第五章 愈伤组织培养

外植体自身因素
（1）外植体自身因素（内因）
①母体植株的遗传基础

被子植物比裸子植物容易，被子植物中茄科、
秋海棠科、景天科、苦苣苔科和十字花科植物
成功报道最多；

无性繁殖植物比有性繁殖植物的容易； 同种植物不同品种（基因型）的培养效果不同
② 外植体的类型 影响培养的难易：一般生理状态年轻，来源 于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞 容易培养。
碳水化合物：淀粉和糖


蛋白质
各种附加成分：如固氮细菌、杀虫剂、杀菌 剂、除草剂和植物激素等
第三步 人工种皮制作
1）包埋介质的选择： 无毒、透气、保水性好

有足够硬度（不胀大），保证安全（不泄露营 养物）

包埋材料： 琼脂、琼脂糖、藻酸盐、明胶、淀粉、动物胶、 角叉胶、刺槐豆胶、阿拉伯树胶、果胶、蛋白 胶、黄芪胶等种类。

烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物 的脱分化比较难；


花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；
幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比 较难。
（2）培养基种类对愈伤组织诱导的影响。
诱导愈伤组织常用的培养基为MS和B5。
（3）外源激素对愈伤组织诱导的影响---重要因素。 （4）培养条件对愈伤组织诱导的影响: 湿度条件、 温度条件、光照条件。
1）生长素
2）其他植物生长物质的作用 3）氨源形态的影响 4）其他培养条件对胚状体发生的影响
3.4 体细胞胚状体诱导的影响因素
1）生长素

形成体细胞胚的关键是除去或降低培 养基中的生长素成分（如2,4-D）。
愈伤组织在生长素0.5～1mg/L的培养 基上分化形成分生细胞团（称胚性细 胞团）； 转移到生长素含量很低或没有生长素 的培养基上，就能发育为胚状体。
2. 3 形成期：

指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形 态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不 同形态和功能的细胞。
细胞特点：
◎
细胞分裂部位和方向发生改变：内部细胞发生 分裂，形成像维管束或类似分生组织，组成的 鸟巢状结构。 细胞的体积相对稳定，不再减少。 出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、 薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等。
起始期细胞内发生的变化
激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活 动加强，蛋白质和核酸的合成增加, 诱导细胞 开始分裂。 每个细胞的蛋白质总增加量可达200 % 酶活性增强，气体交换增加，如氧气的吸收增 加
细胞的大小没有多大改变
2. 2 分裂期:

分裂期：外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分 裂增生子细胞的过程。 脱分化：细胞由静止期进入分裂期，恢复分裂机能
1 愈伤组织形态 发生方式
愈伤组织器官发生
通过体细胞胚胎/胚 状体途径再生植株
3
3.1
体细胞胚发生途径
胚状体/体细胞胚（embryoid） ：指植物
细胞、组织或器官的离体培养中，起始于一个 非合子细胞，并经过胚胎发育过程分化出的类 似胚一样的细胞群。 经过：球形胚－心形胚－鱼雷形胚－成熟胚
Development of the Arabidopsis Embryo


第一节 愈伤组织的诱导和分化 第二节 愈伤组织中的形态发生 第三节 人工种子
第三节
1 定义与结构

人工种子
人工种子是指外面包裹一层有机薄膜的植物胚状体。 胚状体或芽：有生命的物质结构。 人工胚乳：供胚状体维持生命力。 人工种皮：保护作用。
人工种子的优点:
1）结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直 接播种，易于机械化操作； 2）不受季节限制，不受环境制约，胚状体数量 多、繁殖快、有利于工厂化生产； 3) 有利于繁殖生育周期长、自交不亲合、珍贵稀 有的一些植物，也可大量繁殖无病毒材料； 4) 加入抗生素、农药、菌肥等成分，提高人工种 子活力和品质； 5) 由无性繁殖体系产生胚， 固定杂种优势。
各种生长素对黄瓜各外植体愈伤组织诱导的效应 （各种生长素浓度为10μmol/L）
愈伤组织形成
生长素 IBA NAA 2,4-D 种子 下胚轴 果皮 IBA浓度为1μmol/L时愈 伤组织生长良好 愈伤组织增殖强 愈伤组织增殖强 无愈伤组织形成 愈伤组织增殖强 无愈伤组织形成 所有外植体均产生 愈伤组织 所有外植体均产 2,4-D浓度为1μmol/L时 生愈伤组织 愈伤组织生长良好



原因：2,4-D等生长素可以诱导内源乙烯（Eth） 产生；内源Eth不影响愈伤增殖，但抑制愈伤 组织进一步分化成胚。 乙烯也会导致纤维素酶或（和）果胶酶活性的 增强，从而破坏胚性细胞团，使原胚不能发生 组织分化。

2）其他植物生长物质的作用
细胞分裂素有利于胚状体的形成


0.1μg·L-1 玉米素促进胡萝卜体细胞胚发生。
第五章 愈伤组织的培养


第一节 愈伤组织的诱导和分化 第二节 愈伤组织中的形态发生 第三节 人工种子
第一节 愈伤组织的诱导和分化

1 愈伤组织的诱导

2 影响愈伤组织诱导形成的主要因素
1 愈伤组织的诱导

愈伤组织(callus)：离体组织 或器官进行离体培养时，进 行细胞分裂，形成一种高度 液泡化的无定形的薄壁细胞。
From embryo culture
From root
2 愈伤组织的形成

从外植体脱分化形成 典型的愈伤组织大致 可分为三个时期：
愈伤组织形成
起始期 分裂期 形成期
2. 1 起始期：

细胞准备进行分裂的时期。


外植体的细胞处在静止状态。
一些刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧 等)和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活 动加强，蛋白质和核酸的合成, 诱导细胞开始分裂。
第六章 营养器官培养

器官培养（Organ culture ） ：

主要指植物根、叶、茎、花、果实等器官在离
体条件下，在无菌的人工环境种做进一步培养
发育，最终长成幼苗的过程。

特点：能保持它们所具有的特征性结构，通过
器官培养可快速大量地繁殖。
第六章 营养器官培养
第一节 根的培养 第二节 茎的培养 第三节 叶的培养
2）包埋技术 用褐藻酸钠等水溶性凝胶经与Ca2+进 行离子交换后凝固，用于包埋单个胚 状体。
贮藏与发芽 一般将人工种子贮藏在4-7℃低温、相 对湿度小于67%的条件下。实际上，随贮藏 时间的延长，人工种子的萌发率会显著下降。
现在已有胡萝卜、芹菜、柑橘、咖 啡、棉花、玉米、水稻、橡胶等几十种植 物的人工种子试种成功，但由于成本较高， 中国尚未应用于生产。
2 制作
人工种子制作过程
胚状体
包埋 技术
其他物质
人工胚乳 人工种皮
第一步胚状体诱导

1）选取目标植物


2）诱导愈伤组织
3）愈伤组织增生 4）胚状体诱导
胚状体同步增殖：

DNA合成抑制剂
低温处理 调节渗透压 分离过筛 调节植物激素配比
第二步人工胚乳制作
人工胚乳的成分


无机盐混合物
石龙芮胚状体发生的过程
玫瑰心形体细胞胚
香蕉心形体细胞胚
3.2 体细胞胚的产生方式

1）直接在器官上发生
胚性愈伤组织


2） 悬浮培养细胞发生途径
3）愈伤组织发生途径 : 幼胚、胚和子叶 4）单细胞发生途径：花药培养中的小孢子发育成 4）原生质体发生途径
3.3 体细胞胚状体诱导的影响因素
GA3、ABA抑制成胚；
3）氨源形态的影响

还原N（NH4+）
氧化N（NO3-）


有机氮 （氨基酸、水解酪蛋白等）
野生胡萝卜叶柄节段的培养中，只有在含一定 数量还原态氮的培养基时，才能有胚胎发生， 用NH4+ 和水解酪蛋白优于NO3- 或谷氨酰胺。

4）其他培养条件对胚状体发生的影响 液体培养 适宜pH5-6 光照：不需要光或半天光照时间 温度25 ℃左右
2,4-D和BA浓度对银胶菊茎段愈伤组织生长的影响
处理（2,4-D:BA）
0: 0 0: 0.1 0：0.2 0.05: 0 0.05: 1 0.05: 2 0.1: 0 0.1: 0.1 0.1: 0.2
愈伤组织形成情况
仅有，不生长 有限的生长，显绿色 生长不良 大块、绿色，平均直径为10mm 生长不良，稍带褐色 生长不良，稍带褐色 大块，绿色至浅褐色 大块，绿色至浅褐色 稍小于0.1:0.1比例，变褐
伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。

转移到新鲜培养基：定期地将它们分成小块，接
种到新鲜的培养基上，可以长期保持旺盛的生长。
第一节 愈伤组织的诱导和分化

1 愈伤组织的诱导

2 影响愈伤组织诱导形成的主要因素
2 影响愈伤组织诱导形成的主要因素
（1）不同植物和外植体诱导愈伤组织能力的差异。
不同植物种类、同一植物不同器官来源及其生理状况、 年龄的外植体的脱分化（形成愈伤组织）能力有很大 差别。
根据愈伤难易程度：
胚性愈伤组织容易形成胚状体
非胚性愈伤组织
表面粗糙、组织结构疏松。
胚性愈伤组织
表面呈颗粒状、组织结构紧凑、 再生力强。
非胚性愈伤组织诱导率可达100％，胚性愈伤组织诱导率相对较低。
愈伤组织生长周期

愈伤组织生长周期为2－4周。

在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质 枯竭，水分散失，或有毒代谢物的积累，导致愈
愈伤组织器官发生