通气发酵

第一章 通气发酵 第一节 固体菌种的制作 实验原理： 固体培养是气体作为生物反应过程中的O2、CO2、热量、营养和产物的传递介质，表现为O2、CO2扩散比较容易，热量传递困难，存在明显的营养梯度，并且无大量有机废水产生。固态培养的最关键是基质和适合的水分。在适宜的水分和基质条件下，菌丝体能很快生长，取得较为好的生长效果。通常采用的基质有麸皮、米糠和大米等。 麸皮除了含有丰富的影响物质，如61.4％碳水化合物、15.9％蛋白质，而且含有各种维生素和无机盐，能满足微生物生长所需的碳源、氮源、无机盐的需求，是天然的培养基材料。麸皮不同于大米或小米，含有30％左右的纤维素和半纤维素，因而麸皮之间黏度低，在湿度相对较大时仍具有较好的通气和散热效果，是较为适合的固体菌种制作原料。 麸皮作为固体培养物通常要经过高温灭菌处理。灭菌是指杀灭一定环境中的所有微生物，固体培养基灭菌通常采用高温蒸汽灭菌，但由于固体培养基由于热传质系数小因此，所需时间较长。另外灭菌时间较长有利于麸皮中基质空间二级结构的破坏成为无规则结构有利于微生物的利用。 不同的菌种由于菌种本身特性、培养时间、温度以及菌种生长速度不同，制种时需要的水分不同 目的：①了解固体发酵基本原理和固体培养基的制备； ②了解并掌握影响麸曲菌种质量的因素； 主要器材： 菌种：金耳试管斜面菌种 原料：麸皮，要求无霉变，粉碎度适中。 仪器：天平，量筒，高压蒸汽灭菌锅，牛角匙，pH试纸，三角瓶，玻璃棒，棉花，纱布，牛皮纸，记号笔，酒精灯，超净台，酒精。 步骤：准确称取一定量的麸皮，按照麸皮：水＝3：4的比例量取一定体积的水混合均匀，分装250mL三角瓶，每瓶25g，擦干净瓶口，洗净瓶外壁，用棉塞封口，再覆盖牛皮纸或报纸。1Kg/cm2压力灭菌1小时。灭菌后冷却到室温，放到超净台，紫外灯照射30分钟，接种金耳斜面菌种。 将金耳斜面菌种切成长约1cm长的菌块，按无菌操作要求接入灭过菌的装有麸皮培养基的三角瓶中。27℃培养6～7天。在培养过程中在第3－5天每天摇动1次。菌丝长满瓶备用。 思考题：1）固体菌种制作过程中灭菌的作用 2）固体菌种制作过程中的质量控制点是什么？ 第二节 液体菌种的制备 实验原理： 液体摇瓶培养是液体作为生物反应过程中的O2、CO2、热量、营养和产物的传递介质，主要表现为O2是生长主要限制性因子。液态培养的最关键是溶氧。在适当的培养基和温度条件下，通过摇床液体摇瓶培养，菌丝体能很快生长，取得较好的生长效果。 影响液体菌种培养的主要条件是培养基组成、酸碱度、温度、渗透压和装液量和转速，不同的菌种对这些因子要求不同，在适合的条件下，药食用菌转化碳源，利用氮源和其他生长因子，都能取得较为满意的生长。 目的：①了解液体菌种制作的基本原理和液体培养基的制备； ②了解并掌握影响液体菌种质量的因素 主要器材 菌种：实验一培养的固体菌种 原料：葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，KH2PO4，MgSO4，麸皮，玉米粉，黄豆饼粉，酒精。 仪器：天平，量筒，高压蒸汽灭菌锅，摇床，三角瓶套，牛角匙，pH试纸，三角瓶，玻璃棒，棉花，纱布，牛皮纸，记号笔，超净台。 步骤：按要求准确称取一定量的玉米粉4g，蛋白胨0.4g，葡萄糖8g，加水400mL，加热，蛋白胨完全溶解后分装250mL三角瓶4只，每只100mL。擦干净瓶口，洗净瓶外壁，用八层纱布封口，再覆盖牛皮纸或报纸。1Kg/cm2压力灭菌0.5小时。灭菌后冷却到室温，放到超净台，紫外灯照射30分钟，接种实验一中培养的金耳麸曲菌种。 将麸曲菌种摇碎，按无菌操作要求接入三勺麸曲菌种到装有液体培养基的三角瓶中。27℃摇床，150rpm培养培养1～2天。 思考题：1）液体菌种培养关键限制性基质是什么，通过哪些手段可以降低这种基质限制。

第三节 液体深层培养

实验原理 1、液体菌种设备基本原理 任何一种食用菌自身的生长必须满足其对温度、湿度、需氧量、养分等的需要，同时必须避免杂菌感染。液体菌种发酵设备(包括四大系统，温控系统由控制器、电热管等组成；供气系统由空气压缩机、输送管道、空气过滤器等组成；冷却系统由热交换器、进出水管道组成；搅拌系统由电机、搅拌轴、挡板等组成。 2、液体菌种生产的关键技术 ①溶氧量 液体菌种生产中最关键的是培养液中氧的溶解量，因为在菌丝生长过程中，必须不断的吸收溶解其中的氧气来维持自身的新陈代谢，氧气在液体(水)中的;溶解量与压力、温度有关，同时与培养液的接触面积、渗透压有很大的关系。因此我们设计发酵设备时有效地解决了这些问题，如安装搅拌和挡板。 ②空气过滤 技术的关键就是保证进入的空气无菌度高，因此必须选择孔径小、材料先进的过滤膜。一般细菌直径在。1～3m酵母菌在I一10m，病毒一般在20～400nm，所以选择过滤膜时应综合考虑以上因素。当然如果选的太小，成本将大幅度提高。另外环境对于空气影响很大，在空气压缩机房、制种车间必须保持环境清洁。 ③培养液 培养液是菌丝生长发育的营养源，要求营养全面均衡。不同的菌种对营养要求偏重不同。配制原料有糖、麸皮、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素、蛋白胨、土豆汁、酵母浸膏等。配置培养液时，先将土豆片、麸皮一起煮熟，将汁液滤出，后加入其它辅料混匀即可。 ④接种 培养器上端有接种口，也是装料口，将母种并瓶后而后必须在无菌的条件下接入罐体内，要求动作快、操作准确。 ⑤环境 如前所述，环境对菌种生产影响很大，过滤器本身不可能把杂菌百分之百地滤掉，减少环境中的杂菌基数是非常重要的，液体菌种母种接入到经灭菌的培养液中只要能形成对杂菌的生长优势就可以抑制杂菌感染，也就是说，液体菌种培养不是建立在绝对无菌的前提下相反是建立在相对无菌的前提下。就此意义上说，保持环境洁洁，减少空气中杂菌基数，对于提高菌种培养成功率意义较大。

实验目的： ①了解机械搅拌发酵罐、气流搅拌发酵罐的基本结构和原理 ②液体深层培养的基本原理； ③发酵不同时期菌丝形态观察和生理生化指标测定

主要器材： 菌种：实验二培养的液体菌种 原料：葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，KH2PO4，MgSO4，麸皮，玉米粉，黄豆饼粉，酒精。 仪器：天平，量筒，机械搅拌发酵罐，摇床，电炉，搪瓷杯、刻度试管、721分光光度计、牛角匙，pH试纸，纱布培养皿，烘箱。

实验步骤： 1. 准备工作 ① 打开夹套排水阀和排空阀；打开控制柜电源，将智控仪置于暂停状态，并设定好各参数值； ② 开启蒸汽发生器（详见蒸汽发生器操作流程），使蒸汽压力保持在0.3Mpa左右；开启空气压缩机，使压力保持在0.4～0.7Mpa之间； 2. 过滤器消毒 ③ 由于减压阀不能消毒，因此消毒前应关闭通向粗空气过滤器的阀门； ④ 打开蒸汽发生器出汽阀向外供汽，使蒸汽通过蒸汽过滤器净化后对金属空气过滤器进行消毒，同时打开阀门排气阀等，使所有的空气管路得到彻底的消毒。消毒过程中，所有的排空阀都应微微开启。 ⑤ 空气管路部分消毒20～30分钟后，应关闭蒸汽、打开进气阀，用空气将过滤器和管路吹干。 3. 罐体空消 ⑥ 打开与罐体内筒体相连的阀门，对罐体进行空消。 ⑦ 当罐温升至121℃左右后，调节蒸汽进汽阀和罐盖上的排空阀，使罐压保持在0.11Mpa左右、罐温保持在121℃左右，约30分钟后，关闭所有蒸汽阀，将罐压放掉。 4. 实消 ⑧ 按照工艺要求，将配好的培养基（按18L料配制培养基培养基组成：葡萄糖720g、麸皮360g、玉米粉240g、KH2PO424g、MgSO412g）从加料口放入罐内（应考虑实消时蒸汽的冷凝水和种子量）；打开电机开关，速度控制在120转左右，对发酵液进行搅拌。 ⑨ 先从蒸汽从夹套对发酵液进行预热； ⑩ 当罐温升至90℃左右时，关闭搅拌电机，停止搅拌，将蒸汽直接通入发酵罐进行加热； ⑪ 调节进、排汽阀，使罐压保持在0.11Mpa左右、罐温保持在121℃左右，约30分钟后，关闭所有蒸汽阀，当压力降到0.05Mpa左右，打开空气进气阀和排气阀和搅拌，保持罐压在0.05Mpa左右。 ⑫ 用自来水通过夹套对发酵液进行快速冷却。 5. 接种、培养 ⑬ 将蠕动泵开关置于开的位置，将智控仪处于运行状态，此时温度等参数将按照设定值进行自动控制。 ⑭ 当温度达到培养所需温度时，准备好摇瓶种和酒精火圈；减小进气量，开大排气量，使罐压接近于0；点燃酒精火圈，将火圈套在接种口上，用工具打开接种口，将摇瓶种到入发酵罐中，并迅速盖上接种口；调节进、排气，使罐压保持在0.7Mpa左右，即进行正式培养。 ⑮ 取出已消毒并冷却的补液瓶及硅胶管，将硅胶管装到蠕动泵头上、另一端接到罐盖上补液接头上（应降低罐压后再安装），将加碱、消泡、补料等蠕动泵开关置于自动控制状态（向下），则pH值、消泡、补料等参数即按照设定值进行自动控制，自动加碱、消泡、补料。 6. 取样 在发酵过程中，可根据工艺要求，每隔一段时间取样观察，取样的操作过程如下： ⑯ 打开蒸汽发生器，使蒸汽达到0.3Mpa，先对取样口进行消毒，约5～10分钟左右；放掉前面部分料液后，用取样试管取样即可； ⑰ 再次对取样口进行消毒，约5～10分钟左右；关闭蒸汽发生器出汽阀，蒸汽发生器。

7. 出料 当取样检查发现指标达到预期目标时，即说明发酵过程已完成，此时应停止发酵，及时出料，出料的操作过程如下： ⑱ 开蒸汽发生器，使蒸汽达到0.3Mpa；对出料口进行消毒，约5～10分钟左右； ⑲ 打开出料阀，料液即从罐中排出； ⑳ 关闭控制柜电源，整个发酵过程结束。 8. 清洗 发酵液出完后，应及时用蒸汽对发酵罐进行冲洗消毒，并用清水清洗，以备下次使用。 思考题：1）空消的目的是什么，如何空消？ 2）发酵罐的基本结构？各部件的比例关系？ 3）发酵终点的判断？ 4）火焰接种的基本原理？ 5）夹套加热的注意事项。