RNA提取,RT-PCR实验报告

rtpcr实验报告RT-PCR实验报告一、引言RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA样本中的特定基因表达水平。

本实验旨在通过RT-PCR技术，对目标基因在不同组织或条件下的表达进行定量分析，以进一步了解其功能和调控机制。

二、实验材料与方法1. 材料：- RNA样本：从不同组织或条件下提取的总RNA。

- RT-PCR试剂盒：包括逆转录酶、聚合酶、引物等。

- DNA分子量标记物：用于测定PCR产物的大小。

- 离心管、PCR管、PCR仪等实验器材。

2. 方法：（1）RNA提取：采用某种RNA提取试剂盒，按照说明书提取不同组织或条件下的总RNA。

（2）逆转录反应：将提取的RNA模板与逆转录酶、引物和其他试剂混合，进行逆转录反应，将RNA转录为cDNA。

（3）PCR扩增：将逆转录反应产生的cDNA作为模板，与引物和PCR试剂混合，进行PCR扩增。

（4）电泳分析：将PCR产物与DNA分子量标记物一同进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR产物的大小判断目标基因的表达水平。

三、实验结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地获得了目标基因在不同组织或条件下的表达数据，并进行了初步的分析和讨论。

1. RT-PCR结果分析我们首先进行了RNA提取和逆转录反应，得到了各组织或条件下的cDNA样本。

然后，我们设计了特异性引物，进行了PCR扩增。

最后，通过琼脂糖凝胶电泳，观察到了PCR产物的带型。

根据PCR产物的带型，我们可以初步判断目标基因在不同组织或条件下的表达水平。

比如，在组织A中，我们观察到了明显的PCR产物带，说明该基因在组织A中高表达；而在组织B中，PCR产物带较弱，说明该基因在组织B中低表达。

2. RT-PCR结果验证为了验证实验结果的准确性，我们进行了重复实验和对照实验。

通过对照实验，我们可以排除PCR扩增的假阳性结果。

通过重复实验，我们可以评估实验的重复性和稳定性。

在重复实验中，我们发现，不同实验之间的PCR产物带型一致，表明实验结果具有较好的重复性。

RNA制备及其鉴定实验目的初步掌握组织总RNA制备的原理及其基本方法，掌握RNA纯度鉴定的基本方法。

实验原理细胞内的RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP）的形式存在。

分离制备RNA时，首先必须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将RNA同其他的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。

本次实验我们选用了Trizol法分离提取小鼠肝组织的总RNA，Trizol法分离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解。

评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性。

均一的RNA取决于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白质和其他杂质；完整的RNA取决于最大限度地避免纯化过程中内源性及外源性RNA酶对RNA的降解。

通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/A280=2.0，但由于所用的标本不同，此比值有一定的变化，一般在1.8~2.0之间，低于改值表明有蛋白污染，需进一步用酚/氯仿抽提。

RNA的完整性可通过琼脂糖电泳法进行鉴定。

完整的RNA电泳时，28S和18SrRNA经EB染色后，两条电泳条带的显色强度近似为2比1。

本实验中几个重要试剂的作用：Trizol试剂：Trizol的主要成分是苯酚、异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇、醋酸钠、柠檬酸钠。

它的主要作用是1、裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。

2、使蛋白质变性，有利于DNA和RNA与蛋白质的分离。

3、抑制内源和外源RNase。

氯仿：氯仿的作用有多个方面，一、作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去。

二、通过变性作用抑制RNase活性；三、通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；四、作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。

异丙醇：异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。

只不过用量要比乙醇少。

异丙醇是等体积，而乙醇一般需要2.5倍体积。

在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：第二实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称总RNA的提取与RT-PCR实验日期2019-11-22 实验地点第二实验室合作者指导老师评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03 一、实验目的1. 掌握从细胞中提取总RNA的方法2. 熟悉离心机的基本操作3. 掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程4. 熟悉电泳法鉴定所得RNA二、实验原理1. 细胞总RNA的提取及定量1)每个细胞内大概有10-5mg RNA（主要有rRNA，tRNA，mRNA三种）2)mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA 3)对RNA进行分离有异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。

4)目前常用的是Trizol法，能快速地从细胞组织中分离出RNA，适用于小量样品也使用于大量样品5)在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。

6)取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA ，用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质2. 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达三、材料与方法：以流程图示意材料总RNA的提取RT-PCR1. 微量加样枪，灭菌超薄PCR反应管， 1.基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超2. Trizol试剂，氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS（溶液均用DEPC 处理过的水配置）薄PCR反应管2.提取的总RNA3.第一链cDNA合成试剂盒（含有逆转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液）4.dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。

RNA提取原理及每个步骤的原理一、实验目的：提取组织中RNA,作为逆转录cDNA的原料二、实验原理：（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）a） TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。

试剂主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。

加入氯仿后离心，样品分成水样层（无色）和有机层（黄色）。

RNA存在于水样层中。

收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。

乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

三、实验材料：氯仿，异丙醇，Rnase-free ddH2O，75%乙醇（用Rnase-free水配制）四、实验步骤：（TIANGEN：Phase lock Gel TM Henny 配合Trizol A+提总RNA 操作）实验流程图细胞细胞选择冷贴壁细胞斗悬浮细胞pHS.71.匀浆处理（*打开离心机，降温）a） -80℃冻存组织，转移至普通2ml管中，每30mg组织加1ml Trizol A+。

用匀浆仪匀浆，样品体积不超过Trizol A+体积的10% （注：先加7003 Trizol A+,再加3003，防止外溢；一般匀浆1.5~2min,可设Timer）裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中2.将匀浆样品在20℃左右放置5min使RNA充分释放到溶液中3. 将Phase lock Gel TM（PLG）置于离心机中，15000Xg 离心30s离心到底部，不让贴壁4.将第2步中的匀浆样品全部转移至离心后的PLG中，每1ml Trizol A+加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s分层，PLG可在在水相和有机相之间形成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，这样，全部水相样品可轻松吸出，完全不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流出来。

rtpcr实验报告标题：rtpcr实验报告摘要：本实验使用了rtpcr技术对特定基因进行检测，通过分析实验结果，得出了基因表达水平的定量数据。

实验结果表明，该基因在不同条件下的表达水平存在显著差异，为进一步研究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。

引言：rtpcr（reverse transcription polymerase chain reaction）是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测特定基因的表达水平。

通过rtpcr实验，我们可以定量分析基因在不同组织、不同条件下的表达情况，从而深入研究基因在生物学过程中的作用。

材料与方法：1. 样本准备：收集不同组织或细胞系的样本，提取总RNA。

2. 反转录：使用反转录酶将RNA转录成cDNA。

3. pcr扩增：设计引物，进行实时荧光定量pcr扩增。

4. 数据分析：利用实时pcr仪器收集数据，进行定量分析。

结果：通过rtpcr实验，我们得到了不同组织或细胞系中特定基因的表达水平数据。

实验结果显示，在不同条件下，该基因的表达水平存在显著差异。

例如，在刺激条件下，基因的表达水平明显上调；而在抑制条件下，基因的表达水平则显著下调。

这些数据为我们进一步探究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。

讨论：rtpcr实验结果表明，特定基因在不同条件下的表达水平存在显著差异。

这表明该基因可能在特定生物学过程中发挥重要作用，或者受到外部环境的调控。

进一步的研究可以探究该基因在细胞信号传导、代谢调控等方面的作用机制，为相关疾病的治疗提供理论依据。

结论：通过rtpcr实验，我们成功地分析了特定基因在不同条件下的表达水平。

实验结果表明，该基因在生物学过程中可能发挥重要作用，为进一步研究该基因的功能和调控机制提供了重要参考。

这项研究为深入探究基因在生物学过程中的作用提供了重要的实验基础。

总RNA的提取与RT、Realtime-PCR一、实验原理RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。

获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。

由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。

再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。

1．RNA提取的最大影响因素-RNA酶但是由于RNA酶（RNase）广泛存在且稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压等。

RNase催化的反应一般不需要辅助因子，因而RNA制剂中只要存在少量的RNase就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，所以RNA的制备过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。

外源性的RNase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。

在其它分子生物学实验中使用的RNase也会造成污染。

这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。

而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNase。

2．常用的RNA酶抑制剂*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNase抑制剂。

它通过和RNase的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

*异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNase抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNase失活。

它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNase有强烈的变性作用。

*氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNase结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNase的活性。

*RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。

RNasin是RNase的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNase结合，使其失活。

rt pcr实验报告RT-PCR实验报告引言：RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和定量RNA的表达水平。

本实验旨在通过RT-PCR方法分析目标基因在不同组织和条件下的表达情况，从而深入了解其功能和调控机制。

材料与方法：1. 细胞或组织样本：选择不同类型的细胞或组织样本，如肝脏、肺、肌肉等。

2. RNA提取试剂盒：使用RNA提取试剂盒提取样本中的总RNA。

3. 逆转录试剂盒：使用逆转录试剂盒将RNA转录为cDNA。

4. PCR试剂盒：使用PCR试剂盒进行聚合酶链式反应。

5. 热循环仪：使用热循环仪进行PCR反应。

实验步骤：1. 样本处理：将细胞或组织样本收集并保存在合适的条件下，以保持RNA的完整性。

2. RNA提取：按照RNA提取试剂盒的说明书进行操作，提取样本中的总RNA。

3. RNA浓度和纯度检测：使用紫外-可见光分光光度计检测RNA的浓度和纯度，确保提取到高质量的RNA。

4. 逆转录反应：按照逆转录试剂盒的说明书进行操作，将RNA转录为cDNA。

5. PCR反应：按照PCR试剂盒的说明书进行操作，设置合适的引物和反应条件，进行PCR反应。

6. 凝胶电泳：将PCR产物与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶上，进行电泳分离。

7. 凝胶图像分析：使用凝胶图像分析软件测量PCR产物的带的强度，并进行定量分析。

结果与讨论：通过RT-PCR实验，我们成功地分析了目标基因在不同组织和条件下的表达情况。

以下是实验结果的一些典型示例：1. 基因在不同组织中的表达差异：我们选择了肝脏、肺和肌肉作为研究对象，分别提取了这些组织中的总RNA，并进行了RT-PCR分析。

结果显示，目标基因在肝脏中的表达水平最高，肺次之，肌肉最低。

这表明目标基因在不同组织中的表达存在差异，可能与其功能和组织特异性有关。

2. 基因在不同条件下的表达调控：我们进一步研究了目标基因在不同条件下的表达调控。