双向凝胶电泳的图像分析

双向电泳的应用及研究进展摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。

本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。

同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。

关键词: 双向电泳，应用，前景1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。

双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。

双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。

双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。

双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。

可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。

就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。

1.2双向电泳基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。

双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。

第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。

在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。

双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。

因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。

8、2D电泳的原理。

基本原理IEF-SDS-PAGE是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

9、2D电泳图像分析流程。

☐凝胶图像的扫描：☐图像加工：☐斑点检测和定量：☐凝胶配比：☐数据分析：☐数据呈递和解释：☐2-DE数据库的建立：10、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理是什么？SDS的作用是什么？基本原理:天然状态生物大分子聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）,在恒定的、非解离的缓冲系统中分离蛋白质。

可得到天然蛋白质的分子量。

①聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulphate)SDS，蛋白电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。

②加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白的二硫键还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P分子上，形成蛋白-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于蛋白分子量。

11、等电聚焦电泳中，载体两性电解质pH梯度电泳与固相pH梯度电泳有何区别？（1）载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳是在支持介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的线性的PH梯度（预电泳）。

当蛋白质放进此系统时，靠近阳极的侧的蛋白质处于酸性环境中，带正电荷向负极移动；靠近阴极的侧的蛋白质处于碱性环境中，带负电和向正向移动，最终都聚焦于其等电点相当的PH位置上，形成不同的蛋白质区带。

目前在样品分析中趋向于选用超薄水平板式，具有分析样品多，两性电解质用量少，结果重复性好等优点。

（2）固相pH梯度等电聚焦是基于凝胶中的固相pH梯度。

这些具有弱酸或弱碱性物质的丙烯酰胺衍生物共价结合到聚丙烯酰胺凝胶介质形成pH梯度后，带电的蛋白质分子便开始向自己的等电点位置迁移，直到到达自己的等电点。

3.1 全菌蛋白的制备将细菌接种于DMEM培养基，置于28℃培养箱培养18h。

参照Coelho 等（Coelho et al. 2004）的方法，略有改动。

用Wash buffer（10mmol/L TrisCl pH8.0，5mmol/L 醋酸镁）清洗细胞3次。

离心，细胞沉淀在Lysis Buffer( 7mol/L 尿素，2mol/L硫尿，1% IPG Buffer pH3-10或pH4-7，4% CHAPS，1% DTT，1%蛋白酶抑制剂，1%核酶抑制剂)中悬浮，使其浓度范围在5~10mg/mL。

置于冰上裂解2h。

13000r/min离心1h取上清，-80℃保存。

用2-D clean-up Kit 纯化蛋白，再用2-D Quant Kit测定样本中蛋白浓度。

3. 2 2-D Clean-Up Kit的使用方法（全程小心）蛋白质样本在1.5mL微型离心管中处理，所有步骤均在冰上进行。

1）将体积100μL的蛋白质样本（含1~100μg蛋白质）置于1.5mL微型离心管中。

加入300μL沉淀剂。

振荡或倒置搅匀。

冰浴中（4~5℃）培育15min。

2）加入300μL共沉淀剂，简单振荡混合一下，12000r/min离心5min。

3）将上清液尽量多地倾析或吸出，不要搅散沉淀。

保持沉淀不变，在其上面加入一层40μL共沉淀剂，冰上培育5min。

后离心5min，去上清。

4）往沉淀加入25μL蒸馏水或去离子水。

将管振荡5~10s，这时沉淀应散开，但并未溶解于水中。

在管中加入1mL洗涤缓冲液（在-20℃下至少预冷1h）和5μL洗涤添加剂，振荡直至沉淀完全散开。

-20℃下培育至少30min，每10min振荡20~30s。

5）将离心管以最大速度（至少12000r/min）离心5min。

小心地将上清液移走弃去。

此时应可见白色沉淀，将沉淀简单风干一下（不要超过5min）。

6）用裂解液溶解沉淀，以备第一向IEF电泳。

振荡管子至少30s，在室温下孵育，振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。

凝胶电泳拍照方法引言：凝胶电泳是生物学和分子生物学中常用的实验技术，用于分离和分析DNA、RNA和蛋白质等生物大分子。

而凝胶电泳拍照作为凝胶电泳实验结果的记录和保存方式，是实验过程中不可或缺的一部分。

本文将详细介绍凝胶电泳拍照的方法和步骤。

一、准备工作：1. 凝胶电泳仪的设置：根据实验需求和样品类型，调整凝胶电泳仪的参数，包括电压、电流和运行时间等。

2. 凝胶染色：将凝胶染色剂均匀地涂抹在凝胶上，使样品能够被清晰可见。

常用的染色方法有乙溴化乙锭染色法和银染色法。

二、拍照设备和设置：1. 相机选择：选择一台高分辨率的数码相机或专业的凝胶电泳成像系统。

相机的像素越高，拍摄的凝胶图像越清晰。

2. 布光设置：为了获得最佳的凝胶图像，应根据实际情况调整光线亮度和曝光时间。

较暗的环境中，增加光线亮度；较亮的环境中，减少光线亮度。

曝光时间的选择应使凝胶图像的明暗对比度较高，但避免过曝光或欠曝光。

3. 焦距设置：根据凝胶大小和需要捕捉的细节，调整相机的焦距。

通常情况下，较大的凝胶需要较长的焦距，而较小的凝胶则需要较短的焦距。

三、拍照步骤：1. 准备好实验室环境：确保实验室内光线适中，无明显的光源干扰，避免出现反光和阴影。

2. 凝胶定位：将凝胶放置在透明的凝胶图像拍摄板上，并确保凝胶完全平整。

注意避免手指触摸凝胶表面，以免留下指纹或损坏凝胶。

3. 设置相机：根据实验需要，选择合适的拍摄模式（如自动模式或手动模式），并进行相应的设置。

4. 调整焦距：使用相机的取景器或屏幕，调整焦距以使凝胶图像清晰可见。

可以通过放大取景器或调整相机位置等方式进行微调。

5. 拍摄凝胶图像：按下相机的快门按钮，拍摄凝胶图像。

建议进行多次拍摄，以确保至少有一张清晰可用的图像。

四、保存和分析：1. 存储图像：将拍摄到的凝胶图像保存到计算机或存储设备中。

可以选择保存为常见的图像格式，如JPEG或TIFF。

2. 图像分析：利用图像处理软件打开保存的图像文件，进行凝胶图像的分析和处理。

高低分化胃癌组织的双向凝胶电泳分析Protocol ................................................................... - 2 - 1实验材料........................................................................................................................... - 2 -1.1标本采集................................................................................................................ - 2 -1.2主要试剂：............................................................................................................ - 2 -1.3主要仪器设备及软件：........................................................................................ - 3 -2实验方法........................................................................................................................... - 3 -2.1标本采集................................................................................................................ - 3 -2.2主要溶液配制........................................................................................................ - 3 -2.3蛋白质样品制备.................................................................................................... - 7 -2.4Bradford法蛋白质定量 ......................................................................................... - 8 -2.5SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 ......................................................................... - 9 -2.6等浓度混合低分化腺癌组（Pp）高分化腺癌组（Wp） ................................ - 10 -2.7双向凝胶电泳（IEF+SDS-PAGE）................................................................... - 10 -2.7.1第一向是等电聚焦电泳（isoclectric focusing，IEF）.................................. - 10 -2.7.2第二向SDS-PAGE电泳.................................................................................. - 11 -2.8图像分析.............................................................................................................. - 13 -2.9差异蛋白点的切取.............................................................................................. - 13 -高低分化胃癌组织的双向凝胶电泳分析Protocol1实验材料1.1标本采集3例人高分化胃腺癌及3例人低分化胃腺癌组织取自兰大一院胃癌手术切除标本（2009年4月-10月），并经病理检查确诊（WHO分型），所取组织没有出血和坏死。

聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析聚丙烯酰胺凝胶电泳实验是一种分离和分析生物分子的方法，它可以通过电场使不同分子质量的DNA、RNA和蛋白质在物理性质相近的聚丙烯酰胺凝胶中移动，从而实现它们的分离和检测。

本文将就聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的理论、实验步骤、结果分析以及实验存在的问题进行详细的讲述。

一、实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳实验主要是通过电场作用，将DNA、RNA和蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中分离并判断分子的大小。

其中聚丙烯酰胺凝胶是一种网状物质，它有很强的吸水性和渗透性，因此可以将生物分子填充其中。

当聚丙烯酰胺凝胶通过电场作用列成微观孔隙时，各种生物分子会在微孔内移动，根据分子的质量和大小，会在不同位置形成不同的电泳带。

在实验中，首先需要制备聚丙烯酰胺凝胶，然后将待测试的样品加入凝胶溶液中均匀混合，再将其注入电泳槽中，加入电解液并通电，通过电泳将被检测的生物分子分离后，用染色剂在凝胶上染色并观察其带型。

二、实验步骤1. 制备聚丙烯酰胺凝胶a. 测量所需聚丙烯酰胺的质量，按照重量比例混合罗丹明B缓冲液和甲醛b. 加入半加固剂后，在模板两边运用吸管将混合液吸入模板内，并加入宽度相等的橡皮垫c. 在上方加入半加固剂，使其混合，并等待其凝固，最后取下橡皮垫，去除凝胶。

2. 样品荧光标记a. 将测试样品制备好b. 将样品添加荧光染料，进行反应后用同样的染料标记分子质量标准。

3. 准备电泳槽a. 连接电源和电极，注入电解液b. 将制备好的聚丙烯酰胺凝胶放入槽中。

4. 进行电泳操作a. 分别添加样品和分子质量标准至凝胶中b. 通过电泳，将生物分子在凝胶中分离和定位c. 取下凝胶并对凝胶染色d. 进行显带，将电泳带进行图像捕捉5. 结果分析a. 在凝胶上观察带型b. 分离它们以确定大小及数量c. 分别进行其电泳常数的测定三、结果分析根据上述的实验步骤，在实验中我们可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，将DNA、RNA 和蛋白质分子分离，并判断分子的大小及数量。

凝胶电泳拍照方法凝胶电泳是一种常用的蛋白质和核酸分离和分析方法，主要用于检测和分析DNA、RNA、蛋白质等生物大分子。

在凝胶电泳实验中，为了可视化凝胶电泳结果，需要进行拍照，以下是凝胶电泳拍照方法的详细介绍。

1.准备材料和仪器-凝胶电泳装置：包括电泳槽、电源和电极。

-凝胶：常用的凝胶有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。

-DNA、RNA、蛋白质样品：提取和准备好待分析的生物大分子样品。

- 常用的色谱染料：例如溴化乙锭（ethidium bromide）或年代标记剂（SYBR Green等）等。

-紫外（UV）照相仪或激光扫描仪：用于观察和记录凝胶电泳结果。

2.制备凝胶和样品-凝胶制备：根据所需的分析目的和分子大小，选择合适的凝胶材料和浓度，按照凝胶制备方法制备凝胶。

-样品制备：将待分析的生物大分子样品按照实验要求进行提取和纯化，并根据浓度或分子量进行稀释。

3.凝胶电泳操作-将制备好的凝胶放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液（电泳缓冲液中添加适量的色谱染料）。

-将样品加入凝胶上的孔洞中，通常将样品和DNA或RNA分子量标准混合，以便测量样品的分子量。

-打开电源，以设定好的电流和电压进行电泳，通常需要一个恒定的电流和时间（例如200V，1小时）。

4.凝胶电泳结果观察和调整-在电泳过程中，通过观察电流和电压变化，确保电泳进行正常。

-当电泳时间结束后，关闭电源，取出凝胶，在紫外照相仪下观察凝胶电泳结果。

如果使用溴化乙锭染色，可使用紫外照相仪直接观察凝胶上的DNA或RNA条带，如果使用年代标记剂，则需要使用激光扫描仪或相应的设备来观察和记录凝胶电泳结果。

-如果需要调整或优化凝胶电泳结果，例如改变电泳时间、电压、电流或凝胶浓度等参数，可以根据需要进行参数调整，并重复实验。

5.凝胶电泳结果的记录-使用相应的设备，将凝胶电泳结果记录下来，例如通过照相、激光扫描或其他图像记录方法。

-标注凝胶上的DNA、RNA或蛋白质条带的位置和分子量，以便后续的分析和比较。

1．实验目的：（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；（2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；2．实验材料及用品（1）实验仪器（apparatus）：恒温培养箱（Constant temperature incubator）、恒温摇床（Constant temperature shaking table）、高速离心机（High speed centrifuge）、漩涡振荡器（V ortex mixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（beaker）、量筒（graduated cylinder）、玻璃棒（stir bar）、微波炉（microwave）、天平（Pan balance）、电泳梳子（comb）、电泳槽（electrophoresis tank）、电泳器（Electro-phoresis System）、紫外灯（Ultraviolet transilluminator ）3）、材料与试剂（Reagents）：①溶液I（Solution Ⅰ）：50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L 三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）pH8.0溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

②溶液Ⅱ（Solution Ⅱ）：新鲜配制，等体积混合0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1% SDS （可用10％贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。

③溶液III （Solution Ⅲ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀60mL 5mol/L KAc，11.5mL 冰醋酸，28.5mL H2O （该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L）④TE液缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L EDTA（pH8.0）⑤70% 乙醇；⑥平衡酚：氯仿1：1：将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。

模块五蛋白质双向电泳1. 实验目的掌握双向电泳能根据等电点和分子量分离蛋白质的原理，第一向等电聚焦电泳（IEF）和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）操作步骤，掌握凝胶染色方法，掌握凝胶分析软件的使用，了解对分离出的特异蛋白质的进一步分析方法，了解利用电泳技术分析生物大分子的方法。

2. 实验原理从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。

目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。

这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。

双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。

在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。

第一向等电聚焦：等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholyte）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。

以电泳观点看，蛋白质最主要的特点是它的带电行为，它们在不同的pH值环境中带不同数量的正电荷或负电荷，只有在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoeletric point，PI）。

在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH 环境中以阳离子形式向负极移动。

如果在pH梯度环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集，聚焦部位的蛋白质质点的净电荷为零，测定聚焦部位的pH即可知道该蛋白质的等电点。

第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS是一种阴离子表面活性剂，当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS时，形成了蛋白质－SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。