实验三革兰氏染色实验

实验三细菌涂片的制备及革兰氏染色[实验目的]1、掌握细菌涂片的制备方法及革兰氏染色。

2、学习无菌操作，树立无菌观念。

[实验原理]细菌细胞微小，无色而半透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助染色使菌体着色（由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用以及离子交换、酸碱亲和等化学作用，染料能使细菌着色，并且因细菌细胞的结构和化学成分不同而有不同的染色反应）后，使其与背景形成明显的色差，从而能较清楚的观察到细菌的基本形态和结构。

根据不同的染色反应，可作为鉴别细菌的一种依据。

微生物染料是一种带苯环的有机化合物，其分子上具有发色基团和助色基团。

前者给化合物以特有的颜色，但不能与细菌结合；后者使化合物具成盐的性质，能和菌体结合。

分为碱性染料、酸性染料和中性染料三类。

根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为三种方法即简单染色、鉴别染色和特殊染色。

革兰氏染色：1884年由丹麦病理学家C.Gram创立。

此法可将所有细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。

是细菌学上最常用的鉴别染色法，有着重要的理论和实践意义。

其染色过程是先用草酸铵结晶紫进行初染，再加媒染剂-革兰氏碘液，以增加染料和细胞的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子量较大的复合物，然后用脱色剂-乙醇脱色，最后用沙黄液复染。

凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）者即为G+菌，反之，脱色后染上复染剂颜色（红色）者即为G-菌。

其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同，通过染色加以鉴别。

革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，且类脂质含量少，经乙醇处理发生脱水作用后反而使其孔径缩小，通透性降低，结晶紫-碘形成的复合物保留在细胞内而不被脱色，结果细胞呈现紫色。

而革兰氏阴性菌的的肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂质含量较高，经乙醇处理后，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，结果细菌被脱色，再经沙黄复染后呈现红色。

实验三细菌革兰氏染色及特殊结构观察一、实验目的：1、了解革兰氏染色法的原理，并熟练掌握其操作步。

2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。

3、通过革兰氏染色进一步理解细菌细胞壁的结构特点。

4、巩固在油镜下观察微生物的个体形态。

5、学习并掌握芽孢染色法。

6、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。

二、主要仪器设备及材料：1、菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌斜面2、试剂：草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液，香柏油，二甲苯，生理盐水，5%孔雀绿3、仪器与材料：生物显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯，火柴，小试管（75mm×10mm），烧杯（300mL），滴管，接种环，擦镜纸，镊子，电炉三、原理：微生物的细胞小且透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。

因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。

它是1884年由丹麦医师Gram创立的。

革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。

细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

华中科技大学微生物学实验报告班级：生物制药1101班日期：2013 年 3 月16 日指导教师：邬建国实验组别：启明七组姓名：何明组员姓名：张玉涛、王远馨实验名称：革兰氏染色一、实验目的1.学习并掌握革兰氏染色的方法。

2.简单进行样品的革兰氏染色辨别样品中细菌类别二、实验原理1.革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌紫色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G-）。

2为观察方便，脱色后再用一种红色染料，如碱性番红等进行复染。

阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。

有芽孢的杆菌和绝大多数球菌，以及所有的放线菌和真菌都成革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都成负反应。

3.革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样，染色与细菌细胞壁的化学组成及结构有关。

4.阳性菌菌体等电点较阴性菌低，在相同pH条件下染色，阳性菌吸附碱性染料较多，因此不易脱去，阴性菌则相反。

三、实验材料菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌；检测样品：含活菌酸奶染料：草酸铵结晶紫液、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲苯四、实验方法(一)涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫染色（1min ）→水洗→路哥氏碘液媒染（1min ）→水洗→95%乙醇脱色（30s ）→水洗→番红复染（5min ）→水洗→干燥→镜检。

关键点：1.严格掌握乙醇脱色程度，如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌； 而脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌；2.菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间很长，或已死亡及部分自行溶解了，都常呈阴性反应。

（二)黑曲霉菌属于真菌,细胞较大,可用水片进行观察,,先在载玻片上滴一滴水,接种,盖上载玻片,即可拿到显微镜下观察.五、实验结果与分析1.对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别进行革兰氏染色（拍照，注明放大倍数）大肠杆菌放大倍数40x 金黄色葡萄球菌，放大倍数100x ，油浴2.对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片进行革兰氏染色（拍照，注明放大倍数）大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片，放大倍数100x,油浴3.酸奶中乳酸菌的革兰氏染色（拍照，注明放大倍数）4.黑曲霉菌水片观察六、思考题1.你的实验结果与课本中所述是否一致？如果不一致，试分析原因。

《微生物学》实验报告开课时间室：A区文科楼510 2012年11月29日学院生物工程学院年级、专业、班10级生工01班姓名吕亚慧成绩课程名称微生物学实验实验名称细菌简单染色法革兰氏染色法指导教师李苹教师评语教师签字：年月日实验目的：1．巩固油镜的使用方法；2．学习微生物涂片、染色基本技术，掌握细菌的简单染色法；3．学习、掌握细菌的革兰氏染色法；4．建立“无菌操作”的概念，学习其技术。

实验原理简单染色法：是利用单一染料对细菌进行染色的方法，常用碱性染料。

只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。

复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。

常用的有：、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。

革兰氏染色法：G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质，故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了类脂质，增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。

G ＋细胞壁结构致密，用脱色剂处理后，肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。

光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。

显微镜是利用凸透镜的放大成像原理，将人眼不能分辨的微小物体放大到人眼能分辨的尺寸，其主要是增大近处微小物体对眼睛的张角（视角大的物体在视网膜上成像大），用角放大率M表示它们的放大本领。

因同一件物体对眼睛的张角与物体离眼睛的距离有关，所以一般规定像离眼睛距离为25厘米（明视距离）处的放大率为仪器的放大率。

显微镜观察物体时通常视角甚小，因此视角之比可用其正切之比代替。

显微镜由两个会聚透镜组成，光路图如图所示。

物体AB经物镜成放大倒立的实像A1B1，A1B1位于目镜的物方焦距的内侧，经目镜后成放大的虚像A2B2于明视距离处。

实验器材变形杆菌、表皮葡萄球菌载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。

实验三细菌革兰氏染色法【目的要求】了解革兰氏染色原理；掌握革兰氏染色的方法。

【基本原理】革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884 年由丹麦医师Gram 创立。

未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。

染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。

革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两种类型，细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

革兰氏染色的主要步骤包括初染、媒染、脱色和复染。

首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。

然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。

之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。

革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。

而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色。

而在最后用复染步骤（染色剂为番红），染色后变为复染剂颜色（红）。

【实验器材】1.革兰氏染色液：①草酸铵结晶紫甲液：结晶紫（2 g）、乙醇（95%）（20 mL）;乙液：草酸铵（0.8 g）、蒸馏水（0.8 mL）;将甲、乙两液混合，静置48h 后使用，该染液稳定，在不透气的棕色瓶中可存储数月。

②卢戈氏碘液碘（1 g）；碘化钾（2 g）；蒸馏水（300 mL）先将KI溶于少量（3-5 mL）蒸馏水中，再放入碘，待碘全溶后，加水至300 mL。

此液稳定，可在不透气的棕色瓶中保存数月。

③脱色液：95%乙醇④复染液：即2.5%蕃红（沙黄）水溶液。

实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的与要求1、掌握细菌涂片标本的制备2、掌握革兰氏染色法的步骤和关键点3、识别细菌革兰氏染色结果二、实验原理：细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。

为什么要对细菌染色？细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。

简单染色法可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G )和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。

其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。

革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞壁内使细胞呈蓝紫色，而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，再经番红复染后细胞呈红色。

三、实验器材1、菌种 牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h 的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h 的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；2、仪器 显微镜；3、材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。

4、染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液； 细菌的简单染色步骤：细菌的革兰氏染色步骤：涂 片,干 燥,固 定,结晶紫染色,水洗,碘液媒染,水 洗,乙醇脱色,水 洗,番红复染,水 洗,干 燥,镜 检.五、实验关键步骤和注意点：1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。

2、挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。