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蛋白质组学检测P4HB蛋白在结直肠癌组织中的表达及其意义陈德波;洪成业;王青兰;洪志鹏;施凉潘;池畔【摘要】Objective To investigate the differential expression of protein between colorectal canc-er tissue(CRC)and normal adjacent tissues,and to explore its relationship with CRC characteristics. Methods Two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis(2D-PAGE)was used to analyze the differ-ential expression proteins between 12 cases of colorectal cancer tissues and normal adjacent tissues,and Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS)and MS/MS were used to identify and analyze the markers of differential expression proteins. After being found out as a protein of interest,which was expressed at a higher level in the colorectal cancer tissues,the prolyl 4 hyd roxylase β subunit(P4HB)was validated using Western-blot. The expression of P4HB in colorectal cancer was detected by immunohistochemistry ,and the relationship between the expression ofP4HB and clinicopathologic features and prognosis was analyzed . Results 2D-PAGE analysis and MALDI-TOF-MS showed that the abundance expression of P4HB in CRC tissue was 2 .01 times higher than that in normal mucosa ( P < 0 .01) . The results of Western-blot showed that the expression level of P4HB in CRC tissues was significantly higher than that in normal mucosa tissues ( P < 0 .05 ) [(1 .36 ± 0 .54 ) vs (0 .74 ±0 .35 )] .The positive expression rate of P4HB protein was successivelydecreased by 43 .85% (82/187)in colorectal cancer tissues ,19 .35%(12/62)in adenoma and 12 .67% (19/150) in normal mucosa ,and difference had statistical significance ( P < 0 .001) .The expression of P4HB protein was significantly correlated with TNM stage (P = 0 .003) ,tumor differentiation (P = 0 .020)) and tumor size ( P < 0 .001) ,however significant associations were not observed between P4HB expression and patient's gender ( P = 0 .880) ,age (P = 0 .464) and tumor location ( P =0 .293) .The median survival time of patients with positive expression ofP4HB protein was 70 months ,and the median survival for patients of postoperative without P4HB expression was 104 months .Log-rank test showed that the survival rate of patients with positive expression of P4HB protein was not statistically significant than that with negative expression of P4HB( P = 0 .11) . Conclusion The expression of P4HB is up-regulated in CRC tissue ,and the positive expression of P4HB is related to later CRC stage ,poorly differentiated and larger tumor of colorectal cancer.%目的分析结直肠癌(CRC)组织和正常癌旁组织之间的差异表达蛋白质,探讨其与CRC疾病特征的关系. 方法应用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳法(2D-PAGE)分析12例配对CRC 组织和正常癌旁组织之间的差异表达蛋白,并运用激光解吸电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)和MS/MS法对差异表达的蛋白质标记点进行鉴定和分析.找出CRC组织中表达上调的蛋白脯氨酰-4-羟化酶(P4HB)β亚单位作为兴趣蛋白后,通过Western-blot验证,并运用免疫组织化学技术检测P4HB在CRC中的表达情况,分析其与CRC的临床病理特征及预后的关系. 结果 2D-PAGE分析和MALDI-TOF-MS鉴定结果显示,CRC组织中 P4HB表达丰度比正常黏膜组织上调2.01倍(P<0.01).Western-blot结果显示,CRC组织中P4HB的表达水平明显高于其配对的正常黏膜组织[(1.36 ± 0.54)vs(0.74 ± 0.35)](P<0.05).P4HB蛋白在CRC组织、腺瘤组织和正常黏膜组织中的表达阳性率依次减低,分别为43.85%(82/187),19.35%(12/62)及12.67%(19/150),三者间的差别均有统计学意义(P<0.001).P4HB蛋白表达与CRC的TNM分期(P=0.003)、肿瘤分化程度(P=0.020)、肿瘤大小(P<0.001)有关,而与患者的性别(P=0.880)、年龄(P=0.464)及肿瘤部位(P=0.293)无关.Log-rank检验结果显示,在CRC患者中,P4HB表达阳性组与阴性组的生存时间差别无统计学意义(P=0.110). 结论 CRC组织中P4HB表达上调,这与CRC更晚的分期、低分化及较大的肿瘤相关.【期刊名称】《福建医科大学学报》【年(卷),期】2017(051)006【总页数】6页(P358-362,380)【关键词】结直肠肿瘤;蛋白质组学;脯氨酸;羟基化;质谱分析法【作者】陈德波;洪成业;王青兰;洪志鹏;施凉潘;池畔【作者单位】福建医科大学附属泉州第一医院城东新院普外科,泉州 362000;福建医科大学附属泉州第一医院城东新院普外科,泉州 362000;福建医科大学附属泉州第一医院城东新院普外科,泉州 362000;福建医科大学附属泉州第一医院城东新院普外科,泉州 362000;福建医科大学附属泉州第一医院城东新院普外科,泉州362000;福建医科大学附属协和医院结直肠外科,福州350001【正文语种】中文【中图分类】R341;R735.35;R977.6结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是一种常见的严重危害人类健康的恶性肿瘤，全世界每年大约有100万的新发、50万的死亡病例[1]。
差异蛋白分析方法差异蛋白分析是一种用于比较不同样本中蛋白质表达差异的方法。
在生物研究中，差异蛋白质的分析对于理解生物学过程的变化、疾病的发生和发展等具有重要意义。
下面将介绍几种常用的差异蛋白质分析方法。
1. 二维凝胶电泳（2-DE）：二维凝胶电泳是一种常用的分离和定量蛋白质的方法。
首先，通过等电聚焦将蛋白质在电泳液中按照等电点（pI）分离出不同pI的谱点，然后，使用SDS-PAGE将蛋白质按照分子量分离出不同大小的谱点。
最后，通过染色或质谱分析技术进行蛋白质的可视化和鉴定。
该方法可以同时分析数千种蛋白质，对于差异蛋白质的筛选具有高通量和分辨率高的优势。
2. 差异凝胶电泳（DIGE）：差异凝胶电泳是二维凝胶电泳的改进方法。
该方法利用荧光染料（如CyDye）对两组样本中的蛋白质进行荧光标记，然后将两组样本混合后共同进行电泳分离。
在同一个凝胶上，差异蛋白质的表达差异可以通过荧光信号强度的比较来确定。
相比于传统的二维凝胶电泳，DIGE方法的灵敏度更高，并且能够同时分析多个样本，适用于大规模样品分析。
3. 质谱分析：质谱分析是一种常用的蛋白质鉴定和定量方法。
主要有两种方法：基于质谱仪的定性分析和基于同位素标记的定量分析。
前者通过将蛋白质样品利用质谱仪进行断裂和离子化后，通过质谱图谱与数据库对比鉴定其潜在蛋白质；而后者则通过同位素标记技术（如TMT、iTRAQ等）对两组样品中的蛋白质进行标记，然后将标记样品混合后质谱分析，通过同位素峰的比较来定量差异蛋白质的表达水平。
4. 蛋白质芯片技术：蛋白质芯片是一种高通量和高灵敏度的蛋白质分析方法。
它利用固相支持介质上的已知蛋白质或蛋白质片段（如抗体、寡核苷酸）构建芯片，然后将样品中的蛋白质与芯片上的蛋白质发生特异性结合。
通过对芯片上信号的检测和分析，可以确定蛋白质的表达差异。
蛋白质芯片技术具有高通量、高灵敏度和高特异性等特点，可同时检测上千种蛋白质。
5. 高通量测序技术：高通量测序技术也可应用于差异蛋白质的分析。
双向凝胶电泳(2-DE)双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离,第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。
在目前情况下,双向凝胶电泳的一块胶板(16cm×20cm)可分出3~4千个,甚至1万个可检测的蛋白斑点,这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。
80年代开始采用固定化pH梯度胶,克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。
由于可以建立很窄的pH范围(如0.05U/cm),对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析,从而大大提高了分辨率。
此种胶条已有商品生产,因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。
这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。
第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法,可分离10~100kD分子量的蛋白质。
其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白,最灵敏的还是用同位素标记,20ppm 的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。
用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化,再经过计算机处理,去除纵向和横向的曳尾以及背景底色,就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度,得到布满蛋白斑点的图像,即所谓“参考胶图谱”。
蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白,进行定性和定量的分析。
最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析,确定它们是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析,也可先做4~5个循环的N末端微量测序,再做氨基酸组成分析;结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量,查对数据库中已知蛋白的数据,即可作出判断。
¹双向电泳技术原理及其应用刘上峰 傅俊江 综述 李麓芸 审校(中南大学湘雅医学院人类生殖工程研究室,湖南长沙410078)摘要:双向电泳技术是蛋白质组研究的核心技术之一,本文对其基本原理、分辨率、可重复性、相关数据库、减法分析等作了介绍,并对其今后的发展方向作了展望。
关键词:双向电泳; 蛋白质组; 数据库;减法分析中图分类号:R318133 文献标识码:A 文章编号:100121773(2002)022*******随着后基因组时代的到来,蛋白质组学应运而生。
双向电泳(tw o 2dimensional electrophoresis,22D E)作为蛋白质组研究的三大关键核心技术之一(另二种是质谱技术和计算机图像数据处理与蛋白质组数据库即蛋白质组信息学),仍然是目前分析组份复杂蛋白质分辨率最高的工具,因此日益受到人们的广泛关注。
1 双向电泳的基本原理首先根据蛋白质等电点不同在pH 梯度胶中等电聚焦(isoelec tric f ocusing,IEF)将其分离,然后按照它们的分子量大小在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS 2PAG E)第二次分离。
根据第一向等电聚焦条件的不同,可将22DE 分为三种系统:第一种系统是在聚丙烯酰胺凝胶中进行,两性电解质在外加电场作用下形成梯度,该系统称为IS O 2D A L T 。
其主要缺点是pH 梯度不稳定,重复性差,上样量低,不利于不同实验室间进行图谱比较;如果第一向电泳使用丙烯酰胺和Immobilines 共聚,形成具有pH 梯度的凝胶,这种系统称为IPG 2D AL T 系统,该系统pH 梯度稳定,不依赖于外加电场,基本上克服了ISO 2D AL T 的主要缺点,无论是重复性和上样量均优于I SO 2D AL T;第三种是非平衡pH 梯度电泳(nonequilibrium pH gradient electrophoresis,NEPhG E),主要用于分离碱性蛋白质,电泳展开时间相对比较短。
双向电泳的应用及研究进展摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。
本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。
同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。
关键词: 双向电泳，应用，前景1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。
双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。
双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。
就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。
1.2双向电泳基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。
双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。
第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。
在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。
双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。
因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
蛋白组学检测方法蛋白组学是一种利用高通量技术对蛋白质表达与功能进行系统研究的科学领域。
蛋白组学检测方法包括蛋白质分离、蛋白质定性和定量分析等多个环节。
下面将分别介绍蛋白组学检测的主要方法。
第一部分：蛋白质分离蛋白质分离是蛋白组学研究的基础，常用的分离方法主要包括凝胶电泳、质谱分离和亲和纯化等。
凝胶电泳是最常用的蛋白质分离技术之一，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（）和二维凝胶电泳（2-DE）。
主要用于分离蛋白质样品，可以根据分子量确定蛋白质的大小。
2-DE则通过将蛋白质首先按等电点（pI）进行分离，然后再按分子量进行分离，可以获得更高分辨率的蛋白质图谱。
质谱分离是另一种常用的蛋白质分离技术，主要包括液相色谱-质谱联用分析（LC-MS）和基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-TOF-MS）。
LC-MS通过将蛋白质样品在色谱柱中进行分离，然后通过质谱进行检测和分析。
MALDI-TOF-MS则通过将蛋白质样品与基质混合，然后通过激光解吸电离质谱进行检测和分析。
亲和纯化是利用蛋白质与特定结合分子之间的相互作用进行分离的方法。
常见的亲和纯化方法包括亲和层析和亲和捕获技术。
亲和层析通过将样品溶液通过含有特定结合分子的固定相进行分离，从而选择性地纯化目标蛋白质。
亲和捕获技术则是利用具有高特异性的抗体或配体捕获目标蛋白质。
第二部分：蛋白质定性和定量分析蛋白质定性和定量分析是蛋白组学研究中的重要环节，常用的方法主要包括质谱定性和定量分析、蛋白质芯片技术和蛋白质酶解及肽段识别等。
质谱定性和定量分析是蛋白组学中最常用的方法之一、定性分析通过分析蛋白质样品中的氨基酸序列、翻译后修饰位点等信息来鉴定目标蛋白质。
质谱定性通常与蛋白质分离技术相结合，如液相色谱-质谱联用分析。
定量分析则通过测定蛋白质样品中特定蛋白的丰度来比较不同样品之间的差异。
蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质定量和功能分析方法。
它通过将大量抗体或配体固定在玻片表面，并与蛋白质样品进行特异性结合，来实现对目标蛋白质的检测和分析。
一、什么是蛋白质组？与基因组差别？蛋白质组学的主要研究内容及技术体系？答：蛋白质组：Proteome，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。
蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这个概念最早是由Marc Wilkins 在1994年提出的。
基因组：Genome，一个细胞或者生物体所携带的一套完整的单倍体序列，包括全套基因和间隔序列。
可是基因组测序的结果发现基因编码序列只占整个基因组序列的很小一部分。
因此，基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。
二者区别：蛋白质组研究和基因组研究依然是形影相随的两个重要领域，它们之间既为互相补充又能互相帮助，但二者之间仍有一些区别：蛋白质组：多样性，无限性，动态性，空间性，互相作用。
基因组：同一性，有限性，静态性，周期性，孤立性。
蛋白质组学的主要研究内容：（1）表达蛋白质组学(expressionproteomics)：是对蛋白质组表达模式的研究，即检测细胞、组织中的蛋白质，建立蛋白质定量表达图谱，或扫描表达序列(EST)图谱。
在整个蛋白质组水平上提供了研究细胞通路、疾病、药物相互作用和一些生物刺激引起的功能紊乱的可能性，对寻找疾病诊断标志、筛选药物靶点、毒理学研究等具有重要作用。
（2）细胞图谱蛋白质组学(cellmapproteomocis)：是对蛋白质组功能模式的研究，即确定蛋白质在亚细胞结构中的位置和鉴定蛋白质复合物组成等，便于研究蛋白质在细胞内的行为、运输及蛋白质相互作用网络关系，它对确定蛋白质功能和疾病诊疗的靶位极有价值。
蛋白质组学技术体系：（1）蛋白质组学分离技术，在整个蛋白质组学的研究中，分离技术是最基础的部分。
双向凝胶电泳和二维色谱技术检测大肠癌蛋白质谱的意义李峰师庆红张晓静何成彦赵丽纯1郭宏华（吉林大学中日联谊医院，吉林长春130033）〔摘要〕目的利用双向凝胶电泳和二维色谱技术分析Dukes B 期大肠癌肿瘤与癌旁组织蛋白质差异，为大肠癌的早期诊断、生物学治疗寻找新的靶点。
方法①双向凝胶电泳技术和质谱技术鉴定大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组；②二维色谱技术和质谱技术鉴定大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组。
结果在大肠癌肿瘤组织与癌旁组织差异蛋白中两种技术路线有13个蛋白得到一致的鉴定结果，其中在肿瘤组织中表达上调的有7个，表达下调的有6个。
结论两种技术路线共同鉴定出的差异蛋白质是有意义的，对研究大肠癌的发病、转移及复发机制提供了依据和方向。
〔关键词〕双向凝胶电泳；二维色谱技术；质谱；大肠癌；蛋白质组学〔中图分类号〕R735〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）03-0497-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.03.026基金项目：吉林省科技厅资助项目（No.20100742，200705387，20050702-4，20090461）1吉林大学药学院通讯作者：郭宏华（1964-），女，副教授，副主任医师，硕士生导师，主要从事消化道肿瘤的发病机制及治疗研究。
第一作者：李峰（1979-），女，在读硕士，主要从事肿瘤分子生物学研究。
大肠癌（colon cancer ）是一种常见的消化道恶性肿瘤，死亡率在世界范围内居各种肿瘤的第三位，在西方居第二位，并且发病率和死亡率均有逐年上升的趋势〔1，2〕。
大肠癌的发生和发展受到基因和环境等多种因素的影响，其病理机制复杂，从单一的基因突变和分子通道的变化难以全面理解大肠癌的发生机制。
蛋白质组学是近年来发展起来的新兴学科，已经广泛应用于肿瘤研究的诸多方面。
本文拟采用双向凝胶电泳和二维色谱技术分析Dukes B 期大肠癌肿瘤与癌旁组织蛋白质的差异性，为大肠癌的早期诊断、生物学治疗寻找新的靶点。
1材料与方法1.1组织标本收集吉林大学中日联谊医院手术治疗的大肠癌患者18例，年龄49 78岁，其中男13人，女5人。
在手术中获得的癌组织均是新鲜标本。
所获得的癌旁正常组织均距离癌边缘10cm 之外、切缘正常组织，并且所取的正常组织标本均是在癌组织上端。
标本离体后立即取材，生理盐水冲洗，放入液氮冷冻，－80ħ保存。
病人术前未接受任何治疗。
取部分组织标本进行石蜡包埋、切片、HE 常规染色，病理学检查证实组织类型，均是Dukes B 腺癌。
1.2主要试剂载体两性电解质（Bio-Lyte 3-10）、IPG 预制胶条（pH3 10，17cm ；pH5 8，17cm ）、矿物油、碘代乙酰胺（IAA ）购自Bio-Rad 公司（Hercules ，CA ，USA ）。
尿素、硫脲、精胺、蔗糖、甘油、三羟甲基氨基甲烷、3-〔（3-胆酰胺丙基）-二乙胺〕-丙磺酸（CHAPS ）、丙烯酰胺、N ，N ，N'，N'-四甲基乙二胺（TMED ）、甘氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS ）、溴酚蓝、考马斯亮蓝G-250、苯甲基磺酰氟（PMSF ）购于Sigma 公司（St Louis ，MO ，USA ）。
低熔点琼脂糖、甲叉双丙烯酰胺、DTT 、TPCK 修饰的测序级胰酶购自Promega 公司。
过硫酸铵、碳酸氢氨、硝酸银、甲醛、乙醇、硫代硫酸钠、冰乙酸为国产分析纯。
蛋白质定量试剂盒（RC DC Protein Assay Kit ）购于Bio-Rad 公司。
1.3方法1.3.1双向凝胶电泳技术和质谱技术鉴定大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组利用裂解缓冲液制备肿瘤组织与癌旁组织总蛋白，然后分别取肿瘤组织与癌旁组织总蛋白各1mg ，分别加入水化上样缓冲液至终体积300μl 。
经pH 3 10等电聚焦分离和SDS-PAGE 电泳分离后，考马斯亮蓝染色，利用PDQUEST 软件对电泳图像进行分析、剪切，建立匹配组并进行归一化处理。
最后建立分析组，比较匹配点之间光吸收度的差异，获得肿瘤组织与癌旁组织总蛋白质的差异蛋白表达谱。
1.3.2二维色谱技术和质谱技术鉴定大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组首先利用裂解缓冲液制备肿瘤组织总蛋白，然后分别用25mmol /L NH 4HCO 3稀释，使尿素浓度低于2mmol /L 。
经酶解后，将酶解产物进行二维液相色谱与质谱联用分析，得到肿瘤组织酶解混合物的多肽质谱数据。
2结果2.1双向凝胶电泳技术和质谱技术2.1.1肿瘤组织与癌旁组织的差异蛋白表达谱肿瘤组可分离（614ʃ36）个蛋白点，癌旁组可分离（682ʃ24）个蛋白点，匹配率为83.3%。
其中肿瘤组织中21个蛋白质点的表达量有显著差异，其中有14个表达上调，有7个表达下调。
2.1.221个差异蛋白质点的质谱鉴定直接切取21个差异蛋白质点，进行胶内酶切和肽段提取。
然后在MALDI-TOF-TOF （DE STR ，Applied Bio systems ）质谱仪上进行肽质量指纹分析。
将得到的数据用Mascot 检索引擎在Swiss Prot 数据库中进行检索，对21个蛋白质点进行鉴定。
2.2二维色谱技术和质谱技术2.2.1肿瘤组织总蛋白酶解混合物二维色谱与质谱联用分析共鉴定29825个多肽序列，得到860个蛋白质的鉴定数据。
2.2.2癌旁组织总蛋白的二维色谱与质谱联用分析共鉴定了40388个多肽序列，共得到549个蛋白质的鉴定数据。
2.2.3肿瘤与癌旁组织差异蛋白质的质谱分析应用实验中每个蛋白的图谱评价其丰度。
对于在不同样品中丰度发生变化的蛋白，其谱图数变化必须满足以下原则：①两个样品中谱图数的比值≥1；②两个样品中谱图数的差值≥72（平均每次实验差值为24）。
为评价上述方法用于鉴别蛋白丰度变化的假阳性率，每个样品进行3次实验，然后比较结果，相应假阳性率为2.13%。
将肿瘤与癌旁组织的蛋白质组分析的结果进行比对，依据上述评价原则及标准得到44个蛋白质具有显著差异，其中肿瘤组织中21个蛋白表达上调，23个蛋白表达下调。
2.3双向凝胶电泳和二维色谱技术的对比在大肠癌肿瘤组织与癌旁组织差异蛋白中有13个蛋白得到一致的鉴定结果，其中在肿瘤组织中表达上调的蛋白有7个，表达下调的蛋白有6个。
见表1。
表1肿瘤组织表达上调（A1 A7）和下调（B1 B6）的蛋白质鉴定结果蛋白点蛋白质ID 蛋白质名称分子量（kD ）等电点Mascot 评分匹配率（%）匹配的多肽数A1Q670S4血红蛋白Lepore-Baltimore （片段）11.4591 6.21126678A2P1080960kD 线粒体热休克蛋白61.0546 5.59855922A3P25705线粒体ATP 合酶59.75069.48925318A4P05783角蛋白，I 型cytoskeletal 1848.0578 5.21654215A5P30101蛋白质disulfide-isomerase A356.7824 5.95823616A6P06733烯醇化酶47.16897.161328513A7P06748核磷蛋白亚型132.575 4.49714510B1O15061Desmuslin 亚型1172.7675 4.9678172.7675 4.96B2Q01995Transgelin 22.61099.2810522.61099.28B3P17661结蛋白53.5357 5.078653.5357 5.07B4P51911钙调理蛋白133.17049.4213233.17049.42B5P04792热休克蛋白β22.7825 5.977122.7825 5.97B6P18206纽蛋白亚型2123.79935.3986123.79935.393讨论双向凝胶电泳和二维色谱一直是目前蛋白质组学的两大重要分离技术，双向凝胶电泳作为传统的技术手段由于其价格较低、易于操作等特性，一直被大多数实验室所采用〔3，4〕。
但是一些特殊的蛋白质，如：强碱、强酸，过大、过小以及膜蛋白质，现在还不能用双向凝胶电泳方法进行分离，所以需要发展其他·894·中国老年学杂志2012年2月第32卷相关技术。
而随着色谱技术的迅猛发展，发展可替代或补充双向凝胶电泳的新方法成为蛋白质组学研究技术最主要的目标。
由于二维色谱质谱联用技术具有分析范围广、分析能力强、定性分析结果可靠、检测限低、分析时间快、自动化程度高等特点，所以液质联用技术成为分离、鉴定复杂混合物最有效的手段〔5，6〕。
二维色谱（2D-LC ）、二维毛细管电泳（2D-CE ）、液相色谱－毛细管电泳（LC-CE ）等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。
本实验利用双向凝胶电泳和二维色谱两大分离技术对Dukes B 期大肠癌肿瘤组织与癌旁组织进行鉴定分析，两种方法所得到的结果有不一致的地方，主要原因为：①双向凝胶电泳方法测定的pH 范围相对液质联用要窄，双向电泳等电聚焦分离的pH 是3 7，而二维色谱方法测定的范围要比双向电泳广；②双向凝胶电泳在蛋白质提取的过程中必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和重复性的物质，比如核酸、脂类、多糖等大分子以及盐类小分子。
大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG 胶条，这样都会造成2-DE 的失败，而二维色谱方法分析范围广、分析能力强、检测限低。
但两者共同鉴定出的差异蛋白质对研究大肠癌的发病、转移及复发机制提供了依据和方向。
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