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临床研究用人间充质干细胞质量评价一、引言人间充质干细胞（MSCs）由于其多向分化潜能、免疫调节特性以及易于体外培养等特点，被广泛用于临床研究。
在众多疾病的治疗中，MSCs 都展现出了巨大的潜力。
然而，要确保其在临床研究中的有效性，首先需要对MSCs的质量进行严格控制和评价。
本文将探讨如何评价临床研究用MSCs的质量。
二、MSCs的质量评价标准1、细胞的纯度和活性：这是MSCs质量评价的核心指标。
纯度是指MSCs中目标细胞的比例，而活性则是指MSCs的增殖能力和分化能力。
2、细胞的遗传稳定性：通过基因测序等方法，可以检测MSCs是否存在基因突变，以及是否存在潜在的致癌风险。
3、细胞的免疫调节特性：MSCs具有免疫调节特性，可以通过抑制免疫反应来降低排斥反应的风险。
因此，评价MSCs的免疫调节特性也是非常重要的。
4、细胞的来源和生产过程：MSCs的来源和生产过程也会对其质量产生影响。
例如，来自患者的自身MSCs可能比来自捐献者的MSCs更适合用于治疗。
同时，生产过程中的质量控制，如无菌操作、细胞培养基的质量等，也会影响MSCs的质量。
三、MSCs质量评价的方法1、细胞形态观察：通过观察MSCs的形态，可以初步判断其是否具有正常的形态学特征。
2、生长曲线测定：通过绘制MSCs的生长曲线，可以评估其增殖能力。
3、细胞表面标志物检测：通过检测细胞表面标志物，可以确定MSCs 的纯度和活性。
4、染色体核型分析：通过染色体核型分析，可以评估MSCs的遗传稳定性。
5、免疫调节特性检测：通过检测MSCs对免疫反应的调节作用，可以评估其免疫调节特性。
6、生产过程质量控制：通过监控生产过程中的关键控制点，可以确保MSCs的生产过程符合质量标准。
四、结论人间充质干细胞（MSCs）在临床研究中的应用前景广阔，但其质量评价是关键环节。
通过对MSCs的纯度、活性、遗传稳定性、免疫调节特性以及生产过程的质量控制等多方面的评价，可以确保其满足临床研究的需求。
骨髓间充质干细胞研究与应用概况于雷;高俊玲【摘要】骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal cells,BMSCs)是当下热点研究对象之一。
1867年德国病理学家Cohnheim教授[1]在研究创口愈合过程中发现骨髓中存在一种非造血系统的多潜能细胞,但研究因为条件原因未能深入。
后来有研究者[2]在20世纪60年代开展一系列开创性研究,发现从骨髓中分离得到长梭状、成纤维细胞样的细胞群,在塑料培养皿中呈集落样贴壁生长;1987年,又发现这种骨髓单核细胞可在一定的条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。
培养增殖二十代后仍保有其多向分化的潜能。
于是把这种多能细胞称为间充质干细胞(mesenchyma stem cell,MSC)。
【期刊名称】《华北理工大学学报：医学版》【年(卷),期】2018(020)002【总页数】5页(P164-168)【关键词】骨髓间充质干细胞;肺纤维化;缺血性脑卒中【作者】于雷;高俊玲【作者单位】[1]华北理工大学基础医学院,河北唐山063000;[1]华北理工大学基础医学院,河北唐山063000;【正文语种】中文【中图分类】R329.2骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal cells，BMSCs)是当下热点研究对象之一。
1867年德国病理学家Cohnheim教授[1]在研究创口愈合过程中发现骨髓中存在一种非造血系统的多潜能细胞，但研究因为条件原因未能深入。
后来有研究者[2]在20世纪60年代开展一系列开创性研究，发现从骨髓中分离得到长梭状、成纤维细胞样的细胞群，在塑料培养皿中呈集落样贴壁生长；1987年，又发现这种骨髓单核细胞可在一定的条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。
培养增殖二十代后仍保有其多向分化的潜能。
于是把这种多能细胞称为间充质干细胞(mesenchyma stem cell，MSC)。
保密级别：内部学位级别：基础医学学历硕士论文提交日期：2003年6月8日论文答辩日期：2003年6月6日论文中文题目：人骨髓间充质干细胞的分离与培养论文英文题目：Isolation and Cultivation of the Human bone Marrow Mesenchymal Stem Cells作者及所在单位：赵东海，吉林大学基础医学院病理教研室指导老师及所在单位：李玉林，吉林大学分繻标识：R329.28中文主题标识：间充质干细胞骨髓培养的低绖DMEM 纤维连接素英文主题标识：Mesenchymal Stem Cell, bone marrow , culture, DMEM with low glucose , fibronectin总页数：共 44页开本是否有图、表：有表，有图论文分繻号 R329.28 单 位 代 码 10183密级内部研究生学号********吉林大学硕士学位论文人骨髓间充质干细胞的分离与培养Isolation and Cultivation of the Human boneMarrow Mesenchymal Stem Cells作者姓名：赵东海专业：病理学与病理生理学导师姓名：李玉林及职称：教授论文起止年月：2000年9月至2003年4月中文摘要人骨髓间充质干细胞的分离培养赵东海专业：病理学与病理生理学指导教师：李玉林骨髓中主要有两种细胞绻统：造血干细胞绻统和基质细胞绻统（基质细胞滛指间充质来源的非造血干细胞）。
基质细胞绻统是指骨髓腔内为造血绻统提供结构及功能支持的结缔组织，可保持自我更新的能力，能够分化为各种结缔组织踱绻的细胞。
骨髓基质绻统中含有的骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的干细胞，它可以向多种结缔组织及部分来源于外胚幂的组织分化，形成骨、软骨、骨骼肌、肌腱、韧带、真皮、脂肪、骨髓基质和神经，利用它进行组织工程学研究有如下优势：①取材方便且对机体无害，自体骨髓穿刺即可获得；②由于MSCs取自自体，由它诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥的问题；③由MSCs分化的组织繻型广滛，理论上它能分化为所有的间充质组织繻型。
骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性的研究进展邴爱英宋文刚(泰山医学院 , 山东泰安 271016关键词 :骨髓间充质干细胞 ; 分离培养 ; 生物学特性中图分类号 :R392文献标识码 :A 文章编号 :1004-7115(2011 07-0549-04骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells , BMSCs 亦称骨髓基质干细胞 (bone mar-row stromal cells , BMSCs , 是主要存在于机体骨髓腔中的一种干细胞 , 在一定的诱导条件下 , 可分化为多种胚层细胞 [1－2], 更重要的是骨髓间充质干细胞具有较强的免疫调节功能 , 进行异体移植时可避免免疫排斥反应 [3], 故对骨髓间充质干细胞的研究越来越受到广泛的关注。
20世纪 70年代中期 , Friedenstein 等首次报道 , 骨髓标本中小部分贴壁细胞在培养过程中能够分化形成类似骨、软骨的集落 , 并将之称为骨髓多能间充质干细胞 (marrow pluripotent stromal cells , 又称 BMSCs 。
1997年 , Prockop 成功分离出BMSCs , 发现其具有多向分化潜能 , 可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经样细胞和成肌细胞等。
近年来 , 人们在研究中建立了人、猴、兔、大鼠等不同种属 BMSCs 的培养体系 , 其取材部位及方式等各有不同。
1骨髓间充质干细胞的分离与培养BMSCS 的含量很低 , 约占骨髓有核细胞的 0. 001% 0. 010%左右 , 并且随着年龄增长递减 , 要利用 BMSCS 就必须实现 BMSCS 的体外分离培养和扩增。
目前对骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养还没有统一的方法 , 现在较为常用的分离方法主要有 :贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪和免疫磁珠分离法。
前两种方法获得的骨髓间充质干细胞成分复杂 , 纯度不够高。
而用流式细胞仪和免疫磁珠分离技术虽然可获得高纯度的骨髓间充质干细胞 , 但对细胞活性和分化能力有较大影响 , 而且实验条件要求高 , 需要骨髓量较大。
目前最常用的是贴壁筛选法与密度梯度离心法相结合的方法 , 既可以增加分离 BMSCs 的纯度 , 又避免影响 BMSCs 的活性 , 而且操作简便 , 成本不高 [4]。
1．1贴壁筛选法贴壁筛选法是骨髓间充质干细胞最初的分离培养方法 , 是由Friedenstein 在 19世纪 70年代中期建立的。
它是根据 BMSCs 在塑料培养瓶中贴壁生长的特性 , 通过定期换液除去不贴壁细胞 , 从而达到分离、纯化 BMSCs 的目的。
Frieden-stein 等的工作创建了一种体外分离和培养的简便可行的方法。
至今该方法仍是一种得到广泛应用的经典途径。
1．2密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。
梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同 , 使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞 , 再进行贴壁培养 , 从而达到分离、纯化 BMSCs 的目的。
Pittenger 等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到 95%。
1．3流式细胞仪和免疫磁珠法常用方法为免疫磁珠法 , 是利用免疫学的技术分离 BMSCS , 分离细 945泰山医学院学报JOURNAL OF TAISHAN MEDICAL COLLEGE Vol. 32No. 72011*基金项目 :国家自然科学基金项目 (30872322 。
山东省自然科学基金项目 (2009ZRB01841 。
泰山医学院科研计划课题 (20092RQN019 。
作者简介 :邴爱英 (1977— , 女 , 山东即墨人 , 讲师 , 硕士 , 主要从事医学免疫学实验教学和研究工作。
胞的纯度高。
Phinney [5]用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来 , 提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法 , 但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记 ; 而且 , 这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响 , 造成 BMSCS 损伤 , 出现增殖缓慢等问题 , 这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。
因此 , 如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。
1．4BMSCs 的培养、扩增最常用的是 LG-DMEM 培养基 , 含体积分数 10% 20%的胎牛血清 , 其中体积分数 10%的胎牛血清最有利于 BMSCs 的贴壁、扩增及多系潜能的维持 , 体积分数过高时 , 血清中含有大量促进细胞增殖分化的因子 , 容易使细胞过早出现老化。
但如果 BMSCS 要应用于临床治疗 , 则 BMSCS 应尽量避免和胎牛血清或新生牛血清的接触 , 以避免污染疯牛病毒和异体蛋白增加的过敏风险。
目前已有多项研究使用脐带血血清或人自体血清替代胎牛血清用于BMSCs 的培养 , 这样既可以避免上述风险 , 又因此类血清中含多种细胞因子 , 可促进 BMSCs 的增殖、分化 , 因此为临床提供了一种安全有效的培养方法。
此外 , 种植密度、氧体积分数及细胞因子都对 BMSCs 的培养有一定影响 , Lennon 等认为低密度种植有益于细胞扩增 , 氧体积分数低于 20%有利于干细胞功能的存留 , 血小板衍生生长因子、碱性成纤维细胞生长因子亦有较强的促进增殖作用。
2骨髓间充质干细胞的生物学特性骨髓基质是骨髓腔中为造血干细胞提供结构和功能支持的结缔组织 , 由基质细胞和细胞间基质构成。
BMSCS 主要有如下特性 :①形态学特征 ; ②具有自我复制、增殖能力 ; ③间充质干细胞的表面抗原标记 ; ④具有多向分化的能力。
2．1骨髓间充质干细胞的形态学特征体外培养的 BMSCS 体积小 , 成梭形或多角形 , 核浆比大 , 多为平行排列生长或漩涡状生长 , 部分贴壁细胞可以快速形成集落 , 一些呈典型的纺锤形样的BMSCS 增殖迅速 , 形态均一。
细胞传代后 , 传代细胞较原代细胞的贴壁速度快 , 细胞传到第 3代时 , 细胞形态比较一致。
在光镜和相差显微镜下 , BMSCS 为长梭形 , 类似成纤维细胞外观。
透射电镜下 BMSCS 可表现为两种不同的形态结构类型 :一种是处于相对静息状态的细胞 ,核较大 , 核质比大 , 胞质内细胞器少 ; 另一种是处于相对活跃期细胞 , 细胞体积大于前者 , 核不规则 , 含 2 3个核仁 , 核质比小 , 胞质中有丰富的细胞器。
2．2骨髓间充质干细胞自我复制、增殖能力BMSCS 在体外培养条件下生长与其它细胞一样 , 经历生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期。
对细胞周期的研究显示 , 只有 10%的 BMSCS 复制活跃 , 而大多数细胞处于 G/G1期 , 高比例的 G 0/G 1期细胞暗示 BMSCS 具有高度的分化潜能 [6]。
BM-SCS 能在体外多次传代仍保留其染色体核型和端粒酶活性。
Conget 等对培养条件下 BMSCS 的生长增殖进行了实验 , 发现成体 BMSCS 可以在体外分裂 (38ʃ 4 次 , 并且保持纺锤形态和成骨潜能直至细胞衰竭。
细胞进行冷冻复苏后培养可传代达 15次 , 细胞的增殖分化潜能未受影响。
作为组织工程种子细胞 , 必须携带正常且完整的遗传信息 , 多次传代后这些遗传信息没有改变。
2．3骨髓间充质干细胞的表面标记与造血干细胞不同 , BMSCS 的表面抗原并没有确定。
已有数个抗体被用来鉴定 BMSCS , Stro-1阳性细胞具有多向分化能力 , 但是 Hung 等的研究提示体外扩增的 Stro-1阴性的骨髓间充质干细胞同样具有多向分化能力。
单克隆抗体 SH2和 SH3被认为是对人 BMSCS 比较特异的标记 , SH2抗体认为是对应于细胞表面的 CD105抗原决定簇 , SH3抗体对应于 CD73。
但是在 Lee 研究中 , 分离获得的BMSCS 具有典型的自我增殖和多向分化特性 , 但 CD105标记都为阴性。
至今仍没有特异的标记物来鉴定 BM-SCS 类细胞 , 比较一致的看法是 , 对于所分离的 BM-SCS 进行其表面抗原检测的意义 , 仅仅在于判断所获得的细胞的纯度或均一性 , 或是初步判断其为不同于骨髓造血干细胞的一类细胞 , 即骨髓间充质干细胞 [7]。
2．4骨髓间充质干细胞的多向分化大量的体内外实验证明 , BMSCS 具有多向分化055泰山医学院学报 JOURNAL OF TAISHAN MEDICAL COLLEGE Vol. 32No. 72011潜能 , 在不同的微环境下可向不同的组织细胞分化。
比如 , 在培养基中加入适量的 DXM 、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸可诱导 BMSCS 向成骨细胞分化 [8]; 而加入适量的 DXM 、人胰岛素、 1-甲基 -3-异丁基黄嘌呤、消炎痛等可诱导BMSCS 向脂肪细胞分化 [9]; 另外 , 在特定的微环境下尚可诱导 BMSCS 向成软骨细胞、平滑肌细胞、星形胶质细胞、神经细胞、肝细胞、血管内皮细胞和心肌细胞等三个胚层的组织细胞分化 [10－12]。
但是诱导分化出的细胞在体内是否能有效的归巢到特定部位 , 并发挥有效的生理功能尚待更多的证据进一步研究。
3骨髓间充质干细胞的鉴定BMSCs 的鉴定问题是目前的难点之一 , 其原因主要在于对 BMSCs 的特异性表面标记物仍存在争议。
在体外 BMSCs 以易于贴附于塑料培养板为特征 , 未分化的基质细胞呈梭形或成纤维细胞形。
通常采用其特征性的形态以及分化为其它基质细胞系的功能来鉴定。
国际间充质及组织干细胞委员会于 2006年对人来源 MSCs 实验研究提出三条最低鉴定标准 [13]:①在标准培养条件下 , MSCs 必须具备对塑料底物的贴附特性 ;②通过流式细胞仪检测 , MSCs 群体表达 CD105、 CD73及 CD90阳性率≥ 95%, 且 CD45、 CD34、 CD14或 CD11b 、 CD79a 或 CD19、 HLA-DR 阳性率表达≤2%; ③经体外诱导 , MSCs 必须能向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化。
比较公认的鉴定标志是 BMSCs 既不表达造血细胞表面抗原 CD34、 CD45、CD14、 CD38, 也不表达淋巴细胞表面抗原 CD11a 、 CD11b , 但表达许多粘附分子 CD44、 CD166、 CD29等 , 同时表达一些基质细胞表面抗原 CD105(SH2 、CD73(SH3、 SH4 以及一些细胞因子受体 IL-1R 、 IFN-γR 、 TNF-α, BMSCs 表达HLA-Ⅰ类抗原 , 基本不表达 HLA-Ⅱ类抗原 [14－17]。
