RNA干涉RNAi及其应用

・综述・RNA干涉(RNAi)及其应用蔡佩玲,牟林春,李新枝(成都医学院基础医学院人体解剖学与组织胚胎学教研室　四川成都　610083)【中图分类号】　Q752 【文献标识码】　A 基因沉默(gene silencing)是指生物体内的特定基因由于种种原因不表达的遗传现象,它有两方面的功能:一方面,它是生物遗传操作创造新的遗传修饰生物(genetically modified organisms)的障碍;另一方面,它是植物抵御外来核酸入侵(如病毒)的一种反应,为植物抗病毒的遗传育种提供了具有实用价值的策略[1]。

近年来,不同的研究领域和生物中发现了许多新的使基因关闭或者沉默的类型,并赋予其不同的名称:植物中称为RNA共抑制(co2supp ression)[2],真菌中叫RNA压制(RNA quelling)[3],动物中则为RNA干涉(RNA interference,RNAi)[4]。

RNAi现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。

将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double2 st rand RNA,dsRNA)导入细胞后,能特异性地降解该mRNA,使相应基因沉默,从而产生相应的功能表型缺失[5]。

RNAi现象广泛存在于生物界,从低等原核生物到植物、真菌、锥虫、涡虫、囊虫、水螅、果蝇、线虫、斑马鱼和老鼠早期胚胎等不同种属的生物体中都发现了此现象[6],只是机制也更为复杂,下面就RNAi的发现、作用原理及其应用等进行综述。

1　RNAi现象的发现及其生物学意义111　RNAi现象的发现20世纪20年代,人们发现植物在受到野生型病毒感染以后,能产生对另一种亲缘关系相近的病毒的抵抗力[7]。

十多年前,科学家在努力进行生物遗传改良时,发现靶生物体内产生了一种非期望的表型。

早期由美国Jorgensen和荷兰Mol带领的两个研究团体试图通过增加色素合成基因的拷贝数来创造一种紫色更深的矮牵牛,但结果出人意料,一些转基因植株部分或完全开出白花,这表明色素合成途径被关闭而不是被加强。

事实上,不仅仅该转入的基因不表达,而且植株中所有的色素合成基因都失活。

他们将这一现象称之为共抑制[8]。

几年后,英国植物研究人员Ruiz等在进行抗病毒的植物遗传工程研究时也发现了类似现象。

他们将X病毒繁殖所必需的编码复制酶的基因转入到西红柿中,结果发现一些植株表现为抗病毒,另一些则表现为不抗病毒。

进一步研究表明,抗病毒的植株产生非常少的复制酶,而染病的植株则大量表达X病毒复制酶,抗病植株不仅能使转入的基因沉默而且还能使X病毒的复制酶基因沉默。

意大利的Cogoni 将类胡萝卜素合成所需的基因转入到粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中,结果30%的转化细胞自身基因失活。

他们称这种现象为压制[1]。

Guo等[9]在研究建立线虫胚胎极性的par I基因作用时,将par I基因的正义和反义RNA链分别注射到野生型线虫卵巢中,均发现50%子代胚胎致死。

一般认为反义RNA可与体内自身的mRNA结合,抑制基因的表达,为什么正义RNA也会产生与反义RNA类似的遗传效应呢?1998年,Fire等[4]将unc22、fem1、hlh1、myo3、gfp等基因的正义RNA、反义RNA、dsRNA分别注射到线虫中。

他们惊奇地发现:dsRNA所引起的基因沉默效应要比单个正义RNA或者反义RNA都要强的多。

且注射入到线虫的性腺以后,在其第一子代中也诱导出同样基因的抑制现象,说明RNAi在原核生物中具有可遗传性[4,5]。

他们将这种基因沉默现象称为RNA干涉。

Kennredell等进一步研究发现,用dsRNA注射果蝇胚胎是一种抑制特定基因表达的有效方式[1]。

为了解RNAi的特异性,Timmons等[10]将与unc22无关的dsRNA和unc22ssRNA一起注射到线虫体内,但并未发现非同源的dsRNA能够增强ssRNA 对unc22的干涉效应。

同时他们还发现:与不同的内含子和启动子序列相对应的dsRNA片段并不产生明显的干涉效应;大多数基因的dsRNA注入可以明显减少或消除内源的mRNA转录本;dsRNA介导的干涉表现为惊人的细胞穿透力,可以传递给其他组织及后代。

Tabara等[11]也发现基因沉默不仅仅局限在开始的细胞,还在动物体的各个部分激发RNAi,同时可传递给后代[1,6]。

过去认为哺乳动物细胞中不存在RNAi现象,因为较长的dsRNA在哺乳动物细胞中能诱导干扰素(IFN)生成,并激活STA T途径参与的P KR(dsRNA 依赖性激酶)的转录,同时dsRNA本身与P KR结合也能令其激活,继而磷酸化翻译起始因子el F2a使之失活,导致非特异性的蛋白合成障碍;另一方面, dsRNA能诱导细胞产生多种抗病毒蛋白的2′,5′腺苷合成酶生成2′,5′腺苷酸,激活非特异性的RNA 酶,发生非特异性的RNA降解效应。

而现在发现,只要dsRNA短于30bp,就不会促发干扰素效应,同时又能特异性地降解mRNA,引起基因沉默,这说明dsRNA在哺乳动物细胞中也能发挥一定作用。

这就为以后RNAi的应用如基因治疗等提供了新的研究方向[5]。

112　RNAi的生物学意义11211　防御病毒感染当植物病毒侵入植物细胞时,植物细胞所产生的dsRNA将引起RNAi来封闭病毒繁殖和传播所需要的基因[6]。

dsRNA还出现在许多病毒(包括单链RNA病毒)感染的细胞内,诱发RNAi,封闭病毒生存和繁殖所必需的基因,产生抗病毒效应。

研究发现某些病毒在漫长的进化过程中已获得了抑制封闭的基因。

在哺乳动物细胞中发现病毒感染后识别dsR2 NA的蛋白质如P KR、2′,5′2寡核苷酸聚合酶大量合成,从而激发干扰素诱导的抗病毒状态[12]。

11212　维持基因组中转座子的稳定当一个转座子以反义方向整合在启动子附近时,能够转录产生dsRNA,引起针对这个转座子的RNAi[6],遗传研究证实RNAi缺陷可引起内源性转座子的移动。

转座子的重要特征之一是具有反向重复序列,生物体通过此序列可以产生ds RNA发卡启动P T GS效应,从而抑制转座蛋白酶的产生和转座子的移动,有利于遗传稳定,防止遗传损害。

因此认为RNAi的一个功能就是转座子封闭(t ranspo son si2 lencing)[12]。

11213　参与胚胎发育中相关基因及生物体正常基因的表达调控在果蝇中,Argonaute家族成员的突变能影响正常的生长发育,特别是Argonaute1的突变能显著影响神经系统的发育,piwi的突变能降低胚胎干细胞的增殖能力和稳定性[6]。

2　RNAi的作用机制虽然遗传学和生物化学方法已用于探索RNAi 的机制,但真正的机理目前尚未明了,下面是RNAi 的一些可能机制。

211小干涉RNA介导同源RNA降解自RNAi发现以来,dsRNA如何高效特异地沉默细胞内与其同源的基因成为人们关注的热点。

1999年Tuschl等将dsRNA加入已证实存在RNAi 的果蝇胚胎提取物中,结果发现dsRNA被剪切成21～23nt的小RNA,同时靶mRNA被降解。

Hamo nd 等也证明果蝇提取物中的小RNA介导靶mRNA降解。

因此提出了RNAi的模式:即dsRNA被处理加工产生出21～23nt的RNA,后者通过序列互补介导mRNA的剪切降解[13]。

近年来研究发现,干扰性小RNA(small inter2 fering RNA,或者short interfering RNA,siRNA)是RNAi赖以发生的重要中间效应分子。

siRNA是一类长约21～25nt的特殊dsRNA,其序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性;两条单链末端为5′2端磷酸和3′2端羟基,且3′2端突出2～3个未配对的碱基[14]。

RNAi的主要过程是:dsRNA被内切核酸酶(一种具有RNase III样活性的核酸酶)切割成21～25nt 的双链siRNA,由siRNA反义链指导形成一种称为RNA沉默诱导复合体(RNA induced silencing com2 plex,RISC)的核蛋白体(包括内切核酸酶、外切核酸酶和解旋酶等多种蛋白成分),由RISC介导切割同源性靶mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域,从而干扰基因表达。

细胞中dsRNA的形成是RNAi 的第一步。

可通过多种途径形成,如:基因组中DNA 反向重复序列的转录产物;同时转录反义和正义RNA;病毒RNA复制中间体;及以细胞中单链RNA 为模板由细胞或病毒的RNA依赖的RNA聚合酶(Rd Rp)催化合成等[14]。

212RNA介导同源DNA甲基化(RdDM)RNA介导同源DNA序列中胞嘧啶甲基化作用,需要在P T GS/RNAi中引导同源RNA降解的siRNA的产生,只有与引导RNA序列互补的DNA 序列才能被修饰,表明RNA与DNA直接发生相互作用。

短至30bp的DNA序列能够作为甲基化的目标,胞嘧啶是甲基化位点,且在胞浆中产生的诱导P T GS的RNA能从细胞质进入细胞核,产生对细胞核的反馈作用,激发同源DNA的甲基化,这种RNA 指导的DNA甲基化扩大了原来有限的甲基化,从而进一步加强了基因沉默。

研究证实RdDM可能在启动或维持基因沉默中起作用,DNA甲基化缺陷将引起P T GS缓解。

RNA触发RdDM可能与DNA甲基转移酶(M T ase)相关,小RNA可能接近部分解链的DNA以形成RNA2DNA异二联体和单链DNA环,或RNA2 DNA三分子螺旋。

这些异常结构可能吸引M T ase靠近,经过充分循环,催化同源DNA甲基化[15]。

213　RNA依赖性RNA聚合酶(Rd RP)模型DNA甲基化能引起转基因转录的提前终止,从而产生异常RNA;转基因在细胞核中表达也导致了高水平的异常RNA转录。

当异常RNA的量超过一定阈值时,就会被存在于细胞质中的某一体系所感知并激活细胞质中的Rd Rp,于是Rd Rp以异常RNA 为模板转录出小片段互补DNA(cDNA),这些cD2 NA与核糖核酸酶形成一个序列特异的复合物RISC,cDNA处于复合物的中心。

该复合物能与mRNA杂交,捕获并降解与转基因序列相同或互补的RNA,从而成为专一性作用于双链RNA的RNA 降解酶底物,引起低水平转基因RNA的积累。

体外实验证明该酶能以RNA为模板合成cD2 NA,他们在体内杂合到相应mRNA上,并被特异作用于双链RNA的RNA降解酶降解。

Rd Rp cDNA 模型可以很好地解释P T GS很强的序列特异性。

非正常RNA能作为Rd Rp的底物,从而激活了RNA 降解机制,导致外源基因转录后水平上的沉默,脱腺苷化的mRNA作为异常RNA或RNA指导下的RNA聚合酶模板,在细胞质中作为潜在的基于同源降解机制的激活剂,只要有足够的宿主编码RNA指导下RNA聚合酶的底物,反义RNA就能被合成。