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RNA干扰

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简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。

当细
胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致
基因表达沉默。

与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi具有
传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi) RNAi与转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)在分子层次上被证实是同一种现象。

RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式，是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。

RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。

RNAi具有生物催化反应特征，反应中需要多种蛋白因子以及ATP参与。

RNAi在基因功能研究和基因药物应用具有广泛的前景。

机理
siRNA
RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。

对植物的研究证明，双链RNA复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补
与mRNA结合，从而导致mRNA降解。

对果蝇的研究证明，长度为21～23nt的
小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因。

这种小RNA分子被称之为小干
扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。

在RNA干扰中一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。

它可与
双链RNA结合，并将其剪切成21～23nt及3'端突出的小分子RNA片断，即siRNA。

随后siRNA与若干个蛋白组成的，RNA引起的称之为RNA诱导沉默复
合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应。

RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引
导（guide strand），序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，
引发靶mRNA的特异性分解。

迄今为止已鉴定出包括Dicer在内的若干个与RNAi有关的蛋白因子。

在果蝇（Drosophila melanogaster）RISC中，已知存在着称为Argonaute2(AGO2)的因子，AGO2蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失，也就是说AGO2是果蝇RNAi机制的必须因子。

研究表明Argonaute家族蛋白具
有RNA切割酶活性（slicer activity），RNAi机制正是由Argonaute家族
蛋白的RNA切割酶活性主导。

另外，几个RNA解旋酶(RNA helicase)也被鉴
定为参与RNAi机制的因子。

在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的RNAi中必须
的因子有EGO1。

这是一种RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase)，植物中也
存在该蛋白同系物。

RNAi中RdRP是将标靶mRNA作为模板，以导入的dsRNA(或siRNA)作为引物合成RNA，在细胞内针对于标靶mRNA合成新siRNA的酶。

这
一反应在一些生物的RNAi中为必须，但RdRP活性在人和果蝇的RNAi中是非
必须的，这说明在不同物种之间RNAi机制的基本框架虽然相同，但存在着微妙差异。

microRNA
在真核生物当中，还存在另外一种小分子RNA（microRNA）也能引
起RNA干扰现象。

microRNA大多20-22nt长，前体具有类似发夹性的茎环结
构。

microRNA产生于该茎环结构的双链区。

其特点与siRNA基本上相同。

研究地位
近几年来RNAi研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科
学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。

RNA干扰的应用
RNA干扰现象的发现及其在生物中存在的普遍性，以及RNAi作用机制和生物学功能的初步阐明，为RNAi的应用提供了理论基础。

RNAi目前已经在功能
基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛的领域里取得了
令人瞩目的进展，使其在医学领域包括动物医学领域在内的应用有着广阔的
前景。

研究基因功能的新工具
由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此可以作为功能基因组学的一种强
有力的研究工具。

已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生
类似基因敲除的效应。

与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，
周期短，操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。

病毒性疾病的治疗
加州大学洛杉矶分校和加州理工学院的研究人员开发出使用RNAi技术
来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。

这个研究小组设计合成的lenti病毒载体
引入siRNA，激发RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5进入人体外周Ｔ淋巴细胞，而不影响另一种HIV-1主要的coreceptor-CCR4，从而使以lenti 病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和
其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。

RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等，siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫，用siRNA 对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。

在最近全世界约30
个国家和地区散发或流行的严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)的防治研究中，RNAi也受到了重视。

siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的基因治疗，RNAi将成为一种有效的抗病毒治疗手段。

这对于许多严重的动物传染病的防治具有十分
重大的意义。

遗传性疾病的治疗
美国西北大学的Carthew R W和日本基因研究所的Ishizuka A等人发现RNAi同脆性Ｘ染色体综合征（与FMR-1基因异常有关的导致智力低下的染色体病）之间的关系密切，揭示了与RNAi相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。

遗传性疾病的RNAi治疗成为当今研究RNAi的又一大热点。

肿瘤病的治疗
肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这
一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。

Maen等应用RNAi技术成功地阻断了MCF7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp1的功能。

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RNA干扰(RNA interference, RNAi)

RNA干扰(RNA interference, RNAi)

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术，它利用了由小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。

RNAi是生物进化的结果，是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。

它普遍存在于各种生物，具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达ｍRNA的生物学功能。

RNA干扰现象不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定，基因治疗等方面开辟一条新思路。

1 RNAi的历史背景20世纪20年代，人们发现，植物受到野生型病毒感染后，能产生对另一种亲缘关系相近的病毒的抵抗力。

而真正发现双链RNA(dsRNA)能引起基因沉默现象，则在1995年。

当时，Guo和Kemphues用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中parl基因的表达时发现反义RNA具有抑制该基因表达的功能，同时正义RNA也同样出现了类似的抑制效应，实验表明正义RNA和反义RNA均能阻抑基因功能表达，而且两者的作用是相互独立的，机制也各不相同。

1998年，Fire和Mello等人首次发现dsRNA能够特异地抑制C.elegans中的纹状肌细胞unc-22基因的表达，结果发现dsRNA所引起的基因沉默效应要比单单应用反义RNA或正义RNA强十几倍。

而且注射入C.elegans的性腺后，在其第一子代中也诱导出了同样基因的抑制现象，说明在原核生物中，RNAi具有可遗传性。

他们将这一现象称为RNAi。

因为RNAi作用发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默(PTGS)或共抑制。

此后，又在果蝇、锥虫、涡虫、无脊椎动物、脊椎动物、植物、真菌、斑马鱼及哺乳动物等真核生物中发现了RNAi现象。

RNA干扰

RNA干扰

RNA干扰（RNAi）
定义
• RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、 由双链RNA（dsRNA）诱发的、同源 mRNA高效特异性降解的现象。
类型
• 转录水平的基因沉默(TGS)：由于DNA修饰 或染色体异染色质化等原因使基因不能正 常转录。 • 转录后水平的基因沉默(PTGS)：PTGS是 启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解 机制。
体内表达
• 前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs， 并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转 到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于 PCR的表达框架则属于从转染到细胞的 DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两 种方法的优点在于不需要直接操作RNA。
siRNA表达载体
• 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶Ⅲ启动子（pol Ⅲ）中的一种，操纵一段小 的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA）在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括 大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol Ⅲ启动子是由 于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6 个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单 链，退火，克隆到相应载体的pol Ⅲ 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周 甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
体外转录
• 用RNase Ⅲ 消化长片断双链RNA制备siRNA 其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的 siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个 缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链 dsRNA ，然后用RNase Ⅲ (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在 除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的 siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因 被有效地抑制。 dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人 员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse Ⅲ通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的 缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基 因。多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型 不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治 疗
rna干扰

rna干扰

RNA干扰什么是RNA干扰？RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种通过特定的RNA分子干扰基因表达的现象。

这种现象最早被发现于植物和线虫中，后来发现在动物中也普遍存在。

RNA干扰通过介导mRNA的降解或抑制转录来实现靶向基因的沉默。

RNA干扰的机制主要是通过一种特殊的小RNA分子，称为干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）或小干扰RNA （short interfering RNA，shRNA）。

这些siRNA或shRNA是由外源性或内源性的长双链RNA在细胞内被核酶Dicer切割而成的20-30个碱基的双链RNA分子。

RNA干扰的过程RNA干扰的过程可以分为三个主要步骤：siRNA的产生、siRNA的引物和RNA诱导沉默复合物（RISC）的形成、RISC 介导的mRNA降解或转录抑制。

首先，外源性或内源性的长双链RNA被核酶Dicer切割成20-30个碱基的siRNA。

siRNA由RNA诱导沉默复合物（RISC）捕获，其中的一个链被释放，留下一个导引链和一个剪切链在RISC中。

接下来，导引链将与靶标mRNA互补结合。

RISC将靶标mRNA切割成小片段，导致mRNA的降解或转录抑制。

这种RNA干扰过程可以非常特异地沉默特定的基因表达。

RNA干扰在基因研究中的应用RNA干扰已经成为基础科学研究和功能基因组学研究中广泛应用的工具。

通过沉默特定基因的表达，研究人员可以揭示该基因在生物学过程中的功能，以及该基因对疾病发展的影响。

在细胞水平上，RNA干扰可以用于验证候选基因是否在特定生物途径中起关键作用，或者用于筛选新药物靶点。

研究人员可以通过转染siRNA或shRNA来干扰目标基因，评估其对细胞功能的影响。

在动物模型中，RNA干扰可以用于研究特定基因的作用。

通过通过siRNA或shRNA直接注射进入动物体内，可以沉默目标基因的表达，并观察动物表型的变化。

RNA干扰

RNA干扰


基因治疗的局限性
1.运载体系一直是体内基因治疗的瓶颈，如何将双链 RNA高效特异的转入体内靶细胞仍是一个难题； 2.大于30个核苷酸的双链RNA进入哺乳动物的成体细 胞后，会非特异的阻断基因的表达
病毒类疾病的治疗
治疗HIV 感染 由于RNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制，HIV 病毒感染是我们亟待解决的问题，将RNAi技术应用于 艾滋病治疗是顺理成章之事。
关于核酸内切酶Dicer
在RNA干扰中一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家 族的Dicer。它可与双链RNA结合，并将其剪切成 21～23nt及3'端突出的小分子RNA片段，即siRNA。 随后siRNA与若干个蛋白组成的，RNA引起的称之 为RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，解旋成单链，并由该复合 体主导RNAi效应。RISC被活化后，活化型RISC受 已成单链的siRNA引导（guide strand），序列特异 性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶 mRNA的特异性分解。
机制原理
细胞自然存在二种干扰RNA：
小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）： 19-25nt，由长dsRNA裂解而成的小片段，诱导 mRNA降解。
microRNA(miRNA) ：22nt，呈短发夹结构（short hairpin RNA，shRNA），由miRNA前体酶解而成， 抑制mRNA翻译。
RNA干扰
目录
概念 发展简史
问题与展望
机制原理
应用
制备方法
概
念
RNAi(RNA interference ，RNA干扰)： 短双链RNA（dsRNA）诱导靶基因mRNA 特异性降解，或阻止mRNA翻译，产生基 因沉默（gene silence)的现象。因此，又 称为knockdown。 它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、 抑制转座子活动、调控基因表达的监控机 制，具有重大生物学意义。