实验三细菌涂片的制备及革兰氏染色[实验目的]1、掌握细菌涂片的制备方法及革兰氏染色。
2、学习无菌操作，树立无菌观念。
[实验原理]细菌细胞微小，无色而半透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助染色使菌体着色（由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用以及离子交换、酸碱亲和等化学作用，染料能使细菌着色，并且因细菌细胞的结构和化学成分不同而有不同的染色反应）后，使其与背景形成明显的色差，从而能较清楚的观察到细菌的基本形态和结构。
根据不同的染色反应，可作为鉴别细菌的一种依据。
微生物染料是一种带苯环的有机化合物，其分子上具有发色基团和助色基团。
前者给化合物以特有的颜色，但不能与细菌结合；后者使化合物具成盐的性质，能和菌体结合。
分为碱性染料、酸性染料和中性染料三类。
根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为三种方法即简单染色、鉴别染色和特殊染色。
革兰氏染色：1884年由丹麦病理学家C.Gram创立。
此法可将所有细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。
是细菌学上最常用的鉴别染色法，有着重要的理论和实践意义。
其染色过程是先用草酸铵结晶紫进行初染，再加媒染剂-革兰氏碘液，以增加染料和细胞的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子量较大的复合物，然后用脱色剂-乙醇脱色，最后用沙黄液复染。
凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）者即为G+菌，反之，脱色后染上复染剂颜色（红色）者即为G-菌。
其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同，通过染色加以鉴别。
革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，且类脂质含量少，经乙醇处理发生脱水作用后反而使其孔径缩小，通透性降低，结晶紫-碘形成的复合物保留在细胞内而不被脱色，结果细胞呈现紫色。
而革兰氏阴性菌的的肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂质含量较高，经乙醇处理后，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，结果细菌被脱色，再经沙黄复染后呈现红色。
微生物实验微生物实验细菌形态观察细菌分布消毒灭菌细菌形态观察一、实验目的1.掌握光学显微镜（油镜）的使用及日常维护2.掌握细菌的三种形态3.掌握临床常见细菌的形态及染色4.掌握细菌的特殊结构5.了解支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体及真菌的结构特点二、实验原理1. 普通光学显微镜（油镜）的使用1. 在标本欲检部位滴一滴香柏油，然后转换油镜头2. 从侧面观察并慢慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，以免碰撞玻片，用双眼观察目镜，同时调节细调节器，直至细菌清晰3. 根据需要调节显微镜亮度2. 普通光学显微镜的维护1.移动显微镜时，用右手持镜壁，左手托镜座，平端于胸前2.油镜用毕后，要立即用擦镜纸擦去香柏油；再用滴有二甲苯的擦镜纸擦油镜头；最后，用干净擦镜纸将镜头上的二甲苯擦去，以免损伤油镜头3.镜头擦净后，降低接物镜并将其转成八字形，罩好镜罩放入柜内4.做好使用记录3．微生物知识1．细菌按形态分类：球菌：球形（包括双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌、链球菌等）杆菌：杆状（包括单杆菌、双杆菌、链杆菌、分枝杆菌、双歧杆菌等）螺旋菌：螺旋状（包括螺旋菌、弧菌等）2．细菌的基本结构细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、核蛋白体3．细菌的特殊结构荚膜：如肺炎双球菌鞭毛：又分单毛菌、双毛菌、丛毛菌、周毛菌。
如：变形杆菌为周毛菌菌毛芽胞：如破伤风梭菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒梭菌4．微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，包括原核类、真核类和非细胞类。
原核类：细菌、放线菌、蓝藻、衣原体、支原体、立克次氏体真核类：真菌、原生动物、显微藻类非细胞类：病毒、亚病毒5．真菌单细胞：圆形、芽生孢子。
如：酵母菌多细胞：菌丝及孢子、孢子出芽。
如：霉菌6．白假私酵母菌（白念）生物学性状：G+单细胞真菌、芽生孢子、类酵母型菌落厚膜孢子、假菌丝有助于鉴定致病性：皮肤粘膜——鹅口疮、内脏感染、CNS感染微生物学检查：直接涂片、染色后镜检——菌体、芽生孢子、假菌丝7．新型隐球菌生物学性状：圆形酵母型菌、外周有厚荚膜（比菌体大1-3倍）致病性：吸入后侵犯皮肤、粘膜等——慢性炎症和脓肿；侵袭CNS——亚急性或慢性脑膜炎微生物学检查：脑脊液离心后取沉淀、痰和脓标本直接检查；墨汁负染见出芽菌体外围有宽厚荚膜为阳性三、实验材料记号笔：1支；大镊子：1支；火柴：1盒；蜡笔：1支；试管架：1个；酒精灯：1个；接种环：1支；Olympus显微镜：1台；显微镜使用记录本：1个四、实验内容1. 观察细菌三种形态1）球菌链球菌、葡萄球菌、肺炎双球菌（子弹形）、脑膜炎双球菌（蚕豆形）、四联菌2）杆菌破伤风杆菌、白喉杆菌（异染颗粒）、绿脓杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌3）螺形菌弧菌——霍乱弧菌；螺菌；螺杆菌——幽门螺杆菌；弯曲菌2. 观察细菌的特殊结构芽胞、鞭毛、荚膜、异染颗粒、钩端螺旋体、幽门螺杆菌3. 绘图葡萄球菌(staphyloccocus)；肺炎双球菌(pneumo coccus)；脑膜炎球菌(meningococcus)；破伤风杆菌（Clostridium Tantenus）；霍乱弧菌（vibrio cholera)；芽胞(spore)；鞭毛（flagellum)；荚膜(capsule)；钩端螺旋体(leptospira)五、实验结果绘8幅细菌镜下图，已交。
微生物学实验(本科生必修课共32学时)教学安排与学时分配每周4学时¾实验1 实验室环境和人体体表微生物的检测¾实验2 细菌形态的观察¾实验3 细菌的简单染色；革兰氏染色¾实验4 细菌荚膜和鞭毛染色；鞭毛运动观察¾实验5 放线菌、真菌形态结构的观察¾实验6 微生物测微技术和计数¾实验7 培养基的制备与灭菌¾实验8 微生物的纯种分离与培养¾实验9 细菌鉴定中生理生化反应¾实验10 噬菌体的效价测定¾实验11 水中微生物的检测（开放实验）¾实验12 产蛋白酶和淀粉酶芽孢杆菌的分离和活力检测（开放实验）¾实验13 微生物多糖——黄原胶的发酵和提取（开放实验）（一）细菌的染色及形态观察(实验3，2)¾认识细菌的基本形态，学习和掌握细菌压滴片的制作方法。
¾学习微生物涂片染色的基本技术。
¾掌握微生物革兰氏染色的基本原理和方法。
¾熟练掌握显微镜(油镜)的使用方法。
¾了解不同的微生物在斜面上、固体培养基和液体培养基中的生长特征。
目的要求实验原理¾微生物的培养特征是指微生物在固体培养基上和液体培养基中生长后所表现出的群体形态特征。
¾不同的微生物有其固有的培养特征，直线接种在固体培养基上培养时，会呈现出丝状，带刺状、小突起状、薄膜状、扩展状等菌苔特征。
¾细菌的个体微小（1～10 μm）¾光学显微镜下可以看到它们的个体形态球形、杆状、和螺旋形等¾染色后的菌体与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
¾简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
¾常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，带正电荷，因此碱性染料很容易与细菌结合使细菌着色。
