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RNA干涉下调RACK1基因表达增强水稻抗旱能力(精)

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中国水稻科学(ChineseJRiceSci),2008,22(5):447~453

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RNA干涉下调RACK1基因表达增强水稻抗旱能力

李大红1,2 刘 卉1 杨艳丽1 甄萍萍1 梁建生1,*

(1扬州大学生物科学与技术学院,江苏扬州225009;

2

黄淮学院农林系,河南驻马店463000;

*

通讯联系人,E mail:jsliang@)

Down

RegulatedExpressionofRACK1GenebyRNAInterferenceEnhancesDroughtToleranceinRice

LIDa hong1,2,LIUHui1,YANGYan li1,ZHENPing ping1,LIANGJiang sheng1,*

(1CollegeofBioscienceandBiotechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China;HuanghuaiUniversity,Zhumadian463000,China;

*

2

AgronomyandForestryDepartment,

Correspondingauthor,E mail:jsliang@)

Abstract:RACK1isascaffoldproteinwithversatilefunctions,andplaysimportantrolesintheregulationofplantgrowth

anddevelopment.Transgenicriceplants,ofwhichtheexpressionofRACK1genewasinhibitedusingRNAinterference(RNAi)approach,wereusedtostudypossiblefunctionsofRACK1intheresponsesofricetodroughtstress.Real

timePCRanalysisshowedthattheexpressionofRACK1intransgenicriceplantswasinhibitedmorethan50%.Thetransgenicriceplantsshowedhighertolerancetodroughtstressascomparedwiththenon transgenicriceplants.Theperoxidationofmem

braneandproductionofmalondialchehydeweresignificantlylower,andthesuperoxidedismutaseactivitywassignificantlyhigherthanthoseofthenon

transgenicriceplants.ItsuggestedthatRACK1negativelyregulatedricetolerancetodroughtstress,whichwasrelatedtoredoxsystemofriceplants.

Keywords:Oryzasativa;RACK1gene;RNAinterference;transgenicplant;droughttolerance摘 要:RACK1是一种多功能支架蛋白,广泛参与植物生长发育过程的调节。利用RNA干涉技术抑制水稻RACK1基因的表达,分析了RACK1基因在响应干旱胁迫中的功能。实时定量PCR对获得的转基因植株的RACK1基因表达分析结果表明,

转基因水稻RACK1基因表达受抑制程度达50%左右。与非转基因水稻(对照)相比,转基因水稻耐干旱能力显著强于对照,其膜的过氧化酶和丙二醛的产生显著低于对照,而超氧化物歧化酶活性极显著高于对照。表明RACK1蛋白质调节水稻对干旱胁迫的耐性,并且这种调节在很大程度上与植株体内的氧化还原系统有关。

关键词:水稻;RACK1基因;RNA干涉;转基因植株;抗旱性中图分类号:Q943.2;Q945.78;S511.034文献标识码:A文章编号:1001 7216(2008)05 0447 07

RNA干涉(RNAi)技术是通过正义RNA与反义RNA形成双链RNA,双链RNA在内切酶的作用下,被切成多个长度为21~25bp的较短的双链RNA,这些双链小RNA能使内源特异靶基因的

mRNA降解,从而达到阻止基因表达的目的[1 2]。该技术具有特异性、稳定性、高效、快速以及不改变基因组的遗传组成等特性,为人们研究未知功能的基因提供了新的反向遗传学手段。在拟南芥和水稻等基因组测序完成后,RNAi技术为植物功能基因组学研究及植物的遗传改良等方面提供了一个强有力的手段。

RACK1最初被认为是哺乳动物中蛋白激酶C(PKC)的一种锚定蛋白,如今被视为一种具有多种功能的支架蛋白,对动物中枢神经系统的多种信号通路具有调节作用[4]。RACK1能与多种蛋白质相互作用,如活性 PKC和动力蛋白 1。植物RACK1蛋白与从烟草BY 2悬浮细胞中分离到的生长素响应基因arcA编码的蛋白高度同源,是含有[3]

蛋白是一种典型的支架蛋白,对许多生理生化过程具有重要的调节作用[5]。有证据显示RACK1可能参与信号转导过程,并可能调节了多种发育过程,如cAMP信号[6 7]、细胞周期控制[8]、Ca2+释放[9]等;另外它还能与80S核糖体相结合,调节酵母和动物的转录过程[10 12];最近也有资料显示它在拟南芥中与细胞质的核糖体相结合。这些都说明RACK1在真核细胞中具有极其重要的功能。

水稻是重要的粮食作物,目前对水稻的RACK1蛋白研究还少有报道。我们以拟南芥RACK1蛋白的氨基酸序列为模板对水稻基因组序列进行比对分析,找到两个与编码拟南芥RACK1基因高度同源的基因(NCBI登录号分别为NC008394和NC008398)。在蛋白质水平两者与拟

收稿日期:2008 03 10;修改稿收到日期:2008 05 21。基金项目:国家自然科学基金资助项目(30571120);中国高等学校博士点基金资助项目。

第一作者简介:李大红(1969-),男,博士研究生,E mail:[13 14]

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中国水稻科学(ChineseJRiceSci) 第22卷第5期(2008年9月)

南芥RACK1蛋白的同一性和相似性分别达到70%和80%。由于我们筛选的拟南芥植物Atrack1突变体具有高度耐渗透胁迫性(未发表资料),因而推测水稻RACK1蛋白(OsRACK1)可能在提高水稻耐渗透胁迫中担负重要调节功能。本研究从水稻cDNA中克隆RACK1的RNAi片段,并构建了植物表达载体,通过农杆菌EHA105

介导转入水稻基因组中,从而获得水稻RACK1基因表达被RNAi抑制的转基因植株,利用转基因水稻植株,比较分析了OsRACK1在水稻耐干旱胁迫中的作用。

机引物试剂盒等为宝生物工程(大连)有限公司产品,DNA快速纯化回收试剂盒为上海捷瑞公司产品,抗生素、植物生长调节剂等药品为Sigma公司产品,DIG试剂盒购自Roch公司,SYBRGREEN购自ABI公司。其他试剂均采用进口或国产分析纯。

1.4 引物

引物序列由PrimerPremier5.0引物设计软件设计(表1)。RNAi正向引物5 和3 端分别加接BamH!和Kpn!限制性内切酶位点(下划线处);反向引物的5 和3 端分别加接Spe!和Sac!限制性内切酶位点(下划线处)。1.5 方法

1.5.1 RNAi表达载体的构建

从水稻品种日本晴叶中(3叶1心期)提取RNA,逆转录为cDNA,经克隆构建了pGEM T/R载体,以该载体为模板,以P1、P2和P3、P4为引物(表1),PCR扩增RNAi的正向和反向目的片段。经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后,通过胶回收试剂盒回收并纯化,再克隆到pGEM T18载体中。将克隆到的RACK1基因片段经BamH!/Kpn!和Spe!/Sac!酶切后,再克隆到双元载体pCAMBIA1301(经改造的)内含子的两侧(图1),形成一个反向重复的发卡结构,构建成表达载体pCAMBIA1301/I。

1.5.2 水稻RACK1RNAi表达载体的转化及检测分析

采用冻融法将植物表达载体pCAMBIA1301/I导入根癌农杆菌EHA105感受态细胞,构建适于植物遗传转化的工程菌EHA105(pCAMBIA1301/I)。

1 材料与方法

1.1 菌种及质粒

大肠杆菌DH5 为转化受体菌。表达载体pCAMBIA1301(其中包含有能在植物中表达的与35S启动子和Nos终止子相连的GUS报告基因,可作为目的基因转化水稻细胞筛选的标记)和根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105由本实验室保存。克隆载体pGEM T购自大连TaKaRa公司。

1.2 植物材料和遗传转化

供试水稻品种为粳稻日本晴(Oryzasativasubsp.japonicacv.Nipponbare)。成熟种子诱导初生愈伤组织,作为与农杆菌共培养转化的受体材料。愈伤诱导及筛选使用N6D2培养基,分化使用(1/2)MS培养基。水稻组织培养、农杆菌介导转化水稻以及抗性愈伤组织的筛选与植株再生等按刘巧泉等建立的高效转化方法进行。1.3

酶及试剂

逆转录试剂盒、限制性内切酶、PCR试剂盒、随

表1 实验所用引物

Table1.Primersusedinthisexperiment.

引物名称Primername

RNAi正向引物上游P1RNAiprimerforwardP1RNAi正向引物下游P2RNAiprimerreverseP2RNAi反向引物上游P3RNAiPrimerforwardP3RNAi反向引物下游P4RNAiprimerreverseP4HPT基因的引物上游P5HPTprimerforwardP5HPT基因的引物下游P6HPTPrimerreverseP6GUS基因的引物上游P7GUSprimerforwardP7GUS基因的引物下游P8GUSprimerreverseP8

RQ PCRRACK1引物上游P9RQ PCRRACK1primerforwardP9RQ PCRRACK1引物下游P10RQ PCRRACK1primerreverseP10RQ PCRACTIN2引物上游P11RQ

PCRACTIN2primerforwardP11RQ PCRACTIN2引物下游P12RQ

PCRACTIN2primerreverseP12

[15]

引物序列Primersequence

5 CCGGTACCGGCGAGTGCAAGTACACCA 3 5

CCGGATCCTGGTTCTTGGAGACAGGGAT 3 5

CCGAGCTCGGCGAGTGCAAGTACACCA 3 5

CCACTAGTTGGTTCTTGGAGACAGGGAT 3 5 GCTGTTATGCGGCCATTGTC 3

5 GACGTCTGTCGAGAAGTTTC 3 5 CACACCGATACCATCAGAGATC 3 5

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水稻抗旱基因克隆与功能分析

水稻抗旱基因克隆与功能分析

水稻抗旱基因克隆与功能分析

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是全球人口最多的食物来源之一。然而，气候变化和人类活动对水稻生长环境的影响使得旱灾成为水稻生产的一个主要问题。为了解决这个问题，诸多科学家和研究者们致力于水稻抗旱相关基因的克隆和功能分析。本文将就此主题进行深入探讨。

一、水稻抗旱基因的克隆

基因克隆是研究生物学领域中最为基础的工作之一。对于水稻抗旱相关基因，研究者们主要采用了几种方法进行克隆：

1. 定向克隆方法

定向克隆方法利用已知的水稻基因序列，设计引物并通过PCR扩增得到目的基因。这种方法通常需要先进行序列分析，以确定检测到的基因是否确实与抗旱有关。

2. 突变法

突变法是一种重要的工具，在基因识别中也有着广泛的应用。通过一种方法制造突变体，通常是突变基因的一部分进行替换，然后筛选出表现与正常个体不同的后代，以此来确定与抗旱相关的部分。这种方法已经被证明是相当有效的，已经被成功的应用于水稻抗旱基因的克隆中。 3. 比较基因组学

比较基因组学是另一种克隆方法。这种方法通过比较已知基因组里的两个或多个不同物种的基因组序列，以发现相同或相关的DNA序列。这些DNA序列被认为可能控制抗旱程度，因此是在水稻远缘物种中寻找抗旱基因的最重要的方法之一。

二、水稻抗旱基因的功能分析

水稻抗旱基因的克隆帮助了我们确定了哪些区域与抗旱有关。接下来的任务是进行功能分析，以进一步了解基因如何工作，从而指导作物育种。

1. 基因转录与表达分析

在确定与抗旱相关的基因后，下一步是通过转录分析研究其表达模式。实验方法可以采用RT-qPCR和Northern blots等。

2. 基因诱导逆境试验

基因诱导逆境试验是一种通过农艺手段给水稻植株施加不同的逆境处理来模拟自然环境的方法。通过人为加压或人造干旱的处理，可以更好的研究与抗旱相关的基因的作用。

3. 基因敲除技术 基因敲除技术是通过人为干扰特定基因的表达，来分析某一基因在水稻生长时是否影响其抗旱性的技术。该技术通常通过RNAi或TALEN技术实现。

水稻抗旱性状遗传分析

水稻抗旱性状遗传分析

水稻抗旱性状遗传分析

一、背景介绍

水稻是全球人类最主要的粮食作物之一，而旱季的来临常常导致水稻产量大幅降低，影响全球的粮食安全。为了种植更耐旱的水稻品种，研究人员致力于探究水稻抗旱性状的遗传机制。本文将介绍水稻抗旱性状的遗传分析。

二、水稻抗旱性状

1. 主根长度

水稻的主根是决定水稻抗旱性状的重要因素之一。在干旱的环境中，主根长度的增加会增强水稻的抗旱能力。因此，研究人员通过遗传分析，发现多个主根生长相关基因参与了水稻的抗旱性状形成。

2. 蒸腾作用

水稻能通过蒸腾作用消耗大量的水分，从而维持植株正常的代谢活动。在干旱的环境中，水分不足会显著降低水稻的抗旱能力。因此，研究人员发现影响蒸腾作用的基因与水稻抗旱性状密切相关。

3. 叶绿素含量 叶绿素是水稻光合作用的关键因素之一，它能吸收植物的光能并将其转化为植物的能量。在干旱环境中，水稻植物的叶绿素含量明显降低，从而导致水稻的抗旱能力减弱。因此，研究人员发现参与叶绿素代谢的基因与水稻抗旱性状相关。

三、水稻抗旱性状遗传机制

1. 基因定位

研究人员通过基因定位技术，将与水稻抗旱性状相关的基因定位到染色体上。这样，就能够更好地理解基因在水稻抗旱性状形成中的作用。

2. 基因型和表型相关性分析

研究人员通过基因型和表型相关性分析，确定哪些基因对水稻抗旱性状的影响更大。这些分析能够帮助人们更好地了解水稻抗旱性状的遗传机制，并为研究开发更耐旱的水稻品种提供理论依据。

3. 表达差异分析

为了更好地理解基因在水稻抗旱性状形成中的作用，研究人员进行了基因表达差异的分析。这些分析确定了哪些基因在干旱环境中表达水平下降，从而影响了水稻植株的抗旱能力。

四、结论 通过以上的研究，我们可以发现水稻抗旱性状遗传机制是十分复杂的。多个基因参与了水稻抗旱性状的发育和形成。研究表明，遗传调控不仅能够提高水稻的抗旱能力，而且能提高全球的粮食生产。

在探究水稻抗旱性状的遗传分析过程中，科学家们提出了许多优化方案，如基因组测序技术和基因编辑技术。未来，借助于新的科技手段，逐渐揭示水稻抗旱性状的遗传机制对于培育更具潜力的水稻品种的开发将很有帮助。

RNA干扰水稻SBE3基因的表达对籽粒淀粉合成及其关键酶活性的影响

RNA干扰水稻SBE3基因的表达对籽粒淀粉合成及其关键酶活性的影响

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(2): 313-320 /zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2008AA10Z408, 2006 AA10Z1B4)资助。 * 通讯作者(Corresponding author): 程备久, E-mail: cbj@ 第一作者联系方式: E-mail:wjmmjw2000@ Received(收稿日期): 2009-06-11; Accepted(接受日期）: 2009-08-31.

DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00313

RNA干扰水稻SBE3基因的表达对籽粒淀粉合成及其关键酶活性的

影响

汪结明 张 建 江海洋 朱苏文 范 军 程备久*

安徽农业大学作物生物学安徽省重点实验室, 安徽合肥230036

摘 要: 为探讨RNA干扰水稻SBE3基因的表达对籽粒淀粉合成及其关键酶活性的影响, 以水稻品种中花11及以其

为受体的转基因株系为材料, 分别检测水稻SBE3基因的表达、籽粒发育各时期淀粉合成关键酶活性变化及直链、支

链淀粉相对含量。结果表明, 导入的SBE3基因RNA干扰结构成功地降低了目的基因的表达, 并使其酶活性在籽粒

发育各时期均显著降低并提前3 d达高峰期, 且不同株系间具有差异。同时也使不同发育时期籽粒的ADPG-PPase

和SSS及DBE活性均不同程度地显著降低, 尤其以SSS和ADPG-PPase活性峰值降幅最大。此外, 两个转基因水稻

株系各时期籽粒直链淀粉含量均显著高于对照, 而其成熟籽粒千粒重却显著降低, 直链淀粉含量越高, 千粒重越低。

关键词: 水稻; RNA干扰; 淀粉分支酶3; 淀粉合成; 酶活

水稻干旱胁迫分子调控机制研究

水稻干旱胁迫分子调控机制研究

水稻干旱胁迫分子调控机制研究

水稻作为人类最主要的粮食作物之一，其产量的稳定性对人类粮食安全至关重要。然而，不可避免的天气极端事件，如干旱等，都会对水稻的生长发育造成严重影响。因此，如何研究探索水稻在干旱胁迫下的分子调控机制，成为当今重要的研究方向之一。

水稻干旱胁迫的响应机制

干旱胁迫将导致水稻植株中的一系列生理和生化变化。这些变化必须及时地被植株感知并响应，以适应干旱环境。这种干旱响应通常可以划分为调节细胞水分、调节生长素代谢、策略性减少蒸腾等行动。通过与外部环境的相互作用，这些行动可以帮助水稻尽可能地适应干旱胁迫。

干旱胁迫下水稻基因表达的变化

为了适应干旱环境，水稻的基因表达将迅速发生变化。研究表明，不同基因在干旱胁迫下的表达呈现不同的模式。其中一些基因会出现明显的上调或下调，这些调整将有助于水稻的生长和适应干旱环境。而对这些基因的研究可以帮助我们深入了解水稻响应干旱的分子机制。

水稻干旱胁迫下的非编码RNA的作用

除了编码蛋白质的基因之外，非编码RNA也在水稻响应干旱胁迫的过程中发挥着重要的作用。这类非编码RNA可以通过不同机制发挥调节作用，从而进一步影响其他基因的表达。在水稻中， microRNA、lncRNA 等无论是在表达还是功能上都已得到了广泛的研究。

分子机制的探索

随着先进技术和研究手段的不断发展，我们对水稻干旱胁迫下的分子调控机制开始有了更深刻的了解。近年来，研究人员发现，一些关键的信号途径，包括水分感知和信号传递、激素调控、蛋白质翻译、甚至自噬等，都参与了水稻干旱胁迫下的调节。

其中，ABA（脱落酸）在水稻干旱胁迫下发挥着非常重要的作用。ABA水平的增加能够促使水稻以某种方式适应干旱条件，这一点通过ABA受体抑制或ABA合成抑制都被证实过。ABA还能影响与糖代谢相关的基因表达，其中一些基因的表达与植物对干旱的适应性相关。

此外，还有一些蛋白质在水稻干旱胁迫下发挥着重要的调控作用。例如，Hsp70被证实可以降低水稻干旱胁迫下的细胞质钙离子水平，达到减缓细胞膜损伤的目的。与之相反的，AMPK这个激酶因其能够促进葡萄糖生成和葡萄糖耗散等反应，使其在植物适应干旱过程中也有着至关重要的作用。