下载文档原格式
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养一.实验目的1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。
2 •熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。
3•了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。
二.实验原理自17世纪下半叶Robert Hooke提出"细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养(CeIl CUltUre )才逐渐发展起来。
现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。
细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。
如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。
细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传代培养。
1 .原代培养(Primary CUItUre )是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化培养法。
组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。
小鼠间充质干细胞一、细胞复苏和接种1. 37℃预热小鼠间充质干细胞培养液和基础培养液。
2. 从液氮中取出细胞产品管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。
3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭产品管外壁。
4. 将产品管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃基础培养液4－5 ml混匀，边滴加边摇匀。
5. 用1ml基础培养液冲洗产品管，并将其转移到15 ml离心管中，边滴加边摇匀。
6. 轻轻混匀细胞后，取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀，从中取10 μl计数。
7. 细胞悬液在1 000 rpm，室温条件下，离心5分钟，去除上清。
8. 加完全培养液4－5 ml，调整细胞量，轻轻混匀细胞，备用。
9. 按10 000-15 000个细胞/cm2接种细胞。
10. 每个T25培养瓶中加完全培养液3-5 ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。
二、细胞换液和培养注意：复苏或传代后的细胞，请于24小时后，第一次更换培养液。
1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后，请继续在37℃，5％CO2培养箱内培养。
2. 之后，每2-3天更换培养液1次，至细胞长到培养瓶表面的80% 可进行传代或冻存。
3. 换液前，请将培养液从4℃中取出，使其恢复到室温。
三、消化细胞1．消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，用前按1：1混合。
将PBS或D-Hank's液, 消化液，含10% FBS的基础培养液恢复到室温。
2．具体操作如下：（1）吸去培养液，加入3 ml PBS或D-Hank's液，使PBS或D-Hank's液均匀的分布在培养瓶细胞表面。
1分钟之后，吸去PBS或D-Hank's液。
（2）每个T25培养瓶加入消化液2 ml，使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验背景：一、细胞培养的基本条件：1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器4.细胞保存条件：液氮罐1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。
净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。
2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。
3.CO2培养箱：CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。
使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。
定期消毒（90 ℃，14 h)。
③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。
三、细胞培养用液的配制：1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl 8.0 gKCl 0.2 gNa2HPO4.H2O 1.56 gKH2PO4 0.20加水至1000 ml3.消化液：①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。
②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。
③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。
用滤器过滤除菌。
④胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。
⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用4.培养基：培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。
①天然培养基：天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数陈素君200900140007实验目的：了解原代培养的基本方法及操作过程。
学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制及酸碱度的调节。
初步掌握无菌操作方法。
学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。
实验原理：细胞培养是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
细胞培养的突出优点，一是便于研究各种理化因素对细胞生长发育和分化等的影响，二是细胞培养便于人们对细胞内部结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育过程的观察。
因而是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，但是不可忽略它脱离了生物机体的一些变化。
细胞培养分为原代培养和传代培养。
原代培养是指直接从动物体内获得的细胞组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养的条件下，使其不断地生长及繁殖。
要细胞能在体外长期生长，必须满足基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
台盘蓝氧化与还原型颜色不同，活细胞由于新陈代谢产生较强还原力，染色后呈无色，死细胞染色后呈蓝色。
细胞计数以显微镜计数法进行，即将少量待测样品悬浊液置于特定的具有确定容积的载玻片上（计菌器），于显微镜下直接观察计数。
细胞浓度（个/ml）=4个中等方格内的细胞总数÷4×10000×稀释倍数。
实验用品：一、器材解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管。
上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板二、试剂PBS缓冲溶液、培养液、台盘蓝三、小白鼠实验方法：1. 细胞的原代培养1.1断头法处死小鼠，将血放掉洗净，在酒精中浸泡3min消毒。
小鼠心肌细胞的原代培养注意事项
一、实验前准备
1.1 材料准备
1.2 设备准备
1.3 环境要求
二、小鼠心肌细胞的原代培养操作步骤
2.1 小鼠心肌细胞的分离和培养基的配制
2.2 小鼠心肌细胞的原代培养
三、培养基的更换和维护
3.1 培养基的更换
3.2 细胞状态观察和维护
四、实验中常见问题及解决方法
4.1 细胞污染问题及解决方法
4.2 细胞生长不良问题及解决方法
4.3 细胞死亡问题及解决方法
五、实验安全注意事项
5.1 实验室安全措施要求
5.2 实验过程中个人防护措施要求
六、实验结果的分析和记录方式
6.1 实验结果的观察和记录方式
6.2 数据处理和结果分析方法
七、实验结束后处理方式
7.1 培养皿、试管等废弃物处理方式要求7.2 试剂废弃物处理方式要求。
一、实验目的1. 掌握小鼠原代细胞培养的基本原理和操作方法；2. 了解小鼠细胞传代培养的注意事项；3. 学习使用显微镜观察小鼠细胞的生长状态；4. 熟悉细胞冻存和复苏的操作步骤。
二、实验原理小鼠细胞培养是一种在体外模拟体内生理环境，使细胞在无菌条件下生长和繁殖的技术。
细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养是指从组织中获得细胞，经过消化、分散后，在无菌条件下进行首次培养；传代培养是指将生长良好的细胞进行消化、分散后，转移到新的培养容器中进行培养。
细胞冻存和复苏是细胞保存和长期保存的重要方法。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：小鼠脾脏、胰蛋白酶、胎牛血清、培养瓶、培养皿、移液器、吸管、细胞冻存管等；2. 实验仪器：超净工作台、显微镜、细胞培养箱、离心机、冰柜等。
四、实验步骤1. 小鼠脾脏的获取与消化（1）取小鼠脾脏，置于含有胎牛血清的培养皿中；（2）用无菌剪刀将脾脏剪成小块；（3）加入适量的胰蛋白酶，置于37℃水浴锅中消化5-10分钟；（4）消化完成后，加入胎牛血清终止消化，用吸管吹打脾脏组织，使其分散成单个细胞。
2. 细胞原代培养（1）将分散好的细胞悬液接种于培养瓶中，置于培养箱中培养；（2）每天观察细胞生长状态，待细胞生长到80%以上时，进行传代培养。
3. 细胞传代培养（1）用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞；（2）将消化好的细胞悬液接种于新的培养瓶中，置于培养箱中培养；（3）重复以上步骤，进行细胞传代培养。
4. 细胞冻存和复苏（1）将细胞悬液加入冻存管中，加入适量的胎牛血清；（2）将冻存管置于-80℃冰箱中保存；（3）需要复苏细胞时，将冻存管置于37℃水浴锅中解冻，加入适量的胎牛血清；（4）将复苏后的细胞接种于培养瓶中，置于培养箱中培养。
5. 细胞观察（1）将培养好的细胞用移液器收集到培养皿中；（2）加入适量的固定液，室温固定10分钟；（3）用吸管吹打细胞，使其分散均匀；（4）用盖玻片封片，置于显微镜下观察细胞形态、生长状态等。
小鼠睾丸支持细胞的分离培养与生物学研究刘慧莲(潍坊学院生物工程学院,山东潍坊261061)摘要 [目的]分离得到高纯度的小鼠睾丸支持细胞(S e rto li ce ll ),用以研究它对精原干细胞(S SC s)生长的影响。
[方法]取鼠龄3～7d 的雄性ICR 小鼠睾丸,采用胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶和D NA 酶消化分离S e rto li 细胞及SSC s ,经多次差异离心贴壁及低渗处理法进行纯化,用S e rto li 细胞作饲养层观察SSC s 的生长情况。
[结果]S er to li 细胞纯度达90%,且以S er to li 细胞作饲养层培养SSC s ,与对照相比,能明显促进SSC s 的增殖。
[结论]四酶消化低渗处理法可获得高纯度的S e r to li 细胞,且S er to li 细胞能明显促进S SC s 的增殖。
关键词 小鼠;支持细胞;分离;精原干细胞;增殖中图分类号 Q 343 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)03-01066-03C u ltu re an d B io lo g ic a l S tud ie s on S e rto li C e lls Is o la ted from M ou s e T e s t is LI U H u i-lian (B io logy E n g in ee rin g In stitu te o f W e ifan g U n ive rs ity ,W e ifan g ,S h andon g 261061)A b s tra c t S e rto li ce lls fro mm ou se tes tis w e re iso la ted and cu ltu red to s tu dy th e e ffect o f S e r to li ce lls feede rs on m ou se spe rm a tog on ia l s te mce lls i n v it-ro .S e rto li ce lls an d spe rm a togon ia l s temce lls w e re iso la ted from3～7d ICR m ou se and su bje cted to sequ en tia l en zym a tic trea t m en t .S e rto li ce lls w ere tre a ted w ith T r is-H C l to rem ove spe rm a to gen ic ce lls an d h igh pu r ity se rto li ce lls w e re ob ta in ed .S e r to li ce lls tre a ted w ith m itom ycin C w e re u sed as feede r ce lls ,to s tu dy th e e ffect on m ou se spe rm a togon ia l stemce lls .A fter a w eek o f cu ltu re ,co m pa red w ithcon tro l ,th e re w e re m ore num be r o f spe rm a togon ia l s tem ce lls rem a in ed .M o re th an 90%o f th e S e r to li ce lls w e re iso la ted an d cu ltu red .S e r to li ce lls canprom o te p ro lifera tiono f spe rm a to gon ia l stemce lls obv iou s ly.M o re S e r to li ce lls w e re ob ta in ed th rou ghth is expe r i m en t m e th od w ith h igh pu r ifica tion.S e rto li ce lls can be u sed a s fe eder s n o t on ly to prom o te su rv iv a l bu t a lso ren ew a l o f sperm a togon ia l stemce lls .K e y w o rd s M ou se ;S e r to li ce ll ;Iso la tion ;S pe rm a to gon ia l s te mce ll ;P ro life ra tion基金项目 国家自然科学基金项目(30300182)。
