经典：植物细胞工程实验室及基本操作

植物细胞工程综合大实验（一）——培养基配制和无菌操作一、实验目的与要求熟练掌握器皿的洗涤MS培养基的配制分装培养基和物品的高压灭菌实验室的消毒灭菌植物材料的取材及流水冲洗无菌操作材料的培养观察二、实验原理植物细胞的全能性。

三、仪器设备与器具电子天平、移液枪、冰箱、高压锅、超净工作台、三角瓶、烧杯、容量瓶、培养皿、搪瓷缸、镊子、解剖刀、酒精灯、试剂瓶、玻璃棒、线绳、pH试纸、封口膜、试管刷、洗涤剂、打火机等。

四、实验材料彩云阁茎段（用于诱导愈伤组织）茎节（用于诱导芽）五、实验方法与步骤（一）器皿的洗涤一般器皿有培养物但未污染的器皿有培养物且污染的器皿（二）MS培养基的配制分装1、MS培养基母液的配制母液A-F，每组配制A-E 100ml、F 50ml0.1%升汞的配制75%酒精的配制6-BANAA2、MS培养基的配制按每人配制100ml，分5小瓶。

过程如下；每组按1L配制，先取容器内加70%的蒸馏水；加入蔗糖30g/L；量取母液A-F；加入PGR（自己设计）；用容量瓶定容；用0.1-1N NAOH或HCl调整pH5.6-5.8；每人分100ml；加琼脂粉8g/L；分装到5个小三角瓶中、封口。

（三）培养基和物品的高压灭菌培养基、无菌水（每组至少5瓶）、空瓶（每组至少2个）、烧杯（每组至少1个）、培养皿（每组至少一套）、接种工具（2套），包好或者分好以备高压灭菌。

高压锅的使用。

（四）实验室的消毒灭菌75%的酒精擦拭超净工作台内表面，新洁尔灭水进行超净工作台外表面、培养架表面、墙壁及其他房间表面的擦拭。

（五）植物材料的取材及流水冲洗选取适宜的彩云阁茎节及茎段，切割成适宜大小后放在流水下冲洗。

（六）无菌操作演示。

（七）材料的培养观察接种完的材料放在培养室的培养架上进行培养。

培养初期每天观察一次，持续1周。

之后每2-3天观察一次。

统计指标：污染率（%）= （污染的外植体个数／接种外植体的总数）×100%。

植物组织培养实验室的组成仪器设备及基本操作1. 引言植物组织培养实验室是进行植物细胞培养、植物组织培养和植物遗传转化等研究工作的重要场所。

该实验室的组成仪器设备和基本操作对于顺利进行植物组织培养实验至关重要。

本文将详细介绍一个典型的植物组织培养实验室的组成仪器设备及其基本操作。

2. 仪器设备2.1. 无菌操作台无菌操作台是植物组织培养实验室中最关键的设备之一，用于保持操作区域的无菌条件。

它通常由一个工作台和一个无菌工作区组成。

无菌操作台配备了紫外线灯和高效过滤器，可以杀灭空气中的微生物，并防止外界空气中的微生物进入无菌工作区。

2.2. 培养箱培养箱是用于培养和生长植物组织的设备。

它可以提供恒温、恒湿和光照条件，从而满足不同植物组织培养实验的要求。

培养箱通常配备了温度控制器和湿度控制器，可以精确地控制环境参数。

2.3. 培养基配制设备在植物组织培养实验中，需要制备不同种类的培养基用于培养和生长植物组织。

培养基配制设备包括天平、培养基配制器和pH计。

天平用于精确称量各种培养基成分的质量，培养基配制器用于自动配制培养基，pH计用于测量培养基的酸碱度。

2.4. 高压灭菌器高压灭菌器用于对实验室的培养器具、培养基和试剂进行高温高压的灭菌处理。

灭菌是植物组织培养实验的基本操作之一，可以有效杀灭培养器具和培养基中的微生物，保证实验的无菌性。

2.5. 显微镜显微镜是用于观察和分析植物组织培养过程中的细胞和组织结构的设备。

它可以放大样本，使研究人员能够观察细胞中的微小结构。

显微镜通常配备了不同倍数的物镜和目镜，以满足不同观察需求。

2.6. 高速离心机高速离心机用于分离植物组织培养中的混合物。

在植物组织培养实验中，常常需要将悬浮细胞和培养基分离以获得纯净的细胞。

高速离心机通过离心力将混合物中的悬浮细胞沉降到管底，从而实现分离的目的。

3. 基本操作3.1. 灭菌操作在进行植物组织培养实验之前，必须对实验室的培养器具、培养基和试剂进行灭菌处理，以确保实验的无菌性。

实验一植物组织培养培养基的配制【实验目的】通过实验，掌握常用MS培养基的配制。

【仪器及试剂】1．仪器：：500 ml试剂瓶4个，100 ml试剂瓶4个，高压灭菌锅，电子天平，烧杯（大、中、小各2个），玻璃棒，移液管，搪瓷缸，培养瓶，电炉，pH计或精密pH试纸，容量瓶（大、中、小各1个）2．试剂：见MS培养基的配制方法一览表【操作步骤】1、母液的配制：为了避免每次配制培养基时都要对所需的各种成分进行称量，人们便把培养基中必需的一些物质按原量的10倍、100倍或1000倍称量后放在一起，成为一种浓缩液，这种浓缩液就叫“母液”。

①大量元素：一般配成使用浓度的10－20倍，浓度太大的母液在冰箱保存时会结晶。

除钙盐外，其它大量元素按一定倍数分别称量并分别用蒸馏水溶解后混合在一起，最后加蒸馏水定容。

钙盐要单独配制，不能和PO43-、SO42-混合，以免生成Ca3(PO4)2或CaSO4，发生沉淀。

②微量元素：微量元素因用量小，为称量方便及精确起见常配成100倍或1000倍的母液，即每种化合物的量加大100倍或1000倍，逐个溶解并混合在一起。

③铁盐：微量元素中的铁盐是单独配制的，由硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）5.56克和乙二铵四乙酸二钠（Na2-EDTA）7.46克溶于1升水中配成。

每配1升培养基加铁盐5毫升。

④有机物质：主要指氨基酸和维生素物质，它们都是分别称量及分别用容量瓶配成所需浓度（0.1－10毫克/毫升），用时按培养基配方中要求的量分别加入。

这些化合物都易溶于水，直接用水配制。

⑤生长调节物质：一般配成0.1－1.0毫克/毫升。

生长素类IAA、NAA、2,4-D等，配制时先按要求浓度称好药品，置于小烧杯中，用1－2毫升0.1 N氢氧化钠溶解，再加蒸馏水稀释至所需浓度。

如果用少量95％的乙醇来溶解亦可，有时效果不如氢氧化钠好。

配制细胞分裂素类物质时，则宜先用少量0.5 N或1 N盐酸来溶解，然后加蒸馏水至所需量。

实验指导书课程：细胞工程授课专业：生物工程、生物技术主编：徐艳实验一实验室的概况与培养基母液的配制一、实验目的：熟悉植物细胞工程实验室的基本结构、必须的基本设备及其用途与作用方法，掌握配制培养基母液的基本技能。

二、材料与用具：1、药品：生长调节类物质、无机盐类、有机化合物等。

2、用具：分析天平、移液管、量筒、培养瓶、烧杯、冰箱、母液瓶等。

三、教学时数：4课时。

四、实验内容：（一）实验室的基本结构及主要设备：1、洗涤室：水槽、工作台、蒸馏水器等功能：器皿及材料洗涤；蒸馏水制备。

2、消毒室：高压蒸汽灭菌锅、烘箱等功能：器皿的干燥；器皿及培养基的消毒。

3、试剂室：试剂柜、冰箱功能：存放试剂及器皿。

4、准备室：工作台、天平、水浴锅、电炉、显微镜及各种玻璃仪器、金属仪器等功能：培养基药品称量、配制、分装、灭菌；材料预处理；培养材料的观察分析。

5、接种室（含缓冲室）：超净工作台、接种箱等功能：无菌操作。

6、培养室：培养架、摇床等功能：培养物的控制培养。

7、驯化移栽室：如温室、大棚等功能：试管苗的驯化移栽。

（二）培养基母液的配制：1、MS基本培养基母液：各成分单独称量、单独溶解后混合定容①大量元素母液：10倍，1L注意：CaCl2.2H2O易与其他成分反应产生沉淀；②微量元素母液：100倍，0.5L③铁盐母液：100倍，0.5L注意：两者等体积溶解后混合，且需80℃水浴1h充分螯合，等待冷却后定容；④有机母液：100倍，0.5L2、激素类母液的配制：①1mg/ml的6－BA 50ml：先用0.1mol∕L的 HCL或NaOH溶解后再加水定容；②0.1mg/ml的NAA 50ml：先用少量0.1mol∕L的NaOH溶解后再加水定容。

注：精度要求精确到小数点后三位。

（三）培养器皿的洗涤：1、对污染的培养器皿先进行消毒灭菌处理；2、清除残渣，用清水洗净，浸泡于合成洗涤剂中6-24小时；3、用洗涤刷洗涤，并用自来水冲洗干净；4、用烘箱烘干或晾干，存放于防尘橱内备用。

植物细胞工程的操作方法
植物细胞工程是利用组织培养和转基因技术等手段，对植物细胞进行操作和改造的过程。

下面是一些常见的植物细胞工程操作方法：
1. 组织培养：从植物体中取出胚或幼嫩组织，进行无菌处理后，放入培养基中进行培养。

培养基的成分要根据具体的实验目的而定。

培养过程中需要定期观察和维护，以保证细胞的正常生长和分化。

2. 愈伤组织诱导：通过培养基中添加适量的激素，如植物生长激素（如激素2,4-D、NAA等）或激素抑制剂（如抗生素或乙烯利等），诱导植物细胞形成愈伤组织。

愈伤组织通常可以通过悬浮培养、固体培养或液体培养等方式来进行培养和增殖。

3. 基因转化：通过利用适当的载体将目标基因导入到植物细胞中，使其表达或抑制目标基因的功能。

常用的基因转化方法包括农杆菌介导转化、基因枪法和电穿孔法等。

4. 基因筛选和分析：转基因植物细胞经过转化后，需要进行基因筛选和分析。

常见的筛选方法包括PCR扩增、Southern blotting、Western blotting等。

这些方法可用于验证目标基因是否成功导入，并分析其在转基因植物细胞中的表达水平和功能等。

5. 再生植株的培育：将经过基因转化的细胞或组织进行培养和分化，促进其再
生为完整的植株。

这一过程通常需要进行适当的生理调控和培养条件的优化，以提高再生植株的成功率。

需要注意的是，植物细胞工程是一门复杂的科学技术，不同的实验目的和植物种类可能需要采用不同的操作方法和技术路线。

此外，在进行植物细胞工程实验时，还要注意严格遵守相关的生物安全规范和伦理要求。

细胞工程实验室涉及的基本操作技术下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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1. 培养基准备。

第一节植物细胞工程实验室设置与培养条件.ppt.Convertor第一章植物细胞工程原理与技术第一节实验室设置及培养条件第二节培养基第三节植物材料的接种一实验室设置及内部设备二培养环境条件第一节实验室设置及培养条件一实验室设置及内部设备实验室建设应考虑的问题：1、实验的性质2、实验室的规模细胞工程实验室:基本实验室:准备室、无菌操作室、培养室辅助实验室：细胞学实验室、生化分析实验室贮藏室温室基本实验室1、准备室完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装及高压灭菌；器皿、材料的洗涤等工作。

主要设备纯水器工作台药品厨天平电磁炉冰箱玻璃器皿酸度计高压灭菌锅干燥箱等◆培养容器2、无菌操作室（接种室）用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。

接种室应用推拉门，设有缓冲间，面积2m2为宜。

进入接种室前更衣换鞋，减少带入接种室杂菌。

接种室主要设备超净工作台每次实验前要用紫外灯灭菌20min，关掉紫外灯开始工作，工作过程中注意一直开着吹风机。

无菌操作用具离心机细胞融合仪◆接种用具3、培养室用于接种材料的培养。

培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。

其设计以充分利用空间和节省能源为原则。

控制：温度、光照、湿度。

培养室主要设备：1、培养架放置培养物，每层顶部装有灯管进行照明，可用灯管数量来调节光照强度。

培养架多由金属制成，一般设5层，最低一层离地高约l0cm，其他每层间隔40cm左右，培养架高1.7m左右。

培养架长度根据日光灯长度设计，如采用40W日光灯，则长1.3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。

2、空调3、时控器自动开灯、关灯4、温度自动记录仪5 、摇床培养室主要设备：培养箱辅助实验室1、细胞学实验室：对培养材料进细胞学鉴定和研究。

由制片室和显微观察室组成。

主要设备:切片机、磨刀机、温箱及切片染色设备；实体显微镜、倒置显微镜、生物显微镜、照相设备显微观察室生化分析实验室植物细胞工程实验室布局南北二培养条件1.一般控制在25土2℃。

实验一：配置MS 培养基实验二：黄瓜种子的消毒与萌发每小组20粒种子→75%酒精30s →10%次氯酸钠20min →无菌水冲洗3～4次→接入黄瓜种子萌发培养基中实验三：烟草叶片的消毒和接种 流水冲洗→75%酒精30s →10%次氯酸钠5~20min →无菌水冲洗3～4次——————→切块（0.7cmx0.7cm ）3~5块/瓶→接种到8种配方的培养基（1）MS+2，4-D 0.5mg/L（2）MS+6-BA 0.5mg/L+2，4-D 0.5mg/L（3）MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L（4）MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L（5）21MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+0.2%AC （活性炭） （6）MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L（7）MS+6-BA 2.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L（8）21MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L 发根农杆菌介导的黄瓜子叶转化发根农杆菌培养→测OD 值→加入黄瓜子叶切块浸泡10min （切两端，留中间） →吸干多余菌液→接入MS 培养基中→共培养2d （暗培养） →抑菌选择培养（含cef 的MS 培养基）实验四：黄瓜毛状根的筛选培养切下能在无激素培养基上自主生长的黄瓜毛状根 →不同浓度卡那霉素的MS+cef 培养基实验五：继代培养第一组：转到3,5,6,8号配方培养基中培养第二组：转到1,2,7号配方培养基培养第三组：转到1,2,3,5,7号配方培养基培养第四组：转到4,5,6号配方培养基第五组：转到4号配方培养基第六组：转到1,4,8号配方培养基第七组：转到1,2,6,7号配方培养基第八组：转到 吸水纸吸干。