基因操作实验技术实验报告

实验一 质粒DNA的提取、酶切、电泳鉴定
一 实验目的
1、熟练掌握质粒DNA提取的操作方法以及酶切电泳操作；
2、理解质粒DNA提取的原理。
二 实验原理
这一方法的基本原理是在含强阴离子洗涤剂的碱性溶液中细胞破裂而染色体和蛋白质变
性，并和破裂的细胞壁互相缠绕成大型复合物，分子量较小的质粒DNA和RNA释放到上清
液中，前者被被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有
效的沉淀下来。用SDS和强碱处理细胞是使质粒和染色体分离的关键步骤，这时染色体和其
他成分形成的复合物是比较脆弱的，如动作过于剧烈或处理时间过长则会有较多的染色体释
放到清夜中在随后用溶液III处理时这部分染色体依然和质粒混在一起，由于质粒和染色体均
属于DNA因此两者很难再被分开。硅胶具有一特殊的性质，即在高离子强度的溶液中可以
与核酸专一性的结合，而在离子强度降低后又能与所结合的核酸分离。质粒提取试剂盒就是
根据这一原理实现质粒的快速纯化。
三 实验材料仪器及详细实验步骤
用硅胶膜分离法提取质粒----将提取的质粒进行酶切分析----酶切产物的电泳鉴定
（详细的实验步骤和材料仪器请参考实验讲义）
四 实验结果与分析讨论

M 12-3 12-4 12-5 13-1 13-2 13-3 13-4

图1.质粒pLac18酶切结果
上图中13-2对应电泳条带是本组的实验结果。由图可知，本组实验结果较好，条带亮度
高，说明质粒提取成功，可以顺利进行下面实验。
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五 注意事项
（1）加入溶液II和溶液III后操作要缓慢轻柔，不可剧烈振荡。动作过于剧烈或处理时间过
长则会有较多的染色体释放到清夜中，用溶液III处理时这部分染色体依然和质粒混在一起，
由于质粒和染色体均属于DNA因此两者很难再被分开；
（2）结合缓冲液低温时会出现结晶，使用时看是否已经结晶，如有需加热使结晶化开，在吸
附柱中加入结合缓冲液后操作要迅速，以防柱内停留时间过久降温出现结晶；
（3）洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效
率；
（4）除去残留液体从离心机中拿出样品时要竖着拿，避免酒精碰到质粒，对酶切以后的工作
产生影响。
（5）随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低，为了得到较高的回收率可以增大洗
脱体积，洗脱时间对回收率也会有一定影响。
（6）质粒酶切的时候，试剂的量比较小，要保证质粒、限制性内切酶缓冲液M都加入到离
心管管底以充分混匀而不是残留在管壁上。
总之，在此次实验的提取过程中，最重要的是把握好使用溶液的剂量和时间，以及溶液
的震荡程度和离心时间；电泳时加样要稳而准，以免样品扩散或碰到凝胶上。
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实验二 嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶基因的PCR扩增以及PCR产物的纯化
一 实验目的
学会PCR实验技术的原理，并且掌握PCR的操作方法。
一 实验原理
PCR是一项特异性DNA序列的体外酶促合成方法。它是利用2个寡聚核苷酸作为引物
与对应的DNA链的目的区域的侧翼杂交，经过模板变性作用，引物退火和耐热DNA聚合酶
酶促引物延伸，周而复始的重复产生特定片段，该片段的末端由引物的5’端决定。
三 实验材料仪器及步骤
淀粉酶基因的PCR扩增与鉴定----用硅胶柱纯化PCR产物------PCR产物的酶切及电泳鉴
定（实验材料仪器以及详细的实验步骤请参考实验讲义）
四 实验结果与讨论

M 11-1 13-1 13-2 13-3 13-4 15-1 15-2

图2 PCR产物酶切电泳鉴定结果
上图中13-2对应的电泳条带是本组的实验结果。观察图可知，本组条带亮度较好，说明
PCR产物提取成功。
五 注意事项
影响PCR的因素主要有：酶、引物、模板浓度及酶的质量，dNTP浓度，Mg2+浓度，退
火温度，循环次数等，影响因素复杂。所以在PCR扩增操作时要认真严格，尽量在最适条件
下进行，把握好PCR温度和时间，在用硅胶柱纯化PCR产物时，可以适当增加离心回收次
数，使实验效果更好。
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实验三 感受态大肠杆菌JM109制备
一 实验目的
学会如何制备感受态细胞
二 实验原理
在一个生长过程中的细菌培养物中，只有某一阶段的细胞才能作为转化的受体。细胞能
接受转化的生理状态叫感受态。处于感受态的细胞表面存在DNA受体蛋白和一些其他的转
化特异性蛋白。本实验是通过冰冷却的氯化钙处理大肠杆菌使其细胞膜的通透性发生改变，
从而使带有外源DNA的载体容易进入受体细胞，通过复制与表达，使受体细胞获得新的遗
传性状。
三 实验材料仪器及步骤
实验详细步骤请参考实验讲义
四 实验结果与讨论
要获得较高的转化率的关键是保持低温，即菌液离开冰水的时间要尽可能短；此实验中
采用对数生长期的大肠杆菌，而且越前期越好，因为此时期外源DNA不易被降解；所制得
的感受态细胞浓度越高越好。
实验操作过程应在低温条件下进行，在后面的氯化钙悬浮菌体时可以加适量甘油，起到
保护菌体的作用，冰浴和离心时间对实验有影响，应把握好时间。
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实验四 PCR产物和载体的酶切，纯化和连接
一 实验目的
再次练习酶切电泳的实验操作，学会连接的原理和操作
二 实验原理
连接是指单链核酸分子间的共价连接反应。如双链DNA的一条链上切口两端的两个紧
邻核苷酸间形成磷酸二酯键的反应。利用DNA连接酶把载体DNA和要克隆的目的DNA片
段连接在一起，成为一个完整的重组分子，这就是分子克隆中常说的连接反应。当载体DNA
和外源DNA末端都是由一种产生粘性末端的内切酶切割产生的话（同尾酶也可以），或者两
者末端被接上一段互补的多聚体的尾巴，那么经退火后可形成新的重组分子。连接后产生的
重组分子中仍然保留着外源DNA两端的限制性内切酶切点，从而使我们能方便地从重组分
子再次取出所克隆的DNA段
三 实验材料及步骤
（详细实验步骤请参考实验讲义）
四 注意事项
混匀的时候要尽量避免产生气泡为保证所有的载体被切开，加样时避免将样品抖到壁上，
如有可以将混合物离心一下将管壁上的载体离心到管底的酶中。
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实验五 连接产物的转化与转化子鉴定
一 实验原理
转化是指某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型细胞的游离DNA，并将其
整合到自己染色体基因组中，从而获得后者遗传现象的现象。转化后，按照一定的遗传标记
在基本培养基中检出转化子。本实验是以重组质粒pLac18作为外源DNA，因pLac18携带氨
苄青霉素抗性基因，当用pLac18转化时，转化子具有氨苄青霉素抗性基因新的遗传性状，在
含有一定浓度的氨苄青霉素平板上，受体细胞不能生长，而只有转化子才能生长繁殖。
二 实验材料仪器及步骤
参考实验讲义
三 实验结果与讨论
本实验一般有三种结果：
A.平板上菌落特别多，一般是因为质粒与酶混合不均匀，酶切不干净；
B.有3-8个菌落，此种情况最好，酶切很干净，转化状态也很好；
C.没有菌落，可能感受态细胞制备不成功。
本组实验结果属于第三种，转化不成功。有可能是感受态细胞制备得不成功。之后的实
验感受态细胞由老师提供。
本实验操作较简单，但在实验中水浴时间的控制极其重要，加入的加入连接产物量对实
验的结果也有较大的影响，涂平板时应操作规范，涂布均匀。
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实验六 连接转化子的鉴定
一 实验目的
学会鉴定连接转化子
二 实验材料及实验步骤
转化子培养----提取质粒----质粒酶切----酶切产物电泳 （详细实验步骤请参考实验讲义）
三 实验结果与讨论：
12-5 12-4 12-3 13-4 13-3 13-2 13-1 M

图3 连接转化子鉴定结果
上图中13-2对应的电泳条带为本组重组质粒酶切图像。观察图中条带可知，两个条带颜
色明亮，且无杂带，说明本组成功制备了重组质粒。另外，观察12-5对应的电泳条带，看到
三个条带，分析原因应该是提取的重组质粒数量较多。
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实验七 重组大肠杆菌转化子酶活鉴定
一 实验目的
练习酶活测定的实验操作，了解其原理
二 实验原理及详细实验步骤
培养过夜----培养悬浮细胞----超声波破碎----细胞破碎液与淀粉混合反应进行碘液鉴定
（详细实验步骤请参考实验讲义）
三 实验结果与讨论：

观察本组的实验结果，现象对比很明显。大肠杆菌表达出的耐热α-淀粉酶将淀粉水解，
加入碘液后没有颜色变化(3)。此实验结果可以得出，本组制备重组大肠杆菌转化子酶活较高，
整个实验较成功，得到了理想的效果。
在菌落培养过程中应防止染菌，碘液测淀粉酶活时碘液的用量和测定时间对结果有较大
的影响。