肠癌组织中抗生素检测及胃肠消化模拟

文章编号：１００７—４２８７（２０１７）１１—１９４８—０５　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｇｎ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１７，Ｖｏｌ　２１，Ｎｏ．１１　肠癌组织中抗生素检测及胃肠消化模拟　刘一楠　，王佳丽　，张同森　，陈　雷　，沙　爽　，张玉玲　，邰建东¨　（１．吉林大学第一医院结直肠肛门外科，吉林长春１３００１２；２．吉林大学环境与资源学院）　环境中普遍存在的药物残留物，已经成为潜在　的环境生态危险源。磺胺类药物是常用的一组人工　合成的、具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物总称，　具有较强的抑菌性，被广泛应用于家畜细菌传染病　的预防和治疗，同时也用来作为生长剂促进动物生　长口］。动物在使用磺胺类药物以后，部分药物将以　原型化合物或代谢产物的形式随排泄物进入生态环　境，给土壤、水体等带来不良影响，影响人类健康，其　不良后果不容忽视＿２］。由于在畜禽养殖及临床医疗　上抗生素的大量使用并不断向环境中排放，造成水　资源和土壤环境的严重污染，并诱发许多细菌产生　耐药性，对人类健康造成威胁＿３］。　体外胃肠模拟法为研究学者研究人类及动物提　供了一种简单、快速、低成本的方法，该方法广泛应　于各类物质的研究　］。该方法曾用于测试多酚、　黄酮类及咖啡黑色素抗氧化性能等　］。目前国内　外对于磺胺类抗生素已有部分研究，主要集中于磺　胺类抗生素的检测方法　、水土中的迁移转化　、抗　性基因ｌ＿】　、污染修复＿】　等方面的研究，但对于磺　胺类抗生素的胃肠消化模拟实验还未见，而已有报　道在儿童尿液中检测出磺胺类抗生素，该胃肠模拟　研究可为抗生素在人体内的消化代谢规律及肠癌致　病风险提供依据口　。　１资料与方法　１．１主要仪器　超声清洗仪、恒温水浴锅、Ａｇｉｌｅｎｔ一１２００高效液　相装置（Ａｇｉｌｅｎｔ公司，美国）、ＷＦＺ　ＵＶ一２１００型紫　外可见分光光度计（上海博迅仪器有限公司）、电子　天平（ＡＬｌ０４，ＭＥＴＴＬＥＲ　ＴＯＬＥＤＯ仪器有限公　司）。　１．２主要材料　收集我院结直肠肛门外科大肠癌手术标本共　３４例，其中男２０例，女１４例，年龄范围４５—７９岁，平　均年龄６５．２岁，体重５９—７５　ｋｇ，平均体重６５　ｋｇ。并　基金项目：本项目受吉林省财政厅应用类科研基金资助（２０１６ｓｗｓｚｘ０１７）　＊通讯作者　于距肿瘤大于５．０　ｃｍ处取材近端肠管正常组织３４　例作为对照组。　１．３药品与试剂　正己烷、乙腈（色谱纯）；乙酸、无水硫酸钠（分析　纯）、ＳＴ、ＳＭ、ＳＭ２、ＳＭＸ，磺胺药物购自ＳＩＧＭＡ公　司，纯度均大于９９．９９　；甲醇（色谱纯），甲酸，胃蛋　白酶（ＥＰ２３２—２５Ｇ）、胰蛋白酶（ＥＴ３５５—２５Ｇ）等，实验　用水为超纯水。　１．４肠部组织样本分析实验　方法：称取预处理样品５　ｇ置于离心管中，加入　无水硫酸钠２０　ｇ，乙酸一乙腈（１＋９９）混合溶剂２Ｏ　ｍｌ，超声提取３０　ｍｉｎ，残渣中加入乙酸一乙腈（１＋　９９）混合溶剂２０　ｍ１，超声提取１０　ｍｉｎ，上清液一并　转入棕色瓶中，４０℃水浴中加热破乳去上层油脂，加　入正己烷净化，氮吹浓缩ｎ　引，取下清液过０．２２　ｍ　滤膜，高效液相仪测试分析　。　１．５抗生素胃肠消化实验（表１）　１．５．１　胃消化模拟实验方法　磺胺类抗生素实验　设置一个人体模拟组（完全模拟人体环境），三个对　照组，各组除胃液、肠液成分加入不同外，其余条件　均相同。取５０Ｏ　ｍｌ棕色瓶（锡箔纸包裹），加入胃液　５０　ｍｌ，及抗生素，磺胺类抗生素初始浓度为０．２５　ｍｇ／ｍＩ　，通Ｎ　（避免空气氧化），于３７。Ｃ水浴中摇　动。在消化时间为０．５、１、１．５、２　ｈ时取上层清液经　０．２２　ｍ滤膜过滤后用ＨＰＬＣ测定。磺胺类抗生　素实验设置一个样品组，三个对照组，对照组１胃模　拟部分与样品组相同，对照组２用蒸馏水代替胃液，　对照组３用蒸馏水代替胃液中的ＨＣ１（区分酸环境　与胃蛋白酶的作用）［１７，１８３。　１．５．２肠消化模拟实验方法　胃模拟实验后，在样　品组中加入４０　ｍｌ的肠液，并用１　ｍｏｌ／Ｌ的Ｎａｉｌ—　ＣＯ。调节各溶液ｐＨ至７．５，对照组１中加入等量　０．１　ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＨＣＯ。代替肠液（区分碱性环境和　胰蛋白酶的作用），对照组２中加入４０　ｍｌ的肠液并　用１　ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＨＣＯ。调节溶液ｐＨ至７．５（只有　肠液作用）。在消化时间为０．５、１、２、３、４　ｈ时取上　层清液经０．２２　ｎｌ滤膜过滤后用ＨＰＬＣ测定［１　∞］。　中国实验诊断学２０１７年ｌ１月　第２１卷第１１期　表１各组加入胃液、肠液内物质情况　

２　结果　２．１肠部组织样本测试结果分析　

图１病患样本ＳＴ含量　１　３　５　７　９　ｎ　１３　１５　１７１９丑墨笛　园殂罄　图３病患样本ＳＭ２含量　２．２　胃肠消化模拟实验结果分析　２．２．１磺胺类抗生素的胃肠消化规律人体模拟　组（图５）模拟了整体胃肠消化过程。在胃消化阶　段，４种抗生素均在１．５ｈ时达到最大消化率，ＳＭＸ　的消化率较高为８Ｏ　，ＳＭ和ＳＴ的胃消化过程相　似，最高达到３０　，而ＳＭ２消化率仅为８　；胃消化　主要在后１　ｈ内进行。在肠模拟消化阶段，ＳＭＸ的　消化率下降至５　，再最后的２　ｈ回升至１５　，ＳＭ２　的消化率为２０　，而ＳＴ和ＳＭ肠消化初期消化率　均达到５０　以上，在肠消化后期有所下降。可见　通过对３４名病患样本进行测试分析（图１－４），　少量病患体内组织含有磺胺类抗生素，磺胺类抗生　素在正常组织部位和病患组织部位均有富集，４种　抗生素测试出峰时间分别为２．３４４ｓ、２．９６７ｓ、　３．９０７ｓ、５．３８８ｓ。受地域限制，本次病患样本多来自　东北地区，东北区某受污染的地下水土中曾有磺胺　类抗生素的检出，受污染的水土可能通过各种途径　进入人体，而影响人体健康口　，其中ＳＭ２最高检出　含量达８．０３￣ｇ／ｋｇ。　图２病患样本ＳＭ含量　１　３　５　７　９　ｎ　１３　１５　１７　１９殂国巧刀四殂弱　图４病患样本ＳＭＸ含量　

ＳＭＸ的消化主要在胃消化阶段进行，而ＳＴ、ＳＭ、　ＳＭ２的消化主要在肠消化阶段进行。　对照组１（图６）在胃消化阶段与样品组相同，而　在肠消化阶段加入０．１　ｍｏｌ／Ｉ　的ＮａＨＣＯ。代替肠　液，在胃消化阶段与样品组相似，ＳＭＸ的消化率最　高；而在肠消化阶段没有胰蛋白酶的作用时，四种磺　胺类抗生素的消化规律相似，最高消化率在５０　左　右，而在肠消化后期有所下降，可见胰蛋白酶对４种　磺胺类抗生素有一定的作用，且作用程度不同，对　ＳＭ２及ＳＭＸ的消化有一定的抑制作用，而对ＳＭ　的消化有促进作用，对ＳＴ几乎没有影响。　碍　韶　

Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｇｎ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１７，Ｖｏｌ　２１，Ｎｏ．１１　

图５人体模拟组４种抗生素消化率　图６对照组１　４种抗生素消化率　对照组２（图７）在胃模拟加入超纯水代替胃液，　４种磺胺类抗生素含量有较大波动，但在胃模拟结　束时，四种磺胺类抗衡素的残留量接近初始值，进入　到肠模拟阶段，四种抗生素消化规律相似，消化率均　在３ｈ时达到最大，没有经过胃液消化的抗生素，在　加入肠液后消化率均仅在５　９／５以下，可见在４种磺胺　类抗生素的消化过程中胃消化起着很大的作用。　丹　瓣　图７对照组２　４种抗生素消化率　２．２．２　胃肠消化酶作用规律分析　实验设置实验　组和对照组＿２引，对照组不添加磺胺类抗生素，如图　９、１０实验组和对照组的胃蛋白酶活性变化趋势相　近，实验组酶活性在０．０６／ｚｇ／ｇ左右，酶活性总体上　大于对照组。在胃模拟０．５和１．５　ｈ时磺胺类抗生　素的消化率上升时，胃蛋白酶活性也上升，可见胃蛋　白酶可以提高磺胺类抗生素的消化率。　胰蛋白酶测试同样实验设置实验组和对照组，　对照组不添加磺胺类抗生素，对照组的胰蛋白酶活　对照组３（图８）只模拟了胃消化阶段，且加入不　含ＨＣ１的胃液，与样品组对比，在仅有胃蛋白酶作　用下，各抗生素的消化率均增高，ＳＴ和ＳＭ在５５　左右，ＳＭＸ消化率最高在８０　左右，而ＳＭ２最低为　３０　左右。可见酸性环境不利于磺胺类抗生素的消　化。　

丹　瓣　

胃模拟　图８对照组３　４种抗生素消化率　

性在７Ｏ上下波动，而实验组的胰蛋白酶性变化较　大，其变化趋势与磺胺类抗生素消化率的变化趋势　相近，可见磺胺类抗生素也促使了胰蛋白酶活性的　增长。　３讨论　３．１在３４名肠癌患者中，共有２３名患者检出磺胺　类抗生素，其中有８名检出有两种磺胺类抗生素。可　见磺胺类抗生素可以通过一些途经由水土环境中进　入到人类体内，并存留，可能会对人体健康造成威胁。　中国实验诊断学２０１７年ｌ１月　第２１卷第１１期　０．０７　０．０６　Ｏ．Ｏ５　０．０４　０．０３　Ｏ．Ｏ２　０．０１　Ｏ　

一１９５１一　

图９胃蛋白酶活性变化　图１０胰蛋白酶活性变化　３．２抗生素的胃肠消化模拟实验中，ＳＭＸ在胃消　化１．５　ｈ时消化率最大为８０　９／６；在各对照实验中，胰　蛋白酶对ＳＭ２及ＳＭＸ的消化有一定的抑制作用，　而对ＳＭ的消化有促进作用，对ＳＴ几乎没有影响；　没有经过胃液消化的抗生素，在进入肠消化时消化　率均仅在５　以下，可见在四种磺胺类抗生素的消　化过程中胃消化起着很大的作用；在仅有胃蛋白酶　作用下，各抗生素的消化率均增高。　３．３通过对酶活的测定，胃蛋白酶活性及胰蛋白酶　活性与磺胺类抗生素的消化率呈正相关。　作者简介：刘一楠（１９８７一），男，硕士研究生，从事结直肠肛门　疾病的研究；邰建东（１９７２一），男，博士，副教授，从事结直肠　肛门疾病的研究。　参考文献：　Ｉ－１］郭欣妍，王娜，许静，等．５种磺胺类抗生素在土壤中的吸附　和淋溶特性ＥＪ］．环境科学学报，２０１３，３３（１１）；３０８３．　［２］Ｓｕｓａｎ　Ｄ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ．Ｗａｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｅｍｅｒｇｉｎｇ　Ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ　［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｉｓｓｕｅｓ，２００７，７９：４２９５．　［３］Ｙｏｇｅｓｈｃｈａｎｄｅｒ，Ｓａｔｉｓｈ　Ｃ　Ｇｕｐｔａ，Ｓａｇａｒ　Ｍ　Ｇｏｙａｌ，ｅｔ　ａ１．Ａｎｔｉｂｉｏｔ—　ｉｃｓ　Ｈａｓ　ｔｈｅ　ｍａｇｉｃ　ｇｏｎ［－Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ａｇ—　ｒｉｃｕｌｕｒｅ，２００７，８７：７３９．　［４］Ｃｉｎｑ－Ｍａｒｓ　ＣＤ，Ｈｕ　Ｃ，Ｋｉｔｔｓ　Ｄ　Ｄ，Ｌｉ—Ｃｈａｎ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ　ｉｎ—　ｔｏ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｏｄｅ　ｓｉｍｕｌａｔｅｄ　ｇａｓｔｒ０ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎ　ｐａｃｉｆｉｃ　ｈａｋｅ（Ｍｅｒ１ｕｃｃｉｕｓｐｒｏｄｕｃｔｕｓ）ｆｉｌｌｅｔ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ　［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，５６：４１０．　［５］ｓａｎｎａｖｅｅｒａｐｐａ　Ｔ．，Ｗｅｓｔｌｕｎｄ　Ｓ，Ｓａｎｄｂｅｒｇ，ｅｔ　ａ１．Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎｔｈｅａｎ—　ｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｙ　ｏｆ　ｈｅｒｒｉｎｇ（Ｃ１ｕｐｅａｈａｒｅｎｇｕｓ）ｐｒｅｓｓ　ｊｕｉｃｅ　ｄｕｒ—　ｉｎｇ　ａｓｉｍｕｌａｔｅｄ　ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌ—　ｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，５５：１０９７７．　［６］Ｂｅｒｍｕｄｅｚ—Ｓｏｔｏ　ＭＪ，Ｔｏｍａｓ—Ｂａｒｂｅｒａｎ￣ｅｔ　ａ１．　Ｓｔａｂ．１ｉｔｙ０ｆｐｏ１ｙｐｈｅ—　ｎｏｌｓ　ｉｎ　ｃｈｏｋｅｂｅｒｒｙ（Ａｒｏｎｉａｍｅｌａｎｏｃａｒｐａ）ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｇａｓ—　ｔｒｉｃａｎｄ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，１０２：８６５．　［７］Ｒｕｆｉａｎ—Ｈｅｎａｒｅｓ　ＪＡ，Ｍｏｒａｌｅｓ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｄｉｇｅｓ—　ｔｉｏｎ　ｏｎａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｃｏｆｆｅｅ　ｍｅｌａｎｏｉｄｉｎｓ　ａｎｄ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓｌ－Ｊ］．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，５５：１００１６．　ｒ８］Ｍａｌｉｎｔａｎ，Ｎａｎｃｙ　Ｔ，Ｍｏｈｄ１．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅｓ　ｉｎ　ｓｅ—