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从植物分离产紫杉醇的内生真菌的研究

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1999年2月第29卷第1期 西北大学学报(自然科学版)Jou rnal of N o rthw est U n iversity (N atu ral Science Editi on ) Feb .1999V o l .29N o.1　0收稿日期:1998205220 资金来源:陕西省自然科学基金资助项目(FH 95401) 作者简介:马天有(19682),男,硕士从植物分离产紫杉醇的内生真菌的研究0马天有　董兆麟(西北大学生物学系,西安,710069)摘　要　将生于秦岭地区的中国红豆杉树皮中分离得到的一株内生真菌,在马铃薯培养基中进行发酵试验,用薄层层析、薄层扫描检测。

分析结果表明这株真菌能合成紫杉醇,高效液相色谱技术测定其紫杉醇含量约为14120Λg L 。

关键词　中国红豆杉;内生真菌;紫杉醇;薄层层析;高效液相色谱分类号　Q 93915 文献标识码　A 论文编号　10002274 (1999)0120047249 紫杉醇(taxo l )是人类70年代初从短叶红豆杉(tax us bren if olia nu tt )[1]树皮中分离提取到的一种二萜衍生物。

后经Ho rw itz 等研究证实紫杉醇具有独特的抗癌作用机理,它能使癌细胞内纺锤丝的形成受到抑制,有丝分裂不能正常进行,而阻止了癌细胞的扩散。

故1992年被美国FAD 批准用于卵巢癌的治疗。

后又经多年的研究和临床实验,使紫杉醇的抗癌范围逐渐在扩大,目前进行的乳腺癌、肺癌的临床试验已取得很好的效果。

目前紫杉醇主要是从红豆杉树皮中提取的。

由于红豆杉属于濒危珍稀植物,资源有限,生长又很慢,大量砍伐不但危及到自然界的生态平衡,而且也会带来紫杉醇原料的枯竭。

因此,寻找紫杉醇未来新的生产途径,已成为摆在人类面前的一项重大研究课题。

近年来国内外学者主要从3个领域进行探索,即化学合成法、植物细胞培养法[2]和微生物工程法[3]。

目前人们普遍认为微生物工程法是一种最具潜在能力,最具可能性的一种方法[4]。

本文正是采用微生物工程技术,研究从我国秦岭地区生长的红豆杉树皮中,分离产紫杉醇的内生真菌的方法和结果。

1　材料和方法111　材料来源中国红豆杉(tax us chnesis )来源于陕西省留坝县庙台子地区为几十年生的老树。

紫杉醇标准品购自Sigm a 公司。

112　实验用培养基固体培养基:马铃薯200g ,葡萄糖20g ,琼脂20g ,水1000mL ,pH 自然。

配制方法是马铃薯去皮切碎,水煮40m in ,4层纱布过滤,溶入葡萄糖及琼脂后加水定容。

1105kg c m 2灭菌20m in 。

液体培养基:配制方法同上,只是不加入琼脂,分装至250mL 三角瓶中,每瓶50mL 。

1105kg c m 2灭菌20m in 备用。

113　内生真菌的分离和纯化取新采的红豆杉树皮,除去外层老化部分,切成1c m ×1c m 的小块,置于75%的酒精中消毒5m in ,用无菌水冲洗后置于马铃薯固体平板培养基上,25℃培养一段时间后周围长出少量菌丝。

用接种针挑取不同部位的边缘菌丝,分别接种到固体平板上培养,长出新的菌落后,再挑取其尖端菌丝培养,如此反复纯化多次后即可得到一个纯菌株。

114　真菌培养物的预处理及样品溶液的制备用马铃薯液体培养基,250mL 三角瓶中装50mL 培养液,接少量菌丝,30℃,220r m in ,培养6～7d 。

培养物冷冻后用组织捣碎机匀浆3m in (转速为10000r m in ),4层纱布过滤,滤液中加入等体积的氯仿和甲醇混合液(CHC l 32M eO H 10∶1),充分振荡后静置8～12h ,收集有机溶液相,并在45℃条件下减压蒸发,残留物溶于1mL 甲醇中作为样品溶液备用。

115　薄层层析及薄层扫描对真菌培养物紫杉醇的 检测 制备薄层板的硅胶G 购自青岛海洋化工厂,选用的3种展开剂为二氯甲烷2甲醇(95∶5V V );乙酸乙脂2异丙醇(94∶6V V );氯仿2乙腈(9∶1V V )[3]。

显色剂为5%的香草醛浓硫酸溶液。

用喷雾显色法,100℃显色,获最清晰斑点为止。

对出现与标准品有相同迁移率的薄层板进行扫描,扫描条件如下:反射式锯齿形扫描,狭缝为112mm ×1.2mm ,线性参数S x =3,峰检出方式为面积法,灵敏度中,对标准品斑点扫描确定其测定波长为520nm 。

对同一斑点连续扫描4次,取其平均值,可初步估算样品溶液中紫杉醇的含量。

116　高效液相色谱对真菌培养物中紫杉醇含量的 检测 H PL C 色谱仪:B ackm an Go ld H PL C sys 2tem ;检测仪:紫外检测仪。

H PL C 条件:C 218反相柱,415mm ×200mm ,等浓度洗脱;流动相M eO H :H 2O =65∶35,流速1mL m in ;检测波长220nm ;进样量20ΛL 。

2　结　果211　产紫杉醇内生真菌的分离从选用的中国红豆杉树皮中分离出20多株真菌菌株。

薄层层析法分析结果显示,仅有编号为Q T 12的一株内生真菌出现了与标准品迁移率相同的斑点(图1)。

以Q T 12为实验菌株进行形态观察和检测。

212　内生真菌QT 12的生长及形态特征Q T 12菌株的菌丝体为白色,菌丝较细,有横隔,菌丝多分枝,孢子呈短杆状,表面光滑(图2)。

Q T 12在马铃薯固体培养基上生长较快,一般4～5d 可长满直径9c m 的培养皿,菌落表面呈白色,质地呈棉絮状,中间部分形成突起并在周围形成同心环。

213　高效液相色谱测定采用高效液相色谱系统对Q T 12样品溶液进行检测,结果如图3,4所示。

由图3,4可见,样品中峰 与标准品中峰 的保留时间一致,即t R =15.43m in 可判断样品中峰 为紫杉醇的吸收峰。

根据峰 的积分面积计算得出样品中紫杉醇的含量,再根据发酵液总量可计算出Q T 12菌株液体培养物中紫杉醇含量约1412Λg图1　Q T 12内生真菌F ig .1　T he Endophytic Fungu s Q T 12展开剂为二氯甲烷2甲醇(95∶5V V ) 展开剂为乙酸乙脂2异丙醇(96∶4V V )展开剂为氯仿2乙腈(9∶1V V )图2　内生真菌Q T 12的菌丝F ig .2　T he H yphal Cell of the Endophytic Fungu s Q T 12图3　紫杉醇标准品H PL C 图谱F ig .3　Ch rom atogram of H PL C of the T axo l—84— 西北大学学报(自然科学版) 第29卷　图4　Q T 12菌株H PL C 图谱F ig .4　Ch rom atogram of H PL C of Endophytic Fungu s Q T 123　讨　论利用内生真菌来合成紫杉醇是近年来才开展的紫杉醇资源研究的方法之一,尚处于研究的初级阶段。

该项研究的两个关键性问题就是能合成紫杉醇的内生真菌的分离和培养物中紫杉醇产量的提高。

目前这方面的研究还比较少,但是利用内生真菌生产紫杉醇有以下的优点:①真菌一般比生长速率高;②能在简单培养基上生长,易于获得大量培养物;③可在生物反应器中大规模培养,培养条件相对易于控制和掌握等。

本实验是对建立产紫杉醇内生真菌的初筛方法的初步研究,从分离测定的结果看,Q T 12内生真菌合成紫杉醇的量很少,有待于利用现代微生物技术诱变育种及加入紫杉醇的前体物质等方法来提高其产量。

参考文献1　陈毓亨,程克棣1近年来国外紫杉醇资源研究进展1国外医学:药学分册,1994,21(1):36～392　甘烦远,郑光植1红豆杉的细胞工程学研究进展1国外医学:植物药分册,1994,9(4):156～1593　邱德有,黄美娟,朱至清1一株云南红豆杉内生真菌的分离1真菌学报,1984,13(4):314～3164　Stierle A ,Strobei G ,Stierle D .T axo l and taxane p roducti on by T axom yces and reanal ,an endophytic fangu s of paciti 2cyew comm en ts.Science ,1993,260:214～216(编　辑　张银玲)The Study of Isolati ng Endophytic FungusSyn thesiz i ng Taxol from Plan tM A T ianyou DON G Zhao lin(D epartm en t of B i o logy ,N o rthw est U n iversity ,X i ′an ,710069)Abstract A strain of endop hytic fungu s w as iso lated from the taxu s Ch inen sis in the Q in ling m oun tain s .It w as cu ltu red in the liqu id po tato m edium .B y m ean s of the th in layer ch rom atagrap hy ,TL C Scanner ,the cu ltu res w as analyzed and determ ined .T he resu lt show s th is strain of fungu s can p roduce taxo l .T he con ten t of taxo l in the fungu s w h ich w as determ ined by H PL C w as abou t 14.2Λg L .Keywords T axu s Ch inen sis ;Endop hytic fungu s ;T axo l ;T h in layer ch rom atgrap hy ;H PL C—94—　第1期 马天有等:从植物分离产紫杉醇的内生真菌的研究 。

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微生物发酵生产紫杉醇研究进展

微生物发酵生产紫杉醇研究进展

微生物发酵生产紫杉醇研究进展摘要：综述了微生物发酵生产紫杉醇的主要研究进展，包括产紫杉醇的内生真菌的生物多样性、真菌细胞发酵生产紫杉醇的优势，同时也对如何改良内生真菌菌种性能和优化培养基组成及培养条件以提升其产紫杉醇的能力，作出了较为全面的综述。

关键字：紫杉醇，微生物发酵，内生菌，产量前言：目前国外市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮中提炼和人工合成方法，目前并未见有第三种形式形成大规模产业化制作的报道。

紫杉醇的生产受着原材料与科技二个方面的约束，短期内无法突破。

为克服红豆杉资源匮乏和紫杉醇需要量的日益扩大的问题，人类对生产紫杉醇开展了多种多样的科学研究，涉及化学全合成、植物细胞培养、微生物转化和微生物发酵。

微生物发酵法生产紫杉醇由于具备突出优点，其研制与发展日益引起中外科研学者的普遍重视。

一、紫杉醇产生菌的研究进展（一）产紫杉醇的内生真菌的种类Stierle和Strobel等首次从短叶红豆杉的树枝上分离出一个可以形成紫杉醇的内生真菌，命名为安德列亚霉[1]。

当时这一发现对于紫杉醇的药源研究是一次重要的突破，为开发紫杉醇的物源提出了一个崭新的途径。

此后，各地研究者相继进行对产紫杉醇的内生真菌的分离操作，先后在西藏红豆杉、云南省红豆杉、东北地区红豆杉、欧洲红豆杉和中国红豆杉中分离到能形成紫杉醇的内生真菌，其寄主植被基本包括红豆杉属下的所有种类。

在国外的树木中，科学家也分离出来到了可形成紫杉醇的内生真菌。

Li等在不同种类的秃柏的韧皮部和木材部中均分离出能形成紫杉醇的内生真菌[2]。

GA等18人在同一种松树中分离出产紫杉醇的内生真菌。

这表明，产紫杉醇的内生真菌不但存在于红豆杉属植被中，在某些非红豆杉属植被中也存在，他的研究结果更拓宽了产紫杉醇的内生真菌的研究范畴。

（二）真菌发酵制备紫杉醇的优越性与过去在红豆杉植株的树皮上获得的紫杉醇比较，由内生真菌发酵制备紫杉醇有着更多的优越性，微生物发酵方法具有以下特点：（1）微生物发酵的方法易扩大化，有利于工业化生产的落地实施；（2）微生物易于通过诱变育种等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量，微生物育种及选育速度明显高于植物细胞株；（3）内生真菌生长迅速，在简单培养基中便可大量繁殖，形成丰富的发酵活性性质；（4）内生真菌在生物反应器中生长时，可人为调节各项发酵参数，使代谢路径朝着有利于紫杉醇的生产及高浓度紫杉醇的积累的方向进行。

紫杉醇产生菌分离的研究

紫杉醇产生菌分离的研究


ｔａｘｏｌ［Ｊ］Ｎａｔｕｒｅ，１９７９．２７７：６６５～６６７．
１９７１．９３：２３２５—２北７
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【８］ＳｌｌｃｈｅｎｍｙｅｒＷ Ｊ＆ＨｏｆｆＤＤＶ．Ｔａｘｏｌ：Ａｆｌｅｗ
ｃ…ｅｆ
ｄｒＩ】ｇ【ｊ）Ａｎｔｉ－ＣａｎｃｅｒＤｒａｇｓ．１９９１，２１６）：５１９～５３ｆｉ
文献 １ｋｏ”ＦＨ
ａｎｄｒｃａｎａｅ．ｍ
ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｐａｃｉｆｉｃ
ｙｅｗ［ｓ］
ｙｅｗ－Ｔａｘｕｓ
Ｓｃｉ衄ｃｅ．１９９３．２６０：２１４～２１６ Ｉｔ０ ｌ ｓｔｍｔ七ｌ Ｇ Ａ，Ｓｔｉｅｒｌｅ九Ｈｅｓｓ Ｗ Ｍ，Ｔａｘｄ ｔｏｒｍａｔｉｏａ 【Ｊ】．ＰｌａｎｔＳｃｉ，１９９３．９２：１—１２
究报道。
２．３因为这些菌株均经无红豆杉枝叶浸汁的培养 基连续传ｌＯ代后再进行发酵培养（发酵培养基中也 无该浸汁），所以其Ｔａｘｏｌ完全是来自于菌体的代谢 产物，而与原树木毫无关系。菌株的产Ｔａｘｏｌ水平
远高于Ｔａｘｏｍｙｃｅｓ ａｎｄｒｅａｎａｅ（Ｓｔｉｅｒｌｅ
ｅｔ
ａｌ
１９９３），也
参考
１１］中国科学院微哇物研究所（菌种保直手册）缩写组菌种保直手 册【Ｍ］北常：科学出版社，１９８０．１１４ 【２］吴ｉ吉，羲永乎红豆杉血巍成柯［Ｎ１．科技Ｂ报．１９９６．３．３０． ［３］邱榜有．黄美娟．方晓华等一种云南红豆杉内生真菌的分离 【Ｊ】．真茁学报。１９９４．１３（４）：３１４—３１６ ［４】 Ｊ，Ｓｈａｐｉｍ Ｆ ｅｔ ａＩ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔ柚ｔ
ｂｙ ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ ｖｉｄｅｏ
ｍｉｃｒｏｓｅｏｐｙ ｉｎ ｃａｉｘｃｅｒ【Ｊ】．Ｊ Ｃ蚰ｃ Ｒｅｓ ｏｆ
南方红豆杉产紫杉烷类化合物内生真菌的分离与遗传转化研究

南方红豆杉产紫杉烷类化合物内生真菌的分离与遗传转化研究

南方红豆杉产紫杉烷类化合物内生真菌的分离与遗传转化研究紫杉醇是一种二萜类的生物碱,最初从太平洋短叶红豆杉(Taxus brevifoliaNutt.)的树皮中分离到,研究发现紫杉醇对包括卵巢癌在内的多种癌症具有良好疗效。

由于紫杉醇在树皮中含量很低并且提取过程繁琐,因而价格昂贵,很大程度上限制了紫杉醇的应用。

随着紫杉醇的需求日益增长,紫杉醇的供求矛盾也日益突出,这促使人们尝试各种途径扩大紫杉醇的来源。

自从1993年Stierle首次从红豆杉树皮中分离得到一株产紫杉醇真菌Taxomyces andreanae以来,越来越多的产紫杉醇内生真菌被分离出来,这为人们通过微生物发酵大规模工业生产紫杉醇提供了可能。

本研究从安徽石台县仙寓山一株百年野生南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)树皮中,分离得到一株产紫杉醇重要前体物质巴卡亭Ⅲ的内生真菌。

经过形态学和分子生物学鉴定,将该真菌鉴定为拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis sp.),并命名为TL9。

通过单因素和4因素3水平正交实验确定了该真菌的最佳碳源和氮源,进而优化真菌的发酵培养基。

以分离得到的真菌为材料,根据南方红豆杉紫杉醇合成途径关键酶10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10p-乙酰转移酶(DBAT)的基因dbat的序列(AY365031.2)设计引物,同源克隆得到一段长为706bp的片断,经BLAST序列比对确认为真菌dbat基因的核心片断,然后通过反向PCR技术,扩增得到一段长为753bp的片断,经过序列分析后与核心片断进行拼接,得到一段长为1281bp的片断。

序列比对显示该片段与红豆杉植物dbat基因相似度达到97%,因此确认为真菌dbat基因的核心片断。

以真菌TL9为材料,测定真菌的生长曲线,确定处于对数生长期中期(约4天左右)为制备原生质体的最佳时间。

通过选择合适的酶,调整酶的作用温度和作用时间,优化原生质体的制备流程。

真菌发酵法生物合成抗癌药物紫杉醇的研究

真菌发酵法生物合成抗癌药物紫杉醇的研究

真菌发酵法生物合成抗癌药物紫杉醇的研究真菌发酵法生物合成抗癌药物紫杉醇的研究一、引言癌症是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病之一，寻找有效的抗癌药物一直是医学和生物学领域的研究热点。

紫杉醇作为一种重要的抗癌药物，具有独特的作用机制和显著的临床疗效。

传统的紫杉醇提取方法主要依赖于从红豆杉属植物中提取，然而红豆杉生长缓慢，资源有限，这限制了紫杉醇的大量生产。

因此，探索新的紫杉醇生产方法具有重要的现实意义。

真菌发酵法生物合成紫杉醇作为一种有潜力的替代方法，受到了广泛的关注。

二、紫杉醇的结构与作用机制1. 紫杉醇的化学结构紫杉醇是一种复杂的二萜类化合物，其分子结构包含多个手性中心和独特的官能团。

它的基本结构由紫杉烷环和侧链组成，紫杉烷环是一个刚性的四环结构，侧链则连接在紫杉烷环的特定位置上。

这种复杂的结构赋予了紫杉醇独特的物理和化学性质。

2. 紫杉醇的抗癌作用机制紫杉醇主要通过促进微管蛋白聚合，抑制微管解聚，从而稳定微管结构来发挥抗癌作用。

在细胞分裂过程中，微管是构成纺锤体的重要成分，紫杉醇稳定微管的作用会导致纺锤体无法正常形成，进而阻断细胞的有丝分裂过程，使癌细胞停止增殖并最终死亡。

此外，紫杉醇还可能通过其他机制影响癌细胞的生物学行为，如调节细胞信号传导通路、诱导细胞凋亡等。

三、真菌发酵法生物合成紫杉醇的研究进展1. 产紫杉醇真菌的筛选与鉴定研究人员从自然界中广泛筛选能够产生紫杉醇的真菌。

通过对不同环境样本（如土壤、植物组织等）进行分离培养，然后利用高效液相色谱（HPLC）等分析方法检测培养物中是否含有紫杉醇。

经过大量的筛选工作，已经发现了一些能够产生紫杉醇的真菌菌株，如紫杉霉属（Taxomyces）、拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）等。

对这些产紫杉醇真菌进行准确的分类鉴定，有助于深入了解它们的生物学特性和代谢途径。

2. 真菌发酵条件的优化为了提高真菌发酵生产紫杉醇的产量，需要对发酵条件进行优化。