血型鉴定操作规程
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血型鉴定操作规程
一．玻片法（仅适用于正定型）
1 .原理：
1.1根据红细胞上有无A抗原或（和）B抗原，可以将红细胞血型分为A型、B型、AB型和O型。根据抗-A和抗-B抗体与对应红细胞的凝集反应，可以鉴定ABO血型。
1.2根据抗-D抗体与对应红细胞抗原的凝集反应，区分RhD阳性和RhD阳性。
2 .标本采集：
用EDTA抗凝管采集被检对象静脉血，充分混匀，确保抗凝充分。紧急情况下可以使用抗凝动脉血。婴幼儿及其他不便于真空管采血的患者，如不进行反定型试验可采集末梢血。
3. 标本运送与储存：
采集好的标本与申请单同期尽快（一般2小时内）送往输血科。标本采集后和检测后，应置于2~8℃环境下。检测后的标本应至少保存7天，以备结果查对。
4 .仪器与材料：
抗-A/B血型定型试剂（单克隆抗体）、RhD（IgM）血型定型试剂（单克隆抗体）、载玻片、试管架、一次性塑料滴管、记号笔。
5. 操作步骤：
5.1用标记笔在载玻片上划分成A、B、D三个区域；
5.2在标记好的玻片上分别加1滴抗-A、抗-B和抗-D血型定型试剂；
5.3再各加1滴10%患者红细胞悬液（该红细胞悬液可以是盐水悬液，也可以是悬浮于自身血浆或血清中的红细胞）；
5.4用干净的搅拌棒将红细胞悬液和试剂充分混合，并把混合物均匀涂开，使其覆盖大约直径20mm的面积；
5.5缓慢连倾斜摇动玻片1-2min，观察结果并记录。
6. 结果判定：
6.1凝集或发生溶血为阳性结果；
6.2细胞混匀2min后仍呈悬液状态的为阴性结果；
6.3对结果有怀疑，应用试管法或微柱凝胶法重复实验。
二、纸板法
1 .原理：
1.1根据红细胞上有无A抗原或（和）B抗原，可以将红细胞血型分为A型、B型、AB型和O型。根据抗-A和抗-B抗体与对应红细胞的凝集反应，可以鉴定ABO血型正定型。A1细胞上含有A和A1抗原，B细胞上含有B抗原。用已知的A、B细胞检测被检者血清中有无相应的抗-A或抗-B抗体，即反定型。综合正反定型结果确定受检标本ABO血型。
1.2根据抗-D抗体与对应红细胞抗原的凝集反应，区分RhD阳性和RhD阳性。
2 .标本采集：
用EDTA抗凝管采集被检对象静脉血，充分混匀，确保抗凝充分。紧急情况下可以使用抗凝动脉血。婴幼儿及其他不便于真空管采血的患者，可采集末梢血。
3. 标本运送与储存：
采集好的标本与申请单同期尽快（一般2小时内）送往输血科。标本采集后和检测后，应置于2~8℃环境下储存。检测后的标本应至少保存7天，以备结果查对。
4 .仪器与材料：
抗-A/B血型定型试剂（单克隆抗体）、RhD（IgM）血型定型试剂（单克隆抗体）、血型鉴定专用纸板、试管架、一次性塑料滴管、记号笔。
5. 操作步骤：
5.1 取洁净五孔血型鉴定专用纸板，做好姓名标记；
5.2 按纸板标识向每孔中分别加入相应试剂抗A、抗B、抗D血清各1滴以及受检者血清各2滴；
5.3 各孔中分别加入受检者红细胞适量及相应所需3-5％A型、B型试剂红细胞（自制或商品化试剂）并搅匀，使其覆盖直径15-20mm的面积；
5.4 轻轻旋转摇晃混匀，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块，边摇边观察；
5.5 3min以上记录结果。记录观察到的凝集程度或溶血程度。
6. 结果判定：
6.1凝集或发生溶血为阳性结果；
6.2细胞混匀2min后仍呈悬液状态的为阴性结果；
6.3对结果有怀疑，应用试管法或微柱凝胶法重复实验。
三、试管法
1 .原理：
1.1根据红细胞上有无A抗原或（和）B抗原，可以将红细胞血型分为A型、B型、AB型和O型。根据抗-A和抗-B抗体与对应红细胞的凝集反应，可以鉴定ABO血型正定型。A1细胞上含有A和A1抗原，B细胞上含有B抗原。用已知的A、B细胞检测被检者血清中有无相应的抗-A或抗-B抗体，即反定型。综合正反定型结果确定受检标本ABO血型。
1.2根据抗-D抗体与对应红细胞抗原的凝集反应，区分RhD阳性和RhD阳性。
2 .标本采集：
用EDTA抗凝管采集被检对象静脉血，充分混匀，确保抗凝充分。紧急情况下可以使用抗凝动脉血。婴幼儿及其他不便于真空管采血的患者，如不进行反定型试验可采集末梢血。
3. 标本运送与储存：
采集好的标本与申请单同期尽快（一般2小时内）送往输血科。标本采集后和检测后，应置于2~8℃环境下储存。检测后的标本应至少保存7天，以备结果查对。
4 .仪器与材料：
抗-A/B血型定型试剂（单克隆抗体）、RhD（IgM）血型定型试剂（单克隆抗体）、一次性试管、试管架、一次性塑料滴管、记号笔。
5. 操作步骤：
5.1 ABO血型正定型试验
5.1.1 取两支洁净试管，做好标记，按试管标记向试管中加入抗-A、抗-B血清各1滴；
5.1.2 向每管中各加入1滴3-5％被检红细胞盐水（血清或血浆）悬液；
5.1.3 轻轻混合试管内容物，1000g离心15s；
5.1.4 结果判断：将试管拿成锐角，缓慢倾斜，使液体通过细胞扣，当细胞不再附着在试管上时，继续缓慢地倾斜和振摇，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块；
5.1.5 记录结果：记录观察到的凝集程度或溶血程度。用ABO反定型实验进一步验证正定型结果。
5.2 ABO血型反定型试验
5.2.1 取两支洁净试管，做好标记，向每管中各加2滴被检血清（或血浆）；
5.2.2 按试管标记向试管中加入3-5％A型、B型试剂红细胞各1滴；
5.2.3 轻轻混合试管内容物， 1000g离心15s；
5.2.4 结果判断：将试管拿成锐角，缓慢倾斜，使液体通过细胞扣，当细胞不再附着在试管上时，继续缓慢地倾斜和振摇，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块；
5.2.5 记录结果：记录观察到的凝集程度或溶血程度。与正定型结果进行相互验证；
5.2.6 如果反应较弱，可将试管于室温（或4℃）放置5～10min，以促进弱抗体的反应，再离心观察结果。如果反应还是很弱可以增加血清（或血浆）滴数，最多到6滴以加强反应。
5.3 RhD血型鉴定试验
5.3.1 取一支洁净试管，做好标记，加入抗-D血清1滴；
5.3.2 向试管中加入1滴3-5％被检红细胞盐水（血清或血浆）悬液；
5.3.3 轻轻混合试管内容物，1000g离心15s；
5.3.4 结果判断：将试管拿成锐角，缓慢倾斜，使液体通过细胞扣，当细胞不再附着在试管上时，继续缓慢地倾斜和振摇，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块；
5.3.5 记录结果：记录观察到的凝集程度或溶血程度。
6.1凝集或发生溶血为阳性结果；
6.2细胞混匀2min后仍呈悬液状态的为阴性结果。
四、微柱凝胶法
1.原理：
ABO/RhD卡的微管中装填有葡聚糖凝胶颗粒和抗A、抗B、抗D标准血清，如果红细胞表面存在A或B或D抗原，就会与对应的抗体发生凝集反应，凝胶颗粒具有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作用下通过凝胶颗粒，使其悬浮在凝胶颗粒中，未凝集的红细胞则可以通过凝胶颗粒到达微管底部。
2 .标本采集及处理：
用EDTA抗凝管采集被检对象静脉血，充分混匀，确保抗凝充分。紧急情况下可以使用抗凝动脉血。3000rpm，离心3-5min。（婴幼儿及其他不便于真空管采血的患者，如不进行反定型试验可采集末梢血。）
3. 标本运送与储存：
采集好的标本与申请单同期尽快（一般2小时内）送往输血科。标本采集后和检测后，应置于2~8℃环境下储存。检测后的标本应至少保存7天，以备结果查对。
4 .仪器与材料：
ABO\RhD血型定型检测卡（单克隆抗体）、ABO\RhD血型检测卡（微柱凝胶）、、试管架、一次性塑料滴管、记号笔、一次性试管。
5. 操作步骤：
5.1将微住凝胶试剂卡做好患者姓名等标记；
5.2 将待检红细胞用低离子强度溶液稀释成0.5%-0.8%的悬浮液，加入标有-A、-B、-D(和对照)的微管中，各1滴（或50ul）；
5.3用低离子溶液将反定型红细胞A1、B配成0.5%~0.8%浓度，分别加入对应的微孔AC、BC中，各1滴（或50μl）。再分别加入患者血浆各1滴（或50μl）；
5.4专用离心机离心5分钟，2分钟900rpm, 3分钟1500rpm,取出肉眼判定结果。
6. 结果判定：
6.1阳性结果：红细胞抗原与相应抗体在微住凝胶中形成的特异性抗原抗体复合物浮在凝胶表面或胶中，为阳性反应。
6.1 反应强度：特异性红细胞抗原抗体复合物位于凝胶表面，为强阳性反应；复合物在凝胶中为弱阳性反应；愈靠近凝胶底部颗粒愈小，反应愈弱。
6.1 阴性结果：被检红细胞抗原无相应的抗体结合，不出现特异性抗原抗体复合物，红细胞沉于为主凝胶的底部。
附：
血型反应格局与结果对照表
正定型试验
(患者红细胞与下列试剂反应) 反定型试验
(患者血清/血浆与下列试剂反应) 血型结果
抗-A 抗-B 抗-D 空白对照 A细胞 B细胞 O细胞
+ - + - - + - A型 阳性
- + + - + - - B型 阳性
- - + - + + - O型 阳性
+ + + - - - - AB型 阳性
+ - - - - + - A型 阴性
- + - - + - - B型 阴性
- - - - + + - O型 阴性
+ + - - - - - AB型 阴性
