实验四 细菌的革兰氏染色与芽孢染色

实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色一、目的要求1.学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。

2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

二、实验材料1.菌种：金黄色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli）2.试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。

三、实验原理革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。

通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。

革兰氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。

经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革兰氏阴性菌。

大肠杆菌是标准的革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革兰氏阳性菌。

革兰氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。

经结晶紫初染以后，所有的细菌都被染成蓝紫色。

碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。

当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。

用蕃红复染时染上红色。

四、操作步骤1.细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。

2.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。

3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。

4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

5.脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。

⼤⼆下--微⽣物学实验总结实验⼀、常⽤培养基配制⼀、器⽫清洗1、试管、培养⽫、三⾓瓶、烧杯等玻璃器⽫的清洗⽤瓶刷或海绵沾上洗⾐粉等洗涤剂刷洗，然后⽤⾃来⽔充分冲洗⼲净。

热的肥皂⽔去污能⼒更强，可有效地洗去器⽫上的油污,去离⼦⽔润洗，倒置晾⼲或烘⼲。

2、全⾃动实验室玻璃器⽫清洗机预清洗洗涤剂清洗⾃来⽔冲洗纯⽔冲洗 135℃⾼温⼲燥消毒3、装有固体培养基的器⽫应先将其刮去，然后洗涤。

带菌的器⽫在洗涤前先浸在2％煤酚皂溶液（来苏尔）或0.25％新洁尔灭（苯扎溴铵）消毒液内24⼩时或煮沸半⼩时，再⽤上法洗涤。

带病原菌的培养物最好先⾏⾼压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进⾏洗涤。

⼆、载玻⽚与盖玻⽚的清洗⽤过的载玻⽚与盖玻⽚如滴有⾹柏油，要先⽤皱纹纸擦去或浸在⼆甲苯内摇晃⼏次，使油垢溶解，再在肥皂⽔中煮沸5～10分钟，⽤软布或脱脂棉花擦试，⽴即⽤⾃来⽔冲洗，最后⽤蒸馏⽔润洗数次，待⼲后浸于95％酒精中保存备⽤。

使⽤时在⽕焰上烧去酒精。

三、器⽫包扎1、培养⽫的包扎培养⽫常⽤⽜⽪纸密密包紧，⼀般以5～8套培养⽫作⼀包，包好后进⾏灭菌。

2、试管和三⾓烧瓶等的包扎试管和三⾓瓶盖上铝帽或者塑料帽后⽤⽜⽪纸包扎，进⾏灭菌。

包纸的⽬的在于保存期避免灰尘侵⼊。

四、器⽫清洗和包扎⼩结微⽣物学实验室所⽤的玻璃器⽫的质量要求硬质玻璃，能承受⾼温和短暂烧灼⽽不致破损；器⽫的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器⽫的形状和包扎⽅法的要求，以能防⽌污染杂菌为准；洗涤⽅法不恰当也会影响实验结果。

因此，在实验准备的时候要严格按照要求洗涤实验器⽫。

包扎并灭菌后备⽤。

五、培养基配制⽜⾁膏蛋⽩胨培养基（培养⼀般细菌⽤）⽜⾁膏 3g 蛋⽩胨 10g NaCl 5g 琼脂 15～20g ⽔ 1000ml实验原理：在配制固体培养基时要加⼊⼀定量琼脂作凝固剂。

琼脂在常⽤浓度下96℃时溶化，在40℃时凝固，通常不被微⽣物分解利⽤。

固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和⽓温的不同⽽有所不同。

一、实验目的1. 掌握细菌革兰氏染色的原理和方法。

2. 学会使用油镜观察细菌的形态。

3. 了解革兰氏染色在细菌分类鉴定中的重要性。

二、实验原理革兰氏染色是细菌学中一种重要的染色方法，主要用于区分细菌的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在细胞壁结构上存在显著差异，导致它们在革兰氏染色过程中表现出不同的染色特性。

革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量高，交联度大，乙醇脱色处理后，细胞壁收缩，但结晶紫-碘复合物仍然被留在细胞内，使细菌呈紫色。

而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，肽聚糖层薄且交联度差，乙醇脱色处理后，细胞壁溶解，结晶紫-碘复合物被脱出，再经碱性品红染液复染，使细菌呈红色。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、革兰氏染色液（草酸铵结晶紫、碘液、95%乙醇、碱性品红染液）、载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、酒精灯等。

2. 仪器：显微镜、油镜、移液器、移液吸头等。

四、实验步骤1. 涂片：取一环蒸馏水于载玻片中央，用接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与玻片上的水滴均匀混合，并涂成约1cm²的薄菌膜。

2. 固定：将涂片在空气中干燥，手持玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上快速通过3次，以让菌膜更加牢固地贴在玻片上，待冷却后滴加染料。

3. 初染：手持玻片一端，滴加草酸铵结晶紫染液染色2min后，倾去染液。

4. 媒染：向涂片滴加碘液，媒染1min后，倾去碘液。

5. 脱色：向涂片滴加95%乙醇，脱色30s，观察菌体颜色变化，直至出现红色。

6. 复染：向涂片滴加碱性品红染液，复染1min后，倾去染液。

7. 洗涤：用蒸馏水冲洗涂片。

8. 染色观察：用油镜观察菌体形态和染色特性。

五、实验结果与分析1. 枯草芽孢杆菌：呈革兰氏阳性菌，细胞壁厚，呈紫色。

2. 金黄色葡萄球菌：呈革兰氏阳性菌，细胞壁厚，呈紫色。

六、实验讨论革兰氏染色是一种简单、快速、有效的细菌分类方法。

一、实验目的1. 掌握显微镜油镜的使用方法。

2. 观察细菌的基本形态结构，如细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等。

3. 了解细菌的特殊结构，如鞭毛、荚膜、芽孢等。

4. 培养对细菌形态结构的识别能力。

二、实验原理细菌是单细胞微生物，具有多种形态结构。

通过显微镜观察，可以了解细菌的基本形态和特殊结构，为细菌的分类、鉴定和致病性研究提供依据。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：细菌样本、革兰氏染色液、芽孢染色液、水浸片、盖玻片、载玻片等。

2. 仪器：光学显微镜、酒精灯、载物台、切片刀、镊子等。

四、实验步骤1. 观察细菌样本（1）将细菌样本滴在载玻片上，用盖玻片封口。

（2）在显微镜下观察细菌的基本形态结构，如细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等。

2. 革兰氏染色（1）将革兰氏染色液滴在细菌样本上，用酒精灯加热。

（2）观察染色后的细菌，判断其革兰氏分类。

3. 芽孢染色（1）将芽孢染色液滴在细菌样本上，用酒精灯加热。

（2）观察染色后的细菌，判断其芽孢存在与否。

4. 观察细菌特殊结构（1）观察细菌是否有鞭毛、荚膜等特殊结构。

（2）通过水浸片观察细菌的运动。

五、实验结果与分析1. 细菌样本的基本形态结构（1）观察到的细菌具有细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等基本结构。

（2）部分细菌具有鞭毛、荚膜等特殊结构。

2. 革兰氏染色结果（1）部分细菌呈现革兰氏阳性，细胞壁较厚，不易着色。

（2）部分细菌呈现革兰氏阴性，细胞壁较薄，易着色。

3. 芽孢染色结果（1）部分细菌存在芽孢，呈圆形或椭圆形。

（2）部分细菌无芽孢。

4. 细菌特殊结构观察结果（1）部分细菌具有鞭毛，呈螺旋状。

（2）部分细菌具有荚膜，呈透明状。

六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了显微镜油镜的使用方法。

2. 观察了细菌的基本形态结构和特殊结构，了解了细菌的生物学特性。

3. 培养了对细菌形态结构的识别能力，为今后的学习和研究奠定了基础。

七、注意事项1. 使用显微镜时，注意调节光圈和焦距，确保观察清晰。

芽孢染色是一种常用的微生物实验室技术，用于观察和鉴定细菌的孢子形态和结构。

以下是芽孢染色的常用方法：
1. 热锡烙法（Heat-fixed smear）：将含有芽孢的菌落用细火加热，使其附着在玻璃片上固定。

2. 革兰氏染色法（Gram staining）：首先用洗涤液将玻璃片上的菌落冲洗，接着用紫晶染液染色，再用碘液做固定，用乙醇洗去多余的染色剂，最后用洗涤液冲洗，接着用红素染液染色，最后用洗涤液冲洗干净。

3. 铁血素染色法（Iron-hematoxylin staining）：将菌落固定在玻璃片上，然后用铁血素溶液浸泡一段时间，最后用去离子水冲洗干净。

4. 格拉姆染色法（Spore staining）：将菌落固定在玻璃片上，然后用绿基（Malachite Green）染液浸泡，将玻璃片放入蒸汽中加热，再用水洗去多余染液，最后用红素染液进行反染。

以上是几种常用的芽孢染色方法，具体使用哪种方法取决于实验目的和需求。

革兰氏染色法革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家Christain Gram创立。

细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。

为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红、稀释复红等进行复染。

阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。

有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。

革兰氏阳性菌对青霉素敏感，革兰氏阴性菌对链霉素敏感。

可根据革兰氏染色法鉴别不同菌种并对症下药。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。

现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。

另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH 条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。

所以染色时的条件要严格控制。

例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。

此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。

所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。

G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。

呈紫色。

Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：１）涂片固定。

在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，固定。

细菌革兰氏染色法及芽孢染色法实验一、实验目的1. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤；2. 掌握细菌芽孢染色的方法。

二、实验内容1. 制作细菌染色装片。

2. 进行革兰氏染色法操作。

三、实验材料和用具大肠杆菌(E．coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌液，枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)的斜面菌种。

革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯和5％孔雀绿水溶液。

显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯和烧杯。

四、操作步骤(一) 革兰氏染色1．涂菌用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而匀、直径约1cm的菌膜。

涂菌后将接种环火焰灭菌。

2. 干燥于空气中自然干燥。

亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。

3．固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法．即将细菌涂片向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止茵体烧焦、变形。

此制片可用于染色。

4. 初染于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。

5. 媒染滴加卢戈氏碘液，1min后水洗。

6. 脱色滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min水洗。

7. 复染滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。

8．用滤纸吸干,油镜镜检。

(二)芽孢染色法1．方法1(1) 取37℃培养18-24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定(参见“细胞单染色法”) 。

(2) 于载片上滴人3—5滴5％孔雀绿水溶液。

(3) 用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时开始计算时间约4-5min。

加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。

(4) 倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。

(5) 用0.5％沙黄水溶液(或o．05％碱性复红)复染1min，水洗。

细菌的革兰氏染色实验报告实验名称：细菌的革兰氏染色实验
实验目的：通过细胞壁结构的不同，观察细菌的革兰氏反应，了解细菌的形态特征及分类情况。

实验原理：细菌细胞壁的结构不同，根据革兰氏染色方法可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，其中革兰氏阳性菌在染色后呈紫色，革兰氏阴性菌在染色后呈红色，通过观察染色后的细菌颜色能够大致了解细菌的分类情况。

实验材料：
1. 革兰氏染色试剂（含靛派液、碘酒、脱色剂、碱性洗涤液）
2. 外部消毒液、无菌采样棒、无菌平板
3. 革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）
4. 革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）
实验步骤：
1. 将需要实验的细菌分别接种于无菌平板上。

2. 用外部消毒液将无菌采样棒消毒并晾干。

3 .取一个无菌采样棒分别在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的菌落上轻轻刮取，避免沾到无关菌种。

4. 将采样棒沾有菌落的一端放入一滴靛派液中浸润，再在菌液上加2-3滴碘酒，静置1分钟，使靛派液和碘酒渗透到其内部。

5. 倒掉靛派液和碘酒，用脱色剂加水洗涤液一一洗去染色剂，每次洗涤2-3秒，规定洗4次，每次可以轻轻甩去液体。

6. 最后观察染色后的细菌颜色，革兰氏阳性菌为紫色，革兰氏阴性菌为红色。

实验结果：本次实验观察到革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）染后呈紫色，革兰氏阴性菌（大肠杆菌）染后呈红色。

实验结论：通过细菌的革兰氏染色实验，发现革兰氏阳性菌在染色后呈紫色，革兰氏阴性菌在染色后呈红色，这种染色方法为快速鉴别大肠杆菌等革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌提供了简单、快捷的方法。

实验四细菌的芽孢染色生物112 周泓兆1102040226一、目的学习并掌握细菌芽孢染色的原理及方法。

二、原理芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染色剂亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈现不同的颜色而加以区别。

芽孢具有厚而致密的壁，因此想要将芽孢染色需要在较高的温度（煮沸）的条件下，用强染色剂（孔雀绿）将菌体和芽孢同时染色。

而同时，实验利用了孔雀绿可经水洗脱色的特点，通过水洗将菌体的着色洗脱，而芽孢因具有致密的壁而不会被水将染色洗脱。

接下来用番红染色，将菌体染为红色，而在常温下品红无法将芽孢着色，因此在显微镜下形成了芽孢为绿色而菌体为红色的现象。

而实验中如果要观察芽孢在菌体中的着生位置，一定要根据各菌的特点来确定培养时间。

三、材料1.菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），26℃-28℃，培养2-3天。

2.染色剂：孔雀绿染液，番红染液。

3.其它：载玻片，无菌水，洗瓶，酒精棉球，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，接种环，酒精灯，镊子。

四、实验步骤1.制片：将枯草芽孢杆菌涂片并干燥固定。

2.染色：撕取一块比载玻片略窄的吸水纸，覆盖在涂片出，在吸水纸上滴加孔雀绿直至饱和。

用酒精灯加热是染液保持微沸，其间不断添加适量孔雀绿染液，保持吸水纸湿润，染色5min。

3.水洗：待玻片冷却后，用镊子出去吸水纸，再用水瓶轻轻冲洗至孔雀绿不再褪色为止。

4.复染：用番红染液染色1-2分钟，水洗。

5.镜检：涂片干燥后，滴加香柏油置于油镜下观察。

6.清理：用二甲苯与干净擦镜纸擦净镜头，将涂片放入废片缸，将固体垃圾放入垃圾桶，液体垃圾倒入废液缸，无腐蚀性毒性液体可倒入下水道，用酒精棉球擦洗器材将溅出的染料擦除。

五、结果与讨论：这个实验成功率很高，主要原因是步骤简单，染色效果明显而且影响因素少，洗脱时间对结果影响要比革兰氏染色中酒精脱色时间的影响小很多。

最后结果的小遗憾是孔雀绿绿色的着色较浅，我觉得可以通过适当增加涂片的菌体密度和增加染液煮沸时间，可能会获得更好地效果。