下载文档原格式
¹双向电泳技术原理及其应用刘上峰 傅俊江 综述 李麓芸 审校(中南大学湘雅医学院人类生殖工程研究室,湖南长沙410078)摘要:双向电泳技术是蛋白质组研究的核心技术之一,本文对其基本原理、分辨率、可重复性、相关数据库、减法分析等作了介绍,并对其今后的发展方向作了展望。
关键词:双向电泳; 蛋白质组; 数据库;减法分析中图分类号:R318133 文献标识码:A 文章编号:100121773(2002)022*******随着后基因组时代的到来,蛋白质组学应运而生。
双向电泳(tw o 2dimensional electrophoresis,22D E)作为蛋白质组研究的三大关键核心技术之一(另二种是质谱技术和计算机图像数据处理与蛋白质组数据库即蛋白质组信息学),仍然是目前分析组份复杂蛋白质分辨率最高的工具,因此日益受到人们的广泛关注。
1 双向电泳的基本原理首先根据蛋白质等电点不同在pH 梯度胶中等电聚焦(isoelec tric f ocusing,IEF)将其分离,然后按照它们的分子量大小在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS 2PAG E)第二次分离。
根据第一向等电聚焦条件的不同,可将22DE 分为三种系统:第一种系统是在聚丙烯酰胺凝胶中进行,两性电解质在外加电场作用下形成梯度,该系统称为IS O 2D A L T 。
其主要缺点是pH 梯度不稳定,重复性差,上样量低,不利于不同实验室间进行图谱比较;如果第一向电泳使用丙烯酰胺和Immobilines 共聚,形成具有pH 梯度的凝胶,这种系统称为IPG 2D AL T 系统,该系统pH 梯度稳定,不依赖于外加电场,基本上克服了ISO 2D AL T 的主要缺点,无论是重复性和上样量均优于I SO 2D AL T;第三种是非平衡pH 梯度电泳(nonequilibrium pH gradient electrophoresis,NEPhG E),主要用于分离碱性蛋白质,电泳展开时间相对比较短。
双向电泳的应用及研究进展摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。
本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。
同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。
关键词: 双向电泳，应用，前景1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。
双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。
双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。
就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。
1.2双向电泳基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。
双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。
第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。
在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。
双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。
因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
双向凝胶电泳（2-DE）双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。
在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。
80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。
由于可以建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率。
此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。
这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。
第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10～100kD分子量的蛋白质。
其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的还是用同位素标记，20ppm的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。
用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景底色，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即所谓“参考胶图谱”。
蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量的分析。
最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析，确定它们是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。
双向电泳的基本原理
双向电泳是蛋白质组学研究中最重要的技术，在蛋白质组学研究中发挥了重要作用。
其基本原理是：样品中含有两种或两种以上不同分子量的蛋白质，它们的分子量分布不同，在加有等电聚焦（IEF）等电聚焦缓冲液的一台凝胶电泳仪（如UMEACO）上，蛋白质分子按其大小和分子量进行分离，并可在不同的pH 范围内进行电泳。
由于等电聚焦缓冲液具有强的选择性，不同分子量的蛋白质在同一胶上得到分离，经凝胶染色后在垂直于凝胶的方向上能显示出清晰的条带。
蛋白质分子量大的向小的方向移动，分子量小的向大的方向移动。
每一条带就是一个独立的分子。
双向电泳技术可以大大缩短实验时间、降低实验成本、提高分析效率。
例如：已知蛋白序列为a/b/c，对某一蛋白进行研究，只需分离出a/b/c三条带，再经双向电泳技术分离后即可得到含有三条带的蛋白质条带。
双向电泳技术是蛋白质组学研究中最重要的技术之一，其基本原理是：将样品制备成胶后，在垂直于凝胶电泳方向上将蛋白进行分离。
—— 1 —1 —。
双向凝胶电泳特点
双向凝胶电泳是一种常用的蛋白质或核酸分析技术，其特点如下：
1. 高分辨率：双向凝胶电泳可以提供较高的分辨率，允许分离几乎相同大小的DNA片段或蛋白质，使其成为分析样品组成和结构的有力工具。
2. 分离适应性强：双向凝胶电泳适用于各种样品类型，包括DNA、RNA和蛋白质等，可以进行定性和定量分析。
3. 定量准确性：通过比较样品与标准曲线，双向凝胶电泳可以精确地确定样品中的目标物含量。
4. 可视化：双向凝胶电泳结果可以直接观察，并且可以使用染色剂或放射性示踪剂对目标蛋白质或核酸进行可视化。
5. 提供局部结构信息：双向凝胶电泳可以提供有关分子的局部结构信息，如转录起始位点、剪接位点等。
6. 适用于高通量分析：双向凝胶电泳可以同时分析多个样品，适用于高通量分析，提高分析效率。
总的来说，双向凝胶电泳具有高分辨率、适用于多种样品、准确度高、可视化、提供局部结构信息和高通量分析等特点，是一种常用的分析技术。
模块五蛋白质双向电泳1. 实验目的掌握双向电泳能根据等电点和分子量分离蛋白质的原理，第一向等电聚焦电泳（IEF）和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）操作步骤，掌握凝胶染色方法，掌握凝胶分析软件的使用，了解对分离出的特异蛋白质的进一步分析方法，了解利用电泳技术分析生物大分子的方法。
2. 实验原理从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。
目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。
这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。
双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。
在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。
第一向等电聚焦：等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholyte）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。
以电泳观点看，蛋白质最主要的特点是它的带电行为，它们在不同的pH值环境中带不同数量的正电荷或负电荷，只有在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoeletric point，PI）。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH 环境中以阳离子形式向负极移动。
如果在pH梯度环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集，聚焦部位的蛋白质质点的净电荷为零，测定聚焦部位的pH即可知道该蛋白质的等电点。
第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS是一种阴离子表面活性剂，当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS时，形成了蛋白质－SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。
编号：1-6主题：双向凝胶电泳概述：双向凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。
这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。
目的：凝胶中蛋白的检测、图像采集和分析、蛋白鉴定、分离蛋白质组所有蛋白。
原理：1、根据蛋白质的等电点（第一向）和分子量（第二向）的不同进行分离。
蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。
对每个蛋白质来说都有一个特定的pH，此时蛋白质的静电荷为零，此pH值即该蛋白质的等电点(pI)。
将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。
在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。
当蛋白质迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。
聚焦是一个与pH相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的pI值；在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。
双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS．PAGE凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相垂直的分离。
蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，由于SDS是一种强阴离子去垢剂，所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，能消除不同分子之间原有的电荷差异，从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质分子的质量大小，其迁移率与分子量的对数呈线性关系。
步骤：１.样品制备２.第一向分离等电聚焦３.第二向分离聚丙烯酰胺凝胶电泳３.修饰和加工，如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化流程图：营养知识饮食原则：三高三低（高蛋白/高纤维/高维生素，低糖/低脂肪/低盐）人体六大营养元素脂肪/蛋白质/碳水化合物维生素/矿物质/水比例：脂肪：蛋白质：碳水化合物=1：2：3一、脂肪的作用保护内脏/储存能量/维持神经系统的正常功能/防寒保暖/帮助荷尔蒙的产生/能量的来源之一/支持组织的生长/保护和修复注：脂肪是能量储存的最有效的方式，一克脂肪含热量9.3千卡。
双向电泳实验蛋白质样品制备要点双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是蛋白质组学研究中的一种常用技术。
这项技术利用蛋白质的两种特性，即等电点与相对分子量，通过等电聚焦（IEF）与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）这两项技术，将上千种不同的蛋白质分离，同时得到每种蛋白质的等电点、相对分子量和含量等信息。
这里将蛋白质样本分为两种，一种是血清样本，另一种是组织和细胞样本，分别介绍样本的制备方法。
一、血清样本的制备血清和其他生物液体中的蛋白质存在有大量的白蛋白和IgG而很难用双向电泳分离，因为这些蛋白质会掩盖凝胶上的其他蛋白，从而难以分辨血清蛋白量。
而且这些蛋白质的等电点和分子量分布范围广，会掩盖一些低分度的蛋白质，因此需要使用白蛋白和IgG清除试剂盒（使用IgG结合树脂作为清除试剂），具体步骤如下：①用移液管移取15μL人血清，放入带盖样本管中（为保证良好的树脂与样本的混合，推荐采用一次性15mL离心管）。
②在含有样本的管中加入750μL悬浮匀浆，取液前必须保证树脂匀浆为均匀的悬浮液。
③室温下在振荡混合器上混合匀浆/样本混合液3分钟，混合转速应确保混合液处于悬浮液状态。
④将微离心柱的底端折去，置于试剂盒中所配的离心管中。
⑤孵育完成时，确保树脂处于悬浮状态，然后小心地将树脂/样本混合物移入微离心柱的上层槽中。
⑥以大约6500×g离心5分钟。
⑦将含有树脂凝胶的上层槽弃去，收集滤出液。
⑧样品即可用于下一步的处理和储存备用。
二、组织和细胞样本的制备裂解不同种类的蛋白质样本应采取不同的处理和条件，裂解的效果取决于细胞破碎的方法、蛋白质浓缩和裂解的方法，去污剂的选择以及样本溶液的组成等。
1. 破碎细胞的方法细胞破碎过程中蛋白酶可能被释放出来，并引起蛋白质的分解，使双向电泳的最后结果复杂化。
因此，应直接将样本在强变性液裂解（8mol/L尿素、10%TCA或2%SDS）来抑制蛋白酶，并且在低温下制备样品。
双向电泳实验过程及相关溶液配置A．实验过程一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二、实验步骤：1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul 裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。
其中每隔10～15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。
2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul），然后，各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
例如：编号蛋白量（ul） Buffer(ul) Bradford(ml) OD595值1 0 80 4 02 5 75 4 0.0243 10 704 0.0614 15 65 4 0.0915 20 60 4 0.116Bt4 2 78 4 0.079Bt4 4 76 4转Bt4 2 78 4 0.075转Bt4 4 76 4标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。
a、b通过作图输入数据可知相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得OD值测量过程：比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。
简述双向电泳的原理全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：双向电泳是一种分离蛋白质或核酸的方法，其原理基于电泳技术。
电泳是一种根据带电粒子在电场中的迁移速度不同而实现分离的方法，双向电泳则是在两个方向上施加电场，使样品能够在水平和垂直方向上进行迁移，以实现更加高效的分离。
双向电泳的原理主要包括以下几个方面：2. 分子大小和电荷：蛋白质或核酸的迁移速度取决于其大小和电荷。
较小的分子会更快地迁移，而带有更多负电荷的分子会受到更大的排斥力，迁移速度更快。
3. 凝胶介质的选择：凝胶是双向电泳中的分离载体，其选择对于分离效果至关重要。
凝胶的孔隙结构和导电性会影响样品的迁移速度和分离效率，因此需要根据样品的特性选择合适的凝胶介质。
4. 蛋白质或核酸的分子量和异质性：在双向电泳中，样品中存在不同分子量和异质性的蛋白质或核酸，这些成分会在电泳过程中以不同速度迁移，最终实现分离。
双向电泳技术的发展为蛋白质组学和基因组学研究提供了重要手段，能够有效实现不同类型的蛋白质或核酸的分离与鉴定。
通过结合其他分析技术，如质谱或序列测定，可以更全面地了解生物样品的组成和功能。
双向电泳在疾病诊断、药物研发和生物学研究等领域具有广泛的应用前景，成为生命科学研究中不可或缺的重要工具之一。
第二篇示例：双向电泳是一种常用的分离和分析生物分子的方法，它结合了水平电泳和垂直电泳的优点，能够在同一实验中同时进行两个方向上的电泳，从而达到更高的分辨率和更全面的信息提取。
双向电泳的原理基于生物分子在电场中的迁移速度与其电荷量、大小和形状有关。
在双向电泳中，通常先将样品加载在一维电泳胶中，然后将电泳胶直立放置，施加一个水平电场使样品向两侧扩散，形成一个均匀扩散的带状样品。
接下来，在垂直方向上施加另一个电场，使生物分子根据其电荷量、大小和形状不同而向上或向下迁移，从而实现在两个方向上的电泳。
双向电泳需要结合两个方向上的电场来进行，这样可以使得样品在两个维度上都得到分离，从而获得更加准确和直观的结果。
要开展蛋白质组学研究，双向电泳是你必须了解掌握的最基础的蛋白质分离技术，正如普通凝胶电泳对于核酸纯化。
可是一提起双向电泳，多数人还是会直皱眉头----别摇头摆手又叹气啦，今天的双向电泳早已深入改进了，特别是其中最热门的荧光差异凝胶电泳技术（DIGE ），因为消除了传统双向电泳的一些弊端，已经使得好多实验室对双向电泳重拾信心，并逐渐得到越来越多的科学家的认同。
要知道基于双向电泳的蛋白质组分析文献每年都稳步增长，采用DIGE 技术进行研究的科研论文的比重从2004年的不到2％猛增到2008年的19.6%呢。
来吧，放下偏见，不要错过，跟着生物通重新认识这功能强大的DIGE 吧。
前尘往事一直备受争议的双向电泳何以这么不招人待见呢？长话短说。
生物样品中蛋白质的复杂多样性远超核酸，使得单向电泳无法满足蛋白样品分离分析的需求。
1975年O`Farrell 首次介绍了双向电泳技术，采用等电聚焦和SDS-PAGE 在等电点和分子量两个方向上对蛋白质进行分离，使得原本密密麻麻都挤在一条泳道上的蛋白质得以在另外一个方向上有效分开。
这个在当时极具创意的设计虽然被写进了教科书中成为经典技术，可惜在随后的实际应用中却遇到种种问题。
由于当时第一向电泳的基质是采用两性电解质配置pH 梯度胶，两性电解质的不稳定性导致等电点聚焦结果严重受到实验室条件和操作手法等偶然因素的影响，第二向电泳结果就更不用说了----即使不是差之毫厘缪之千里，这种不确定性也导致了双向电泳结果可重复性差，稳定性差。
不单各实验室之间的结果难以比较，即使同一实验室的结果也不怎么确定。
我们都知道，实验的可重复性是实验可信度的重要指标，也是同行评议的重要基础。
这种不稳定导致的争议可想而知。
用不确定的方法研究不确定的未知，会“负负得正”吗？不可能。
再加上操作和结果分析的极其复杂，难怪一提起双向电泳，人人皱眉。
直到上世纪九十年代，安玛西亚公司（通用电气生命科学的前身）推出了商品化的固相pH 梯度胶条，极大的提高了等电聚焦的可重复性，这才使得国际上不同实验室间双向电泳实验结果比较成为可能。
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
