基因诊断与基因治疗

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（1）DNA模板的变性 DNA模板的变性 模板的
将待扩增DNA加热到95 左右，使双链DNA DNA解开成 将待扩增DNA加热到950C左右，使双链DNA解开成 DNA加热到
使模板DNA或延伸后的双链DNA DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 为单链（即：使模板DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 ），
PCR技术在模板、dNTP、Mg2+等条件下，用耐热 技术在模板、dNTP、 等条件下， 技术在模板 Taq酶代替DNA聚合酶 用合成的DNA引物代替RNA 酶代替DNA聚合酶， DNA引物代替RNA引 的Taq酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引 经过DNA变性、引物与模板结合 复性）和延伸3 DNA变性 模板结合（ 物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3 个步骤的循环过程（25∼30个循环），目的DNA可 个循环），目的DNA 个步骤的循环过程（25∼30个循环），目的DNA可扩增 100万倍以上 万倍以上。 100万倍以上。
并游离于反应体系中作为模板； 并游离于反应体系中作为模板；
（2）模板与引物的结合（退火或复性） 模板与引物的结合（退火或复性）
将体系温度降至合适温度（ 左右） 将体系温度降至合适温度 （ 550C 左右 ） ， 使加入 的引物与模板DNA两端 碱基序列互补结合。 的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。 DNA两端（
固 相 支 持 物
B
本法优点： 本法优点：
16 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。
situ） （6）原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交， 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交， 进而检测特异的DNA RNA序列 DNA或 序列。 进而检测特异的DNA或RNA序列。 有 细胞原位杂交 组织切片原位杂交 三类杂交
是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶， 可在 聚合酶， 是从耐热细菌体内提取的一种 聚合酶 95℃稳定 分钟。从而保证 分钟。 ℃稳定30分钟 从而保证PCR在[94℃变性→ 55℃退 在 94℃变性→ ℃ 71℃延伸]循环30次过程中不变性失活 次过程中不变性失活。 火→71℃延伸]循环 次过程中不变性失活。 聚合酶应用最广泛。 在PCR中，Taq DNA聚合酶应用最广泛。 中 聚合酶应用最广泛
（1） 模板 以线性DNA模板为佳，量适中，一般为10 个拷贝； 以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102∼105个拷贝； DNA模板为佳 RNA作为模板时，需要： RNA作为模板时，需要： 作为模板时 RNA
逆转录
cDNA
PCR, 称此为RT-PCR. 称此为RT PCR. RT-
DNA聚合酶 聚合酶) （2）耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 耐热DNA聚合酶( DNA聚合酶
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（3）斑点杂交或狭缝杂交法： 斑点杂交或狭缝杂交法：
基本过程： 基本过程： 将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→ 将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→ DNA 直接点到固相支持滤膜上 用标记探针与之杂交→自显影或显色反应→ 用标记探针与之杂交→自显影或显色反应→检测杂 交信号→分析结果。 交信号→分析结果。 优点： 优点： 简便、快速、灵敏、样本用量少； 简便、快速、灵敏、样本用量少； 缺点： 缺点： 特异性不高，有一定比例的假阳性。 特异性不高，有一定比例的假阳性。
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2.核酸分子杂交（固相杂交） 2.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序 核酸分子杂交
制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化DNA片段 分离、变性、转移、固化 片段 预杂交 制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针
杂交 漂洗去除未参与杂交的标记探针 检测杂交信号
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3. 常用固相核酸杂交方法
印迹杂交法（ Southern 印迹杂交法（Southern blotting ） 印迹杂交法（ Northern 印迹杂交法（Northern blotting ） 斑点杂交或狭缝杂交法 hybridization） （Spot/ Slot blot hybridization） 菌落杂交（ hybridization） 菌落杂交（colony hybridization） 夹心杂交法（ hybridization） 夹心杂交法（sanwich hybridization） 原位杂交（ situ） 原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）
• DNA:DNA
hybridization 5’ A T G C C G A T 3’ T A C G G C 5’ A T G C G T A 3’ U A C G C A U 5’ A U G C U A C G 3’ U A C G A U G C
DNA:RNA
RNA:RNA
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利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理 原理， 利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理， 碱基互补 可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针 用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针， 可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待 测样本中的单链核酸互补配对， 测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同 源核酸序列的存在。 源核酸序列的存在。 核酸探针 是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与 或 片断， 是指带有标记的某一特定 片断 待测样本中单链核酸分子互补配对结合， 待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同 源序列。 源序列。 探针标记物 有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、 放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、 荧光素等）两大类。 荧光素等）两大类。 8
1.核酸分子杂交的分类 1.核酸分子杂交的分类
液相杂交： 液相杂交： 待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中 进行杂交反应； 进行杂交反应； 固相杂交： 固相杂交： 待测核酸样本先结合到固相支持物上， 待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶 液中的特异性探针进行杂交反应。 液中的特异性探针进行杂交反应。 常用固相杂交支持物： 常用固相杂交支持物： 硝酸纤维素膜、尼龙膜等－－－ 硝酸纤维素膜、尼龙膜等－－－
按照上述步骤重复操作， 产物呈指数扩增。 按照上述步骤重复操作，PCR产物呈指数扩增。 产物呈指数扩增 模板DNA 扩增倍数 扩增倍数T=2n (n: 循环次数)。 模板 。
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PCR技术原理示意图 PCR技术原理示意图
21
2.
PCR各要素及其作用 PCR各要素及其作用
PCR模板可以是DNA或RNA。 PCR模板可以是DNA或RNA。 模板可以是DNA
3
基因诊断特点 特点： 二. 基因诊断特点：
针对性强， 针对性强，特异性高 检测灵敏度和精确性高 实用性强， 实用性强，诊断范围广
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三.
基因诊断常用技术方法
核酸分子杂交技术 聚合酶链反应（PCR）技术 聚合酶链反应（PCR） 生物芯片 基因测序
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（一）核酸分子杂交技术
核酸分子杂交 是指单链核酸分子（ 是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下， 或 ）在特定条件下， 与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。 与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。 主要依据： 碱基互补、 主要依据： 碱基互补、变性和复性 碱基互补 变性： 变性： 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性： 复性： 随温度逐渐恢复， 随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链 6 DNA与DNA杂交 A=T、 DNA与DNA杂交： A=T、 G≡C ; 杂交： DNA与RNA杂交 A=U、 G≡C ; 与 杂交: 杂交 、
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（4）菌落杂交（colony
hybridization） hybridization）
该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。
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hybridization） （5）夹心杂交法（sanwich hybridization） RE
A A A
片断A 片断 检测探针
RE
B B
片段B捕捉探针 片段 捕捉探针
基因诊断与基因治疗
(gene diagnosis and therapy)
本章讨论二大方面内容
基因诊断 基因治疗
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第一节
一.
基 因 诊 断
基因诊断概念 基因诊断概念 ：
利用现代分子生物学和分子遗传学 的技术方法， 的技术方法，直接检测基因结构及其表 达水平是否异常， 达水平是否异常，从而对疾病作出诊断 的方法。 的方法。
PCR是体外基因扩增技术。它利用体内DNA复制的 PCR是体外基因扩增技术。它利用体内DNA复制的 是体外基因扩增技术 DNA 原理和DNA变性与复性的性质进行目的基因DNA DNA变性与复性的性质进行目的基因DNA的大量 原理和DNA变性与复性的性质进行目的基因DNA的大量 扩增。 扩增。
1.
PCR基本原理： PCR基本原理： 基本原理
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引物设计应符合以下基本原则： 引物设计应符合以下基本原则：
长度适宜，一般为15∼ 个碱基 个碱基； ① 长度适宜，一般为 ∼30个碱基； 含量， ② G+C含量，一般为 ％∼60％； 含量 一般为40％ ％； 种碱基应随机性分布； ③ 4种碱基应随机性分布； 种碱基应随机性分布 引物自身不应存在互补序列； ④ 引物自身不应存在互补序列； 两个引物之间不应有多于4个碱基的互补 个碱基的互补； ⑤ 两个引物之间不应有多于 个碱基的互补； 引物3ˊ端不应有任何修饰； ⑥ 引物 ˊ端不应有任何修饰； 引物5ˊ可以修饰。 ⑦ 引物 ˊ可以修饰。
（其基本过程类似于上述Southern法） 其基本过程类似于上述Southern法 Southern
提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→ 提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→ RNA样本 变性 转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→ 转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影 DNA 或显色→检测信号。 或显色→检测信号。 Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或 Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA 法可用于检测组织细胞中总RNA