2013整理终版版植物细胞工程实验指导

植物细胞工程

实验一 常用玻璃仪器的清洗与干燥

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一、实验目的

熟悉实验室规则和玻璃器皿的领用要求，熟悉常见玻璃器皿及其用途，掌握常用玻璃器皿的洗涤、干燥及保存方法。

二、实验原理

植物细胞工程实验室经常使用的玻璃仪器和瓷器，必须要保证清洁，才能使实验得到准确的结果，学会清洗玻璃仪器，是进行实验重要的环节。 洗涤仪器的方法很多，应根据实验的要求，仪器类型、污物的性质和沾污的程度来选择。一般来说洗涤方法有刷洗或水洗、去污粉或肥皂洗、酸洗、洗液洗涤等。

用上述方法洗涤后，还要用自来水冲洗，但自来水中含有钙、镁、氯等离子实验中不允许这些杂质存在，应该再用少量的蒸馏润洗三次，以便把它们洗去。

洗净的仪器壁上不应附着不溶物、油污，这样的仪器可被水完全湿润。把仪器倒转水即顺器壁流下，器壁上只留下一层既薄又均匀的水膜，不挂水珠，这表示仪器已经洗净。

干燥的方法有烘干、烤干、风干、吹干、有机溶剂干燥等，应根据器材类型不同进行选择。

三、实验用具

玻璃仪器，烘箱、酒精灯、电吹风机；K2Cr2O7、H2SO4（浓）等；去污粉、肥皂、试管刷、试管架等。

四、实验过程

1、首先，根据实验需要选择实验仪器，列出物品领用清单

名称 规格 数量 名称 规格 数量

按照实验仪器清单，领取玻璃仪器一套。领取仪器时应仔细清点，如发现不符合规格、数量以及有破损仪器时应在洗涤前及时调换。

2. 配制洗液

如：K2Cr2O7-H2SO4洗涤液

称取重铬酸钾（粗）10g置于 400 毫升烧杯内，加入 20mL水，加热使之溶解。等冷却后，在不断搅拌下徐徐注入 175mL粗浓硫酸即成。配好的洗液应为深褐色,储于细口瓶中备用。经多次使用后洗涤效率降低时，可加入适量的KMnO4粉末即可再生。用时防止它被水稀释。

3.对已领取的玻璃仪器分类，选择合适的方法进行清洗。

（1）新的玻璃器皿应用 2%的盐酸溶液浸泡数小时，用水充分洗干净。

（2）烧杯、锥形瓶等——用毛刷蘸去污粉或合成洗涤剂刷洗——自来水洗净——蒸馏水润洗 (本着“少量、多次”的原则) 3次

（3）量筒、量杯可注入洗涤剂（合成洗涤剂或洗衣粉溶液），稍稍用力振荡或用毛刷刷洗，再用自来水冲洗至无泡沫，容量瓶、滴定管、移液管沥干水后，注入少量铬酸洗液，浸泡4-6小时或过夜，倒出洗液（倒回洗液瓶内回收或倒入用废洗液缸内统一处理），用自来水冲洗干净（不能用铬酸洗液洗涤含有乙醚的仪器，乙醚遇到洗液易发生爆炸）；最后用蒸馏水顺内外壁冲洗2—3次即可。

（4）滴定管、移液管、吸量管、容量瓶等，有精确刻度——用0.2%～0.5%的合成洗涤液或铬酸洗液浸泡几分钟（铬酸洗液收回）——自来水洗净——蒸馏水润洗3次

已洗净的仪器不能再用布或纸抹，因为布和纸的纤维会留在器壁上弄脏仪器。

4.将清洗干净的玻璃仪器依不同要求，采用不同方法（自然凉干，烘干，烤干，吹干等）进行干燥。

洗净的仪器，可以放在恒温箱内烘干（60～80度至干燥，蒸发皿可105～120度）。放置仪器时应注意使仪器的口朝下，不能倒置的仪器则应单放，应该在恒温箱的最下层，放一瓷盆，承受从仪器滴下的水珠，以免损坏电炉丝。

带有刻度的计量仪器，不能用加热的方法进行干燥，以免影响其精密度。

对于急于干燥的仪器或不适于放入烘箱的较大的仪器可用吹干的办法。通常用少量乙醇、丙酮（或最后再用乙醚）倒入已控去水分的仪器中摇洗，然后用电吹风机吹，开始用冷风吹1~2分钟，当大部分溶剂挥发后吹入热风至完全干燥，再用冷风吹去残余蒸汽，不使其又冷凝在容器内。

不急等用的仪器，可在蒸馏水冲洗后在无尘处倒置处控去水分，然后自然干燥。可用安有木钉的架子或带有透气孔的玻璃柜放置仪器。

5.将清洗，干燥过的玻璃仪器按指定位置（仪器橱、架等）存放好。

仪器在使用前、实验完毕、贮存超过规定时限后，均应进行洗涤。

五、思考题

1.为保证实验结果的准确性，实验中要用的玻璃器皿都必须洗净到器壁能被水完全润湿、不挂水珠，你对这种观点有何评论。

2. 举例说明不同的玻璃器皿、不同的污物要用不同的洗涤剂、不同的清洗方法进行清洗。 实验二 MS培养基母液的配制

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一、实验目的

通过MS培养基母液的配制与保存，掌握配制与保存MS培养基母液的基本技能。

二、实验原理

培养基是植物细胞、组织和器官吸取营养的场所。在植物细胞的分裂和分化过程中，需要各种营养物质，这些营养物质包括无机营养成分、有机营养成分、植物生长调节物质等。在对植物的器官、组织和细胞进行离体培养时，只是切取植物体的一小部分，它们无法象整体植株那样合成生长发育所需的全部物质。而自然界的植物千差万别，每一种植物都有自己独特的生理代谢过程和各自的营养需求，没有哪一种培养基能够适用于所有植物。因此，对培养基组成成分的筛选是非常重要和必不可少的程序。

MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。

优点：

（1）保证各物质成分的准确性。

（2）便于配置时快速移取。

（3）便于低温保藏。

三、实验用具

配制MS培养基母液所需要的药品、生长调节物质、各类天平、烧杯、定容瓶、量筒、药勺、小玻璃棒、蒸馏水、95%的酒精或0.1mol/L的NaOH、0.1mol/LHCL、母液瓶、标签、冰箱。

四、实验过程

（一）母液配制

1、MS大量元素母液（10X）

序号 化学药品 1升量mg/L 实际体积ml 扩大倍数 实际称量量mg

1 NH4NO3 1650

2 KNO3 1900

3 CaCl2·2H2O 440

4 MgSO4·7H2O 370

5 KH2PO4 170

除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，

CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。

2、MS微量元素母液（100X）

序号 化学药品 1升量mg/L 实际体积ml 扩大倍数 实际称量量mg

1 MnSO4·4H2O

或MnSO4·H2O 22.3或21.4

2 ZnSO4·7H2O 8.6

3 CoCl2·6H2O 0.025

4 CuSO4·5H2O 0.025

5 Na2MoO4·2H2O 0.25

6 KI 0.83

7 H3BO3 6.2

注意：CoCl2·6H2O和CuSO4·5H2O可按10倍量（0．25 mgX10=2．5 mg）或100倍量（25 mg）称取后，定容于100ml水中，每次取10ml或1ml（即含0．25 mg的量）加入到母液中。

3、MS铁盐母液（100X）

序号 化学药品 1升量mg/L 实际体积ml 扩大倍数 实际称量量mg

1 Na2·EDTA 37．3

2 FeSO4·7H2O 27.8

注意配制时，应将两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中EDTA盐较难完全溶解，可适当加热。混合时，先取一种置容量瓶（烧杯）中，然后将另一种成分边加边剧烈震荡，至产生深黄色溶液，最后定容，保存在棕色试剂瓶中。

4、MS有机物母液（100X）

序号 化学药品 1升量mg/L 实际体积ml 扩大倍数 实际称量量mg

1 烟酸 0.5

2 盐酸吡哆素（VB1） 0.1

3 盐酸硫胺素（VB6） 0.5

4 肌醇 100

5 甘氨酸 2

5、生长调节剂

单独配制，浓度为1-5 mg/ml（书中为0.5-1mg/ml），一般配成4 mg/ml 。

配制培养基母液时注意事项： ①一些离子易发生沉淀，可先用少量蒸馏水溶解，在按配方顺序依次混合；

②配制母液时必须用蒸馏水或重蒸馏水；

③药品应用化学纯或分析纯；

④不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，溶解生长素时，可用少量0．5 –1N的NaOH 或95%酒精溶解，溶解分裂素类用0．5 –1N的HCl加热溶解。萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA），赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。

（二）母液的保存

1、装瓶：将配制好的母液分别装入试剂瓶中，贴好标签，注明各培养基母液的名称、浓缩倍数、日期。注意将易分解、氧化的溶液，放入棕色瓶中保存。

2、贮藏：4℃冰箱。特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。

五、注意事项

1.微量、有机母液的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容。

2.铁盐母液的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容，保存在棕色玻璃瓶中。

3.MS培养基中还需要加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6 苄基嘌呤(6BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(0.1 mg/mL)。其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg，将2，4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶，将6-BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度为0 1 mg/mL的母液。

4．制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。

5．称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。

六、思考

培养基中各成分分别起到什么样的作用？ 实验三 MS培养基的配制与灭菌

姓名： 学号：

一、实验目的

1、熟悉组培母液吸取量的计算，琼脂、蔗糖的配制、各种母液的吸取、pH的调节以及培养基的分装与包装。学习用母液法配制MS培养基的操作过程。

2、掌握高压蒸汽灭菌锅的使用方法。

二、实验原理

组织培养所用的培养基含有植物细胞生长所必需的各类营养物质．同时也是各种细菌、真菌滋生繁殖的极好场所。因此必须对培养基等进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。

三、实验用具

电子天平、烧杯、量筒、药勺、称量纸、玻璃棒、移液管(10mL、5mL、2mL、1mL)、、洗耳球、酸度计或pH试纸(5.0-7.0)、电磁炉、带刻度搪瓷缸、组培瓶、冰箱、高压蒸汽灭菌锅， 蔗糖、琼脂、1mol/L HCl、1mol/LNaOH，激素母液及MS基本培养基各母液(实验二制备)。

四、实验过程

（一）培养基的配制

1、母液吸取量的计算

公式一：母液吸取量（ml）=配制培养基的体积（ml）/母液浓缩倍数

公式二（生长调节剂类）：母液吸取量（ml）=培养基要求的浓度*培养基的配制体积/母液浓度