自体骨髓间充质干细胞移植治疗早期1型糖尿病的实验研究
- 格式：docx
- 大小：17.14 KB
- 文档页数：4
自体骨髓间充质干细胞移植治疗早期1型糖尿病的实验研究
本研究分为二部分： 第一部分 小型猪骨髓间充质干细胞体外扩增、示踪与鉴定 1型糖尿
病（Type 1 diabetes mellitus，T1DM）是由多种病因引起的胰岛β细胞严重破坏、
胰岛素绝对缺乏所致。动物实验和临床研究表明，在T1DM早期尚残存数量不等的β细
胞，最大限度地保护残存的β细胞、改善胰岛功能对延缓并发症的发生具有明显的促进作
用，在T1DM早期存在一个短暂的、可逆转病程进展的时间窗。近年来，胰岛β细胞再
生治疗已成为T1DM研究领域的热点之一。 [目的]：通过体外扩增BMSCs满足自体干
细胞移植的需要。探讨超顺磁氧化铁纳米颗粒—多聚左旋赖氨酸复合物和增强型绿色荧光
蛋白体外标记、示踪小型猪骨髓间充质干细胞的可行性和标记方法。 [方法]：采集小型
猪骨髓，密度梯度离心法和贴壁培养法分离BMSCs。通过流式细胞术、细胞周期测定和
定向诱导分化等技术鉴定BMSCs。选用不同感染复数（Multiplicity of infection，
MOI）携带增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）
慢病毒（Lentivirus，LV）颗粒感染BMSCs，计算细胞活性、绘制细胞生长曲线和
MTT法检测判断EGFP标记对BMSCs增殖的影响，筛选恰当的MOI和标记条件。选
用超顺磁氧化铁（Superparamagnetic iron oxide，SPIO）和左旋多聚赖氨酸
（Poly—l—lysine，PLL）复合物标记BMSCs，计算细胞活性、绘制细胞生长曲线判
断SPIO标记对BMSCs增殖的影响；采用普鲁士蓝染色（Brussian blue staining）
和透射电镜观察SPIO标记情况及细胞超微结构的变化；观察不同扫描加权像对不同
SPIO标记浓度、标记时间和细胞密度的BMSCs体外MR成像的影响，筛选适当的体
外SPIO标记条件和示踪方法。 [结果]：采集、培养的BMSCs具有较强的增殖能力和
定向成脂、成骨分化潜能。流式细胞术细胞周期和表型检测显示，P2 BMSCs G1/G0
期的细胞占84.7%； P3 BMSCs CD44+细胞占99.6%，CD29+细胞82.1%，
CD45+细胞1.3%，CD34+细胞3.6%。综合判断所分离、培养细胞为BMSCs。普
鲁士蓝染色显示，Fe3+标记浓度为25 mg/L时的阳性标记率>90%，且对细胞生长
曲线和细胞活性无显著不良影响。透射电镜检测发现，SPIO标记的BMSCs细胞质中有
高密度SPIO粒子密集，以次级溶酶体内多见，细胞核等重要细胞器中未见SPIO粒子，
提示SPIO标记对BMSCs超微结构无明显影响。SPIO标记BMSCs体外MR成像与
明胶管比较显示，Fe3+标记浓度为25 mg/L、1×104/mL细胞在标记后的3wk和
6wk在TSE T1WI、TSE T2WI及FLASH T2*WI信号强度的变化率ASI依次为
12%、41%、63%和7%、28%、46%，均为后二者大于前者（分别P<0.01和
P<0.05），提示该SPIO标记浓度、该细胞密度标记后3 wk和6 wk在T2WI及
T2*WI呈现较明显的信号变化。MTT法检测显示，LV—EGFP感染复数在1：1～50：
1之间时对细胞增殖无明显影响，MOI=30：1时感染后96 h荧光表达最强，阳性感
染率为43.2%。台盼蓝拒染活性细胞计数法和细胞生长曲线显示，采用终浓度
Fe3+25 mglL和PLL0.75 mg/L标记LV—EGFP—BMSCs对细胞无明显不利影
响。 [结论]：采用上述研究方法可以获得具有较强增殖能力和分化潜能、稳定传代的
BMSCs。采用体外生物（EGFP）和物理（SPIO）双重标记的方法，结合MR成像和
细胞化学染色可以稳定地对BMSCs进行体外示踪。合适的标记浓度和方法对BMSCs
的活性、增殖和传代无明显不良影响。 第二部分 早期1型糖尿病小型猪自体骨髓间充质
干细胞移植与监测 啮齿类动物研究发现，在T1DM早期祛除致病因素、接受自体或同源
异基因骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植可逆转糖尿病进程。临床非随机—对照研究结
果表明，新发T1DM患者接受经外周静脉自体HSCs或BMMCs移植可以改善胰岛功
能，外源性胰岛素停用或明显减量。这些干预研究的探索为T1DM的治疗带来了新的希
望，但其作用机制不明。通过大型哺乳类动物自体BMSCs（ABMSCs）定向胰腺量化
移植研究有望揭示其作用机制。 [目的]：探讨ABMSCs治疗小型猪早期T1DM的有效
性、安全性及作用机制。 [方法]：3月龄健康雄性西藏小型猪9只，随机分为T1DM常
规治疗（DMC）、T1DM白体骨髓间充质干细胞移植（DMAB）及正常对照（NC）3
组。静脉注射STZ建立T1DM模型。TIDM组常规皮下注射猪胰岛素控制血糖，监测
血糖及胰岛素用量的变化。成模后4—6 wk采用Seldinger技术改良法对DMAB组
进行定向胰腺自体BMSCs移植。术后检测血常规及生化指标以评价ABMSCs的安全性。
[结果]：DMC、DMAB和NC三组之间基线体重、FBG、肝功能及肾功能指标、血常
规及血清AMY水平无统计学差异。成模后DMC和DMAB组接受皮下注射胰岛素控制
FBG在5.1—12.5 mmol/L之间。DMAB组3只动物分别于成模后5wk、4 wk
和4 wk在DSA直视下采用Seldinger技术改良法经股动脉微导管介入胰背动脉移植
SPIO和EGFP双标记ABMSCs（7.35×107、6.8×107、7.0×107个）。
DMAB组第3只动物术后3d手术切口局部出现感染，经过强化营养、血糖控制、应用
抗生素及局部处理于术后第12天切口瘢痕愈合，其余动物手术切口于术后1wk内愈合。
术后DMAB组不同时间点（术后1d、3d、1 wk及6 wk）的上述生化指标及血常规
等与基线水平比较无显著性改变。DMAB组与ABMSCs移植前1wk的T2WI加权像
比较，移植后3 wk和6 wk胰腺局部出现散在不均匀分布的低信号区，局部信号减低
的程度呈现出逐渐减弱的趋势。成模后ABMSCs前DMC、DMAB组之间及DMC组
ABMSCs前、后比较，胰岛素用量和FBG水平无显著性差异。ABMSCs术后DMAB
组FBG水平逐渐降低，3只动物分别于术后第19 d、17 d和28 d停用胰岛素，FBG
水平稳定在2.3—7.5 mmol/L之间。基线、成模后ABMSCs前和实验终点分别行
IVGTT和OGTT。IVGTT结果显示，基线水平三组动物基线水平血糖、胰岛素及C—
P曲线形态接近，1—10 min胰岛素和C—P分泌迅速增加，于1—5 min达到峰值，
10 min后分泌量迅速下降，30 min后逐渐降低，至120 min降至基础水平，血糖和
胰岛素曲线下的面积（Area under the curve，AUC）三组间无统计学差异
（P>0.05）。C—P曲线AUC DMC组和DMAB组小于NC组（P<0.01）。成模
后ABMSCs前IVGTT结果显示，DMC组和DMAB组胰岛素和C—P基础分泌及糖
负荷后的分泌呈极低水平，峰值消失，胰岛素、C—P曲线AUC小于NC组（均
P<0.01）和各组基线水平AUC（均P<0.01），DMC与DMAB组之间无统计学差
异（P>0.05）。实验结束前第三次IVGTT结果显示，DMAB组血糖曲线明显降低接
近NC组，胰岛素和C—P基础及糖负荷后分泌水平均高于DMC组，但仍明显低于NC
组，1—10 min出现分泌小高峰，峰值后延至10 min，至120 min时仍略高于基础
水平，表现为分泌高峰降低、后移，血糖曲线AUC小于同组ABMSCs前（P<0.01），
与基线水平无显著性差异，胰岛素及C—P曲线AUC均为DMC组
组血糖曲线接近。 [结论]：对小样本的小型猪早期T1DM短期研究结果提示，动脉介入
定向胰腺量化移植ABMSCs是安全的，可有效地改善胰岛功能，短期内脱离外源性胰岛
素治疗而维持血糖正常。ABMSCs移植后可能通过在胰腺着床、分化为胰岛细胞或促进
原有胰岛细胞增生、改善局部微循环等机制逆转早期T1DM进程。
