文件编号 SOP-QC-602 版号 B 页码1/6
1.目的
建立高效液相色谱法检测操作规程。
2.适用范围
本规程适用于高效液相色谱法试验。
3.编制依据
《药品生产质量管理规范（1998年修订）》 国家药品监督管理局（1999）
4.责任
4.1 QC质检员对本规程的实施负责。
4.2 QC主管对本规程的有效执行承担监督检查责任。
5.正文
5.1简述
5.1.1高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）是一种现代
液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将具流动相泵入装有填充剂的色谱柱，注入的
供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装
置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。
5.1.2检测器
5.1.2.1紫外检测器（Ultraviolet detector,UV） 紫外检测器是液相色谱中使用最广
泛的检测器，几乎所有的液相色谱仪都配此类检测器，是一种选择性检测器。
5.1.2.2优点：灵敏度高、噪声低、线性范围宽、对流速和温度的波动不灵敏，适用于
梯度洗脱及制备色谱。
5.1.2.3缺点：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的选择有一定限制，流动相的截止
波长必须小于检测波长。
5.1.2.4适用范围：大多数有紫外吸收的化合物。
5.2高效液相色谱仪的使用要求
5.2.1按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程
（JJG705-90）”的规定进行定期检定，应符合规定。
5.2.2仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连接，流路中无堵塞或漏液，在设定
的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。
5.2.3具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
5.3操作前的准备 文件编号 SOP-QC-602 版号 B 页码2/6
5.3.1流动相的制备
5.3.1.1用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合
科学技术创新2019.27
持续影响。可以从以下几个方面预防和消除微生物膜：3.1材质。所有和纯化水接触的部件，金属表面采用316L不锈钢；密封垫片也采用耐腐蚀性、耐温性较好的材质，如聚四氟乙烯。3.2表面处理。与纯化水接触的储罐、管道及阀门等部件，表面应进行电抛光处理，粗糙度内表面＜0.4um，外表面＜0.8um，如内表面不光洁，就会为微生物提供附着条件，导致微生物污染。3.3焊接。焊接应由具备规定资质的焊工按照既定焊接规程进行，焊接时应有含量不低于99.99%的惰性气体保护，通常采用氩弧焊，焊丝材质应与焊接主体材质一致，应有焊点图，管道焊接手工焊进行100%内窥镜检查，自动焊进行20%内窥镜检查；焊接后应进行管道进行洁净水试压、酸洗钝化、消毒清洁。3.4管道坡度。纯化水水平管道应保持有0.5~1.0%的坡度[3]，保证所有管道的水能够排净。3.5呼吸器。储罐呼吸器，使用结束后应对呼吸器进行完整性测试。3.6死角。管道的设计和安装应当避免死角、盲管；2001年ISPE水和蒸汽基准指南的主管外壁到支管阀门密封点的长度L＜3倍支管直径D。3.7流速。管道平均流速不应超出1~3m/s的流速允许范围；制药用水为满足微生物控制，工程上可以采用2~3m/s，实际上常常要求不低于0.9m/s。管道水流速度控制是为了使水流处于湍流状态，避免微生物膜的产生。3.8消毒。应对系统进行定期消毒，这是日常管理中最有效的微生物控制手段，消毒方式有许多种，如巴氏消毒、化学消毒、臭氧消毒和紫外消毒等，以下介绍两种较为常用的消毒方式。巴氏消毒是指将液体加热到一定温度并持续一段时间，以杀死可能导致疾病、变质或不需要的发酵微生物的过程。常采用80~85℃的热水循环1~2h来实现该系统的巴氏消毒。温度过低达不到消毒效果，温度过高容易使部件老化，不锈钢内表面产生红锈，不利于微生物的控制。臭氧杀菌是通过氧化作用破坏微生物膜的结构而实现杀菌效果。ISPE建议水中臭氧浓度控制在20~200ug/L，臭氧的半衰期仅为30~60min釆，目前主要采用水电解的方式产生臭氧。用254mn波长的紫外灯将臭氧从循环管网系统中完全破除，以保证使用时纯化水中无残留臭氧。若采用这种消毒方式，控制系统中应增加臭氧浓度监控。4日常管理在完成系统的安装、确认后，要对系统进行持续的水质监控。企业应建立纯化水系统的取样检测计划，取样频率可以与长期性能确认的一致；水质出现异常及时进行调查和处理，至少每年一次对纯化水性能进行评估，可根据历史数据对性能确认中制定的警戒限和行动限进行一定调整。结束语纯化水作为制药行业中的一个关键系统，微生物限度相比其他指标更易出现问题，因此应根据质量源于设计的理念，在设计阶段就考虑微生物控制，然后在建造和安装过程保持良好的施工规范，运行使用阶段定期进行清洗消毒和质量检测以及必要维护管理，这样纯化水质量就可以保持持续符合要求，为药品生产质量提供有力保证。参考文献[1]何国强，易军，张功臣.制药用水系统[M].北京：化学工业出版社，2012.[2]钱应璞.制药用水系统设计与实践[M].北京：化学工业出版社，2001.[3]医药工艺用水系统设计规范GB50913[S].北京：中国计划出版社，
在欧洲药典EP9.0、美国药典USP40-NF35的色谱法通则及2020版《中国药典》通则0512征求意见中可以找到这个问题的答案。这些通则中列出了液相色谱和气相色谱中的一些性能参数，只要符合系统适用性的要求，这些参数即使改变也无需重新验证，各国药典相关要求如下表所示：
高效液相色谱法 USP EP Chp2020
固定相 / / 不得改变固定相的理化性质，如填料材质，表面修饰及 键合相均需保持一致；从全多孔填料到表面多孔填料的 改变，在满足上述条件的前提下是被允许的
色谱柱长度 ±70% ±70% 改变色谱柱粒径和柱长后，L/dp 值(或 N 值)应在原有数值 的-25%～+50%范围内
内径 可调整，但线速度不变 ±25% /
粒径 可以减小50%，不能增加 可以减小50%，不能增加 同柱长要求
流速 ±50%，线速度不变，调整幅度可以更高 ±50% F2=F1×[(dc2 2×dp1)/(dc1 2×dp2)]，在此基础上可以根据实际 使用时系统压力和保留时间，允许流速在±50%的范围内 进行调整
柱温 ±10 ℃ ±10% 当温度有规定时，可在±10℃范围内调整
进样量 可以减小（LOD和重复性没问题） 可以减小（LOD和重复性没问题） Vinj2=Vinj1×(L2×dc2 2)/(L1×dc1 2)，并根据灵敏度的需求进行
调整。即便没有对色谱柱尺寸进行调整，进样体积也可调整以满 足系统适用性的要求
pH ±0.2 ±0.2（中性物质±1） 除另有规定外，流动相中水相 pH 值可在±0.2pH 范围内进 行调整
UV波长 不允许调整 不允许调整 不允许改变
缓冲液中盐浓度 ±10% ±10% 可在±10%范围内调整
流动相组成 少量组分（<50%）相对变化量±30%或绝对变化量为±10%，取二者较小者 少量组分相对变化量±30%或绝对变化量为±2%，取二者较小者 等度洗脱流动相比例：最小比例的流动相组分可在相对值±30%或者绝对值±2% 的范围内进行调整（两者之间选择最大值）；最小比例流动 相组分的比例需小于（100/n）%，n 为流动相中组分的个 数
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药品质量标准分析方法验证（analytical method validation）的目的是证明采用建立的方法适合于相应检测要求。在建立药品质量标准时，分析方法需经验证；在药品生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，则质量标准分析方法也需进行验证。在建立药品质量标准、变更药品生产工艺或制剂组分、修订原分析方法时，需对分析方法进行验证。方法验证的理由、过程和结果均应记载在药品质量标准起草说明或修订说明中。生物制品质量控制中采用的方法包括理化分析方法和生物学测定方法，其中理化分析方法的验证原则与化学药品基本相同，所以可参照本指导原则进行，但在进行具体验证时还需要结合生物制品的特点考虑；相对于理化分析方法而言，生物学测定方法存在更多的影响因素，因此本指导原则不涉及生物学测定方法验证的内容。
验证的分析项目有：鉴别试验、限量或定量检查、原料药或制剂中有效成分含量测定，以及制剂中其他成分（如防腐剂等，中药中其他残留物、添加剂等）的测定。药品溶出度、释放度等检查中，其溶出量等的测定方法也应进行必要验证。鉴别试验、杂质测定（限度或定量分析）、含量测定和特性参数（如：药物溶出度、释放度等）。
验证的指标有：专属性、准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。在分析方法验证中，须用标准物质进行试验。由于分析方法具有各自的特点，并随分析对象而变化，因此需要视具体情况拟订验证的指标。表 1 中列出的分析项目和相应的验证指标可供参考。
表 1 检验项目和验证指标 项目 杂质测定 鉴别 定量 限度 ＋ － 含量测定及溶 校正因
子 指标 专属性① 出量测定 ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ 准确度 精密度 ＋ ＋①③ ＋ － －
＋ ＋ ＋ － ＋ 重复性 中间精密度 － － ＋ － － ＋ ＋①③ ＋ －③② ＋ － － ＋
