、环境化 学毒物的筛选、基因扫描等
目录
（五）、DNA指纹(DNA fingerprint)
在人基因组DNA中有高度可变的“小卫星” 区域，采用“小卫星”基因探针，在同一限 制酶切产物的DNA杂交图谱上，同一个体不 同组织来源的DNA的谱带完全一致，而不同 个体之间（同卵双生除外）谱带都不相同， 如同人的指纹具有高度个体特异性一样，因 此这种杂交图谱被称为DNA指纹或遗传指纹 （genetic fingerprint）。
tandem repeat）
目录
单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism, SSCP)
SSCP是指相同长度的单链DNA因其碱 基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能 形成不同的空间构象，从而在中性聚丙烯 酰胺凝胶电泳时泳动速率不同的现象。
目录
PCR-SSCP分析
常规PCR、巢式PCR、多重 PCR、多种PCR、不对称PCR、反 转录PCR、定量反转录PCR、 mRNA差异显示PCR、原位PCR、 实时PCR等等。
目录
3、在PCR技术基础上的常用基因诊断方法
PCR-SSCP法* PCR-ASO法 PCR-RFLP法 PCR-限制酶谱法 PCR-STR（短串联重复序列，short
第二十一章
基因诊断与基因治疗
Genetic Diagnosis and Gene Therapy
目录
基因(gene)
基因是为生物活性产物编码的 DNA功能片断，这些产物主要是蛋 白质或各种RNA。