实验报告题目:单元二:目的基因的克隆、转化及重组子筛选指导老师:丛佩清日期:2013/10/24-2013/10/26一．实验目的：(1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。
(2)学习DNA连接的有关技术。
(3)掌握用CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。
(4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
(5)掌握质粒提取的基本方法。
(6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。
二．实验原理：(1)cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有 3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为 T-A克隆。
可用于PCR产物的克隆和测序。
(2)感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。
(3)蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。
诱导物IPTG 和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。
可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。
三．实验材料：大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/L CaCl2溶液、Binding Buffer、spin-column、SPW 溶液、1µl pMD19-T Vector、5µlSolution Ⅰ、250µlSolution Ⅰ、250µlSolution Ⅱ、350µlSolution Ⅲ、HiBind ® Mini Columns (I)、500 µlBuffer HB、1400 µlDNA Wash Buffer等四．实验步骤、现象、结果及分析：Ⅰ10月24号(1)cDNA电泳及胶回收1. 取上周制备的置于-20℃冰箱保存的目的基因产物1、2、3组DNA样品，选取其中2号组及3号组进行琼脂糖电泳，因1号组RT-PCR琼脂糖凝胶电泳有杂带故弃而不用，1、3号组DNA样品（已加入loading buffer）分别加入SYBR Gold2µl，1%琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。
2.把所割胶放入1.5 ml EP管，称重如下表一。
表一：cDNA琼脂糖凝胶重量3.按1g/1ml 的量，大致各加入400µl Binding Buffer，65℃水浴7min；（每隔2－3 min，摇一下）；4.把溶液转移至spin-column，10000g 离心1 min ，倒出套管内残液；5.在柱子中加入300µl Binding buffer，10000g 离心1min，倒出套管内残液；6.在柱子中加入700ul 的SPW 溶液，放置3min，10000g 离心1min ，去残液；7.10000g 离心1min（去乙醇）；8.把柱子放入干净的1.5ml EP 管。
加Elution Buffer 20µl。
室温放置1min，10000g 离心1min。
9.检测DNA的纯度和浓度，如下表二所示。
选取质量好的2号组进行接下来的连接转化。
表二：cDNA吸光度测定（2）感受态细胞制备1.从新鲜培养的LB平板上挑单个DH5a大菌落接种到3mlLB培养液中，37 ℃剧烈振荡培养过夜（教师准备）。
2.取过夜培养的大肠杆菌DH5a按1：50 取1ml菌液接种到50ml LB 培养基中，37 ℃振荡培养，1hr后用分光光度计测其OD值为0.182，1.5 hr后再测其OD值，为0.304，到达其对数生长期（细菌对数生长期OD 600 为0.2-0.4）。
3.分别取1ml 菌液至1.5 ml 离心管中标记为1号、2号、3号，培养物冰上放置10 min，5000 r/min，离心2 min ，用枪头吸取废液，弃去，收集底部菌体。
4.分别加入500µl预冷的0.1 mol/L CaCl2，用枪头吹散，使菌体悬浮于预冷的CaCl2中，冰上放置10分钟。
5.离心机5000r/min，离心2min，用枪头吸取弃上清，分别加入100µl预冷的0.1 mol/L CaCl2，小心用枪头吹散，0℃保存3hr 。
（3）连接和转化注：LB/Amp/IPTG/X-Gal平板配制：取固体LB培养基于微波炉中融化，在超净工作台中冷却至55℃左右，加入80µl氨苄青霉素，混匀，倒入四个已消毒并做好标记的平板，分别是：样品组100µl、样品组200µl、正对照组、负对照组，然后在遮光条件下分别用三角玻璃棒涂布X-Gal 40µl和IPTG 10µl。
Ⅱ10月25号(1)取出过夜培养的4个平板，拍照并计数。
结果如下图所示：图一：样品组-100µl图二：样品组-200µl图三：正对照组图四：负对照组从上述四图可以看出，图三正对照组出现大面积蓝色菌落，证明空载质粒转化成功，平板边缘菌落呈白色，是因为LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板配制时是使用三角玻璃棒涂布X-Gal ，导致边缘不含或少含X-Gal 。
图四负对照组无菌落出现，因培养基中含氨苄青霉素，而感受态细胞无抗性，因而不能生存。
图一样品组-100µl 出现白色和蓝色菌落，证明重组质粒转化成功，图二样品组-200µl 也出现白色和蓝色菌落，但密度比图一高。
白色菌落密度偏高(与其他组相比)的原因：空载质粒的摩尔数=660g/mol×2692/g 10×1μμ×μl /ng 5-9ng=3×10-15mol插入DNA 片段的摩尔数=molg ngg /660×460/10×μl /ng 718.146×μl 49-=1.933×10-12mol空载质粒的摩尔数：插入DNA 片段的摩尔数≈1:1000，该比值远小于1:2到1:10的范围，待插入DNA 片段过多，当时未稀释待插入DNA ，直接进行了转化实验，导致重组白色菌落密度偏大。
对图三正对照组蓝色菌落进行计数，将平板划均分为8块扇形，计数2块扇形部分内菌落数分别为850、650，平均为750，总计6000，空载质粒转化效率计算如下：1µl5ng/µl 即5ng 的质粒加入2号100µl 感受态细胞EP 管中，取50µl 加入LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀涂布平板，第二天记录蓝色菌落共计6000，此时转化效率=6000cfu/110050 5ng=2.4×103cfu/ng=2.4×106cfu/µg 质粒（2）在超净工作台中，从样品组-100µl 中用牙签挑取白色阳性菌落接种于400µl LB-amp 培养基中，挑选4个菌落，分别接种于1号、2号、3号、4号试管中，于37℃振荡摇菌5hr 。
（3）配制10µl 反应体系，进行PCR 。
10µl 反应体系如下：菌液 DNA 2 µl 引物1（10 µM) 0.4 µl 引物2（10 µM) 0.4 µl 2 ×PCR Reaction Mix 5 µl Taq 聚合酶（2.5 U/µl ） 0.2 µl 超纯水 2 µl由于全班共配置100个反应体系，每组50µl ，从老师处领取后，自行分装8µl/管，分别标号1、2、3、4，再对应上午振荡培养的1号、2号、3号、4号菌液培养EP 管并从中取出2µl 作模板加入，后进行PCR 反应。
PCR 反应条件如下：94 ℃变性3 min ；94 ℃ 30 sec ，60℃ 30 sec ，72 ℃ 1 min ，30 个循环； 72 ℃ 10 min 。
（4）电泳：桌面薄膜依次点上marker 及1、2、3、4号PCR 产物各4µl ，再分别加入1µl SYBR Gold ，充分混匀，于1%琼脂糖凝胶中点样电泳。
（5）电泳完毕，取出凝胶，在紫外灯下观察染色后的电泳胶板，于凝胶成像系统中拍照并保存之，电泳照片如下图五所示：bp20001000750500250100图五：菌落PCR产物电泳示意图由上图可以看出，1、2、3、4号重组白色菌落PCR产物条带均在600bp左右，证明转化成功。
（6）随机从1号、2号、3号、4号菌液培养EP管中选取1号、2号，将菌液倒入1号、2号3ml LB-amp培养管中，37℃摇床过夜培养。
Ⅲ10月26号（1）质粒提取：1.取出过夜培养15hr的1号、2号试管，分别从中取1.5ml 的菌液加入1号、2号EP 管，于室温下10，000 xg离心1min 以沉淀菌种，由于菌液超过3ml，本实验步骤重复2次。
2.倒出培养基，往沉淀中加入250 µl SolutionⅠ/ RNaseA 混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮。
3.往重悬混和液中加入250 µl Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀7次。
避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA 断裂而使得到的质粒纯度降低。
4.往上述混和液中加入350 µl Solution III ，温和地上下颠倒离心管数次混匀，直至形成白色絮狀沉淀。
室温下，13，000 x g 离心10min.。
（提高离心速度有利于沉淀贴壁更加紧密）5.取两干净的HiBind ® Mini Columns (I) 各装在一个2 ml 收集试管上。
小心转移上清液至柱內，室温下10，000 x g 离心 1 min ，使裂解液完全流过柱子。
弃去收集管中的过滤液。
6.把柱子套在5所用的收集管上，加入500 µl Buffer HB 到柱子中，室温下10，000 xg 离心1min 洗涤柱子，除去残余的蛋白质。
7.弃去收集管中的滤液，加入700 µl DNA Wash Buffer ( 用无水乙醇稀释) 至柱子，室温10，000 x g离心1min ，弃去洗涤液。
