植物内生真菌的分离

1、PDA培养基（用于分离、培养植物内生真菌）：马铃薯（去皮）200g , 葡萄糖20g , 蒸馏水1000 ml , 琼脂粉15g。

用于分离内生真菌时在倒平板之前加入已过滤除菌的氯霉素和硫酸链霉素各50 µ g/ml，用于抑制细菌的生长。

2、NA培养基（用于分离、培养植物内生细菌）：牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。

用于分离内生细菌时在倒平板之前加入已过滤除菌的放线菌酮50µg/ml，用于抑制真菌生长。

115℃，20min 灭菌。

3、LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g 蒸馏水至1000 mL,pH=7.0；4、DSM1培养基：磷酸三钾26.631 g（pH=7.0)，二水柠檬酸三钠9.999 g，硫酸镁0.2465 g，硫酸铵19.821 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，胰蛋白胨10 g，葡萄糖1 g 蒸馏水至1000 mL，pH=7.0；5、DSM2培养基：磷酸三钾26.631 g（pH=7.0)，二水柠檬酸三钠9.999 g，硫酸镁0.2465 g，硫酸铵19.821 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，细菌学蛋白胨10 g，葡萄糖1 g 蒸馏水至1000 mL,pH=7.0；6、Msgg培养基：磷酸钾5 mmoL/L(pH7.0)，MOPs 100 mmoL/L（pH7.0），MgCl2 2 mmoL/L，CaCl2 700 mmoL/L，MnCl2 50 µM，FeCl3 50 µM，ZnCl2 1 µM，VB1 2 µM，甘油0.5 %，谷氨酸0.5 %，色氨酸50 µg/mL，苯丙氨酸50 µg/mL，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。

7、N%NA培养基：牛肉膏3.0 g，细菌学蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂粉N*10 g，8、BGM1培养基：牛肉膏3 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，磷酸三钾26.631 g（pH7.0），二水柠檬酸三钠9.999 g，硫酸镁0.2465 g，硫酸铵19.821 g，葡萄糖1 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。

商洛黄芩内生真菌分离鉴定及抗植物病原菌活性筛选摘要:采用组织分离法从健康黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)植株的根､茎､叶中分离获得36株内生真菌,经鉴定隶属于12属,链格霉属为优势属｡对峙试验结果显示,分离获得的内生菌中有31株对一种或多种植物病原菌有不同程度的抑制作用, 占分离菌的86%;有6株菌对一种或多种病原菌的抑菌率在75%以上,占分离菌的17%｡对这6株菌培养滤液的抑菌活性也进行了测定,结果表明对峙试验中产生抑菌带的菌株其培养滤液抑菌活性也高｡在6株筛选到的活性菌株中,SBF02和SBF06对棉立枯病菌抑制效果较好;SBF08和SBF27对苹果干腐病菌抑制效果较好; SBF11和SBF27对茄腐皮病镰孢霉抑制效果较好;SBF08和SBF32分别对烟草赤星病菌和草燕麦镰孢霉抑制效果较好｡关键词:黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi); 内生真菌;分离;抑菌活性Isolation of Endophytic Fungi from Scutellaria baicalensis Growing in Shangluo Region and Screening of Their Inhibitory Activities to Plant PathogensAbstract: Thirty-six strains of endophytic fungi were isolated from the roots,stems and leaves of healthy Scutellaria baicalensis Georgi with tissue method. They were identified as twelve fungal genera among which Alternaria was the dominant genus. The results of antagonistic cultivation indicated that thirty-one strains of endophytic fungi, accounting for 86% of all the isolates, could inhibit one plant pathogens or more to some extent; and the inhibitory activity of six strains, seventeen percent of total isolates; was significant at least to one plant pathogens, with the anti-bacterial ratio higher than 75%. Antimicrobial activity of six strains’s culture filtrates were also detected and presented that the strains producing inhibition band in antagonistic cultivation also showed remarkable inhibitory activity to indicative pathogens in the test of culture filtrates. Among six screened strains, SBF02 and SBF06 showed remarkable inhibitory activity to Rhizoctonia solani Kühn, SBF08 and SBF27 showed remarkable inhibitory activities to Botryosphae riadothidea, SBF11 and SBF27 showed remarkable inhibitory activities to Fusarium solani(Mart.), and SBF08 and SBF32 showed remarkable inhibitory activities to Alternaria alternata and Fusarium avenaceum respectively.Key words: Scutellaria baicalensis Georgi; endophytic fungi; isolation; inhibitory activity内生真菌普遍存在于健康植物各种组织､器官和细胞间隙内,与宿主之间建立了紧密的生态关系,产生的次生代谢产物对提高植物对各种生物和非生物胁迫的抵抗能力发挥着重要的作用｡因此,内生菌已成为筛选新型抗生素和其他生理活性物质的重要资源[1,2]｡尤其近年来随着人们对使用化学农药存在残留､容易引发抗性和再猖獗等隐患问题的深刻认识,从药用植物中分离筛选具有生防作用的内生菌以研发生物农药更是一个新兴的研究热点[3-5]｡黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)为唇形科植物,主要以其根部入药,现代医学研究表明,黄芩含有40多种活性成分,具有抗氧化､抗过敏､抗菌､抗病毒等多方面的功效[6]｡目前有关黄芩内生真菌抗菌活性的研究主要集中在对医学病原菌的抑制方面,而对植物病原菌的抑制研究很少｡由于不同地理环境和气候条件下内生真菌有一定差异,陕西商洛地区具有从北温带向南暖湿带过渡的地理和气候特征,黄芩是驰名的五大商药之一,但对商洛黄芩内生真菌的研究尚未见报道｡本实验对商洛黄芩内生真菌进行了分离鉴定,并测定了内生真菌对5种植物病原菌的抑菌活性,以期获得具有良好抑菌活性的菌株,为寻找新型抑菌物质和研发生物农药提供依据｡1 材料与方法1.1 材料1.1.1 植物材料分离内生菌所用植物材料为黄芩,于2009年8月采自商洛香菊药源基地,取健康植株的根､茎､叶组织样品,装入保鲜袋内带回实验室,4 ℃冷藏保存,2 d内样品处理完毕｡1.1.2 供试植物病原真菌选用以下5种植物病原菌为供试靶标菌:烟草赤星病菌(Alternaria alternata),苹果干腐病菌(Botryosphae riadothidea),棉立枯病菌(Rhizoctonia solani Kühn),茄腐皮病镰孢霉[Fusarium solani(Mart.)],草燕麦镰孢霉(Fusarium avenaceum)｡供试植物病原菌由陕西省微生物研究所提供｡1.1.3 培养基内生真菌的分离纯化以及靶标菌的培养采用PDA固体培养基;内生真菌的发酵用PDA液体培养基;内生菌的鉴定用查氏培养基和促孢培养基,促孢培养基配方如下:KH2PO4 1 g, KNO3 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g,KCl 0.5 g,淀粉0.2 g,葡萄糖0.2 g,蔗糖0.2 g,琼脂20 g,水1 000 mL, pH自然｡1.2 方法1.2.1 内生真菌的分离与纯化内生真菌分离采用组织块分离法[7,8]｡将新鲜黄芩的根､茎､叶用自来水冲洗干净,分别切成约0.5 cm的小段(片),每个部位选标样32块,无菌条件下按下列程序进行表面消毒:75%乙醇(15~20 s)→无菌水(3~4次)→0.1%的升汞(3~5 min)→无菌水(4~5次),叶等幼嫩组织处理时间稍短｡再于无菌条件下将上述表面消毒的样品切成0.2 cm长的小段或0.2 cm×0.2 cm的小片接种于含0.04%氯霉素的PDA平板上,置28 ℃恒温培养5 d 左右｡待组织块断面边缘长出菌丝后,根据菌落形态和颜色等的不同用接种针挑取尖端菌丝分别移至新的PDA培养基上,反复转接纯化,得到纯培养菌株,4 ℃保藏备用｡为了检验对材料表面消毒是否彻底,以消毒后不做任何切割的样品作为对照,于相同条件下培养,如对照平板无菌丝长出则证明表面消毒灭菌彻底,分离的真菌来自植物组织内部,否则分离结果无效｡1.2.2 内生真菌的形态观察与初步鉴定挑取在PDA培养基上纯化好的菌株尖端菌丝接种于查氏培养基和产孢培养基上,培养一段时间后观察菌落､菌丝体和孢子的形态特征,参考有关文献将分离的内生真菌鉴定到属[9-11]｡以点植培养法进行菌落观察和常规镜检:用接种针从斜面上取少量孢子,点植于平板上适当的位置,倒置平板于恒温箱中, 28 ℃培养4､7､10 d,观察菌落特征｡取少量菌丝,用乳酸石炭酸棉蓝染色液染色,进行常规镜检｡以插片法观察培养基内和气生菌丝:将真菌接种到平板上,插上灭菌盖玻片后培养,使真菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上｡观察时轻轻取出盖玻片置于载玻片上,直接观察｡以印片法观察孢子及菌丝体形态:将要观察的菌落先印在盖玻片上,放置于滴有少量乳酸石炭酸棉蓝染色液的载玻片上直接观察｡根据鉴定结果,计算内生真菌的分离率｡分离率=某一指定类型内生真菌株数/分离样品组织块总数×100%1.2.3 拮抗真菌的初步筛选拮抗真菌初步筛选采用对峙培养法[6,11]:在无菌条件下将内生真菌和供试病原菌活化好,用打孔器制成直径为0.5 cm的菌饼分别移至PDA平板上,二者相距2.5 cm,同时以只接病原菌的平板作对照,处理和对照均设3次重复,置于28 ℃下恒温避光培养｡观察记录对峙培养中病原菌菌落的生长和抑菌现象,测量菌丝扩展半径,根据抑菌率初步筛选出对病原菌生长具有抑制作用的内生真菌｡抑制率=(对照菌落半径-处理菌落对峙面半径)/对照菌落半径×100%1.2.4 初筛拮抗真菌培养滤液活性的测定1)摇瓶培养:将分离的拮抗作用较好的内生真菌在斜面培养基上活化,待生长旺盛后,在无菌条件下用直径为0.5 cm的打孔器沿菌落边缘打下10块菌饼,并用接种针挑取接种至含200 mL PDA液体培养基的500 mL锥形瓶中,28 ℃,120 r/min 恒温摇床振荡培养10 d后,无菌条件下过滤除去菌丝,滤液用于代谢产物活性的测定[12]｡2)活性测定:按生长速率法,取20 mL滤液与150 mL熔化的PDA培养基(50~60 ℃)混匀制成平板, 接种直径为0.5 cm的病原菌菌饼于平板上,以不加滤液的PDA平板作对照,每个处理重复3次, 28 ℃下静置培养5 d, 测量菌落直径, 同时观察对照情况,计算抑制百分率｡2 结果与分析2.1 商洛黄芩内生真菌的分离与鉴定结果从8月份采集的商洛黄芩的96个组织块中分离到36株内生真菌,总分离率为37.50%,其中根､茎､叶各分离到14､10､12株,分离率分别为43.75%､31.25%､37.50%｡分离菌株经鉴定隶属于12个属,根､茎､叶分别有8､4､5属,优势属为链格孢属,有12株,占总分离菌的33.33%(表1)｡总体看来,商洛黄芩中分布的内生真菌比较丰富,不同组织部位内生真菌的数量相差不大,但属种分布存在明显差异｡2.2 内生真菌对病原真菌的拮抗作用筛选结果对峙培养测试表明,商洛黄芩中存在丰富的抗菌活性菌株,分离的36株内生真菌中有31株对5种植物病原菌中至少1种有不同程度的拮抗作用,占总分离真菌的86.11%(表2)｡在活性菌株中,对苹果干腐病菌有抑制作用的菌株最多,有25株,占活性菌株总数的80.65%,且14株菌抑菌率在60%以上,其中从叶部分离到的菌株SBF27的抑菌率达82.36%｡对茄腐皮病镰孢霉､烟草赤星病菌､棉立枯病菌和草燕麦镰孢霉抑菌率在60%以上的菌株分别为12､10､8和7株,综合分析得知,36株分离菌中对至少1种病原菌的抑菌率在60%以上的菌株有21株,占总菌株数的58.33%｡对峙试验显示不同内生真菌对同一病原菌的抑制效果差异较大,以对苹果干腐病菌的抑制为例,SBF23对它的抑制率是15.31%,而SBF27对它的抑菌率达82.36%;同一内生真菌对不同病原菌的抑制程度也不相同,如菌株SBF02､SBF08和SBF32对5种病原菌都有较强的抑菌率,而其他菌株只对特定的病原菌产生较强的拮抗效应,拮抗作用因病原菌的不同表现出较大的差异｡可见内生真菌对病原真菌的拮抗作用具有一定选择性｡此外,从对峙试验中发现,内生菌对病原菌的抑制作用也有多种表现形式｡有的内生菌对病原菌产生抑菌带,在显微镜下可以看到病原菌菌丝出现萎缩､断裂p 2.3 初筛菌株培养滤液的活性测定结果测定结果表明,初筛得到的6株菌的培养滤液对5种病原真菌均有不同程度的抑制作用(表3),其中SBF02和SBF06对棉立枯病菌,SBF08和SBF27对苹果干腐病菌,SBF11和SBF27对茄腐皮病镰孢霉,SBF08和SBF32分别对烟草赤星菌和草燕麦镰孢霉的抑制率都在60%以上,抑菌活性最强的是SBF27对苹果干腐病菌的抑制,抑制率为71.37%｡观察发现,培养滤液抑菌活性较高的一般都使病原菌菌落长势变慢,气生菌丝减少,显微镜下可见菌丝变短,末端膨大且少有分枝｡而对照菌丝生长正常,菌丝粗壮,分枝较多且有大量分生孢子产生｡通过比较培养滤液抑菌活性测定和对峙培养的结果发现,培养滤液抑菌活性较高的菌株原来在对峙培养中抑菌率也高且有抑菌带产生,如菌株SBF08对苹果干腐病菌的抑制等,说明这些菌株对相应病原菌的抑菌活性物质是分泌到菌丝外的｡但同时也发现,有些在对峙培养中抑菌率较高但无抑菌带产生的菌株,其培养滤液对相应病原菌的抑菌活性却比较低,如菌株SBF11对苹果干腐病菌的抑制等｡这说明它们对相应病原菌的抑制可能是借菌丝的快速生长优势,与病原菌争夺空间和营养而产生抑菌作用的｡3 结论与讨论对商洛黄芩内生菌的分离鉴定和抗植物病原菌活性测定结果表明,商洛黄芩内生菌具有丰富的多样性,属种分布在根､茎､叶中存在明显差异,活性菌株的比例也较高;实验显示隶属于不同属的菌株对同一病原菌表现出不同程度的拮抗活性,而同一属的菌株其抗菌范围以及抗菌活性既相似又有差异｡黄芩内生菌的多样性和抗菌活性的选择性表明其可以作为生防农药开发的重要资源｡实验筛选出了6株高活性的菌株,其中,SBF02(镰刀菌属)和SBF06(青霉属)对棉立枯病菌抑制效果较好;SBF08(木霉属)和SBF27(链格孢属)对苹果干腐病菌抑制效果较好;SBF11(头孢霉属)和SBF27(链格孢属)对茄腐皮病镰孢霉抑制效果较好;SBF08(木霉属)和SBF32(链格孢属)分别对烟草赤星病菌和草燕麦镰孢霉抑制效果较好｡这些菌株的种的鉴定有待进一步研究,如用分子标记方法进行聚类分析等｡内生菌对病原菌抑制作用有各种表现形式,在本实验中,对峙试验产生抑菌带的菌株其培养滤液的抑菌活性也较高,病原菌在活性物质的作用下,菌落萎缩,菌丝断裂､消解｡关于活性物质的具体成分､性质和对病原菌的作用靶点需要进一步提取和分析研究｡内生真菌在黄芩中属种分布的组织差异性可能是由于不同组织的结构､营养､代谢特征等内部环境有别,不同的内生菌在黄芩生长过程中承担的作用不同,因而使内生菌在不同的部位定植｡值得注意的是,正是由于内生菌和植物建立了密切的生态关系,一旦从寄主植物中分离出来后,自身的一些特性也会随之改变[13]｡如在试验中经常会发现,有些活性菌株经多次转接培养或长时间保存后出现菌种退化､抗菌活性降低等现象,这可能是人工培养基成分和保存条件与植物组织的差异所致｡因此,还应对活性菌株的生理生化特性进行测定,以确定内生菌离体培养､保存以及产生活性物质的最适条件,为生防农药开发奠定基础｡参考文献:[1] 史应武,娄恺,李春.植物内生菌在生物防治中的应用[J].微生物学杂志,2009,29(6):61-64.[2] 石晶盈,陈维信,刘爱媛.植物内生菌及其防治植物病害的研究进展[J].生态学报,2006,26(7):2395-2400.[3] 刘霞,党峰峰,贺晓龙,等.陕北野生甘草内生菌的分离及抑菌活性筛选[J].西北植物学报,2010,30(10):2110-2115.[4] 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青阳参内生真菌分离与鉴定【摘要】目的：从云南民间药用植物青阳参的根、茎和叶中分离内生真菌，并进行分类鉴定。

方法：利用平板分离法分离内生真菌。

通过显微形态观察分类鉴定。

结果：从植物根、茎和叶中共分离获得34株内生真菌，其中25 株真菌经鉴定归属为5目，7 科，12个属。

结论：结果表明青阳参植物内生真菌存在多样性，不同部位内生真菌的数量、组成与种群分布存有差异。

【关键词】青阳参；内生真菌；分离；分类鉴定Isolation and Identification of Endophytic Fungi From Cynanchum Otophyllum SchneidLU Ze-bao( Chuxiong Medical College ，Chuxiong Yunnan 675005 ，China)【Abstract 】Objective ：To isolate and identify endophytic fungi from the root ，stem and leaf of Cynanchum otophyllum Schneid, which is one of Yunnan ' flok medicinal plant. Method：The methods of plate cultivation was uesd to isolate endophytic fungi. Identification of endophytic fungi was carried out by morphology. Result ：34 strains of endophytic fungi were isolatedfrom the root ，stem and leaf of plant ，which belonged to twelve genera，seven families and five orders. Conclusion ：Studies shown that the diversities of endophytic fungi in Cynanchum otophyllum Schneid made obviously a great difference inquantity ，composition and distribution.【Key words 】Cynanchum otophyllum Schneid ；Endophytic fungi ；Isolation ；Identification青阳参( Cynanchum otophyllum Schneid )是萝摩科鹅绒藤属( Cynanchum Linn. )植物，属多年生草本缠绕植物，根茎入药，一直在云南民间流传沿用，主产于云南中部、西北部和东北部地区。

《三株植物内生真菌次级代谢产物及其生物活性研究》一、引言植物内生真菌是生态系统中不可或缺的组成部分，它们与宿主植物之间形成了复杂的共生关系。

近年来，随着对植物内生真菌的深入研究，越来越多的次级代谢产物被发现并展现出独特的生物活性。

本文将针对三株植物内生真菌的次级代谢产物及其生物活性进行详细研究，旨在为相关领域的研究提供理论依据。

二、材料与方法1. 材料本研究选取了三株具有代表性的植物内生真菌，分别来自不同地区和不同种类的植物。

这些真菌经过分离、纯化后，用于后续的实验研究。

2. 方法（1）次级代谢产物的提取与分离：采用适当的溶剂对内生真菌进行提取，通过柱层析、薄层扫描等技术分离出次级代谢产物。

（2）生物活性检测：通过体外实验和体内实验，检测次级代谢产物的生物活性，如抗菌、抗肿瘤、抗氧化等。

（3）结构鉴定：利用现代分析技术，如核磁共振、质谱等，对次级代谢产物的结构进行鉴定。

三、实验结果1. 次级代谢产物的提取与分离结果通过适当的溶剂提取和柱层析、薄层扫描等技术，成功分离出三株内生真菌的次级代谢产物。

这些产物在紫外灯下呈现不同的荧光特性，表明其化学结构具有多样性。

2. 生物活性检测结果（1）抗菌活性：三株内生真菌的次级代谢产物均表现出不同程度的抗菌活性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用。

其中，某株真菌的代谢产物对某种病原菌的抑制效果尤为显著。

（2）抗肿瘤活性：通过体外实验，发现某株内生真菌的次级代谢产物具有显著的抗肿瘤活性，能够抑制肿瘤细胞的生长。

这一结果为抗肿瘤药物的研究提供了新的思路。

（3）抗氧化活性：三株内生真菌的次级代谢产物均具有一定的抗氧化活性，能够清除自由基，减轻氧化应激对机体的损伤。

3. 结构鉴定结果通过现代分析技术，成功鉴定了三株内生真菌次级代谢产物的化学结构。

这些产物包括多种酮类、酚类、萜类等化合物，具有不同的生物活性。

四、讨论本研究发现的三株植物内生真菌的次级代谢产物具有丰富的生物活性，如抗菌、抗肿瘤、抗氧化等。

蛇足石杉体内抑制乙酰胆碱酯酶活性物质的内生真菌的分离凌庆枝;董丽辉;范三微;何军邀;高莉莉;黄贝贝;魏兆军【摘要】[目的]从蛇足石杉体内分离筛选出具有体外抑制乙酰胆碱酯酶活性的内生真菌.[方法]取野外采集的蛇足石杉的叶、茎和根进行表面消毒后接种于PDA培养基,分离出内生真菌后进行摇瓶发酵,超声提取其发酵产物,以DTNB法检测其发酵产物在体外抑制乙酰胆碱酯酶的活性.[结果]从根、茎、叶中分离得到194株内生真菌,在马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中发酵后,对内生真菌发酵提取液进行体外AChE抑制活性检测；共有31株内生真菌显示出体外AChE抑制活性,抑制活性较强的有13株,抑制率在50.2％～80.5％.其中从蛇足石杉茎部位分离得到9株,叶部位分离得到4株.[结论]从蛇足石杉体内可分离出内生真菌,该内生真菌的发酵产物在体外有较强的抑制乙酰胆碱酯酶活性,这可能是寻找乙酰胆碱酯酶抑制药物的有效途径之一.%[Objective] To isolate endophytic fungi with acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activities from Huperziaserrata(Thunb. ) Trev. [Method] Stems, leaves and roots of H. serrata were collected from the open field. Then, they were inoculated on PDA culture medium after the surface sterilization. Based on the isolation of endophytic fungi, shaking flask fermentation was conducted; and fermentation products were extracted by ultrasound. Inhibitory effects in vitro of fermentation products on AChE were detected by DTNB method. [ Result] A total of 194 endophytic fungi were isolated from the roots, stems and leaves. After the fermentation in potato glucose liquid medium (PDB), in vitro AChE inhibitory activity was detected in endophytic fungi fermentation extracting liquid. 31 endophytic fungi showed in vitro AChEinhibitory activity. Among them, 13 strains had relatively strong inhibitory activity, with the inhibitory rate being 50. 2% -80.5%. 9 strains were isolated from the H, serrata stems; and 4 strains were isolated from leaves. [ Conclusion ] Endophytic fungi could be isolated from the H. serrata. The fermentation products of the endophytic fungi showed relatively strong in vitro inhibitory activity to AChE, which might be one of the effective approaches to find the inhibitory drugs of AChE.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(000)030【总页数】3页(P14706-14707,14712)【关键词】蛇足石杉[Huperzia serrata(Thunb.)Trev.];内生真菌;乙酰胆碱酯酶;抑制【作者】凌庆枝;董丽辉;范三微;何军邀;高莉莉;黄贝贝;魏兆军【作者单位】浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽合肥230009【正文语种】中文【中图分类】S567蛇足石杉［Huperzia serrata(Thunb.)Trev.］是石杉科(Huperiaceae)石杉属(Huperzia)的蕨类植物，又名千层塔、山芝、蛇足草等，分布于东北、福建、广东、广西、云南和贵州等地。

植物内生真菌的分类鉴定方法植物内生真菌是一类生活在植物组织内部的真菌，它们与植物形成共生关系，对植物的生长发育具有重要的影响。

对植物内生真菌的分类鉴定具有重要的意义。

本文将介绍植物内生真菌的分类鉴定方法，包括形态学鉴定、分子生物学鉴定和代谢产物鉴定等多种方法，以期为相关研究工作者提供参考。

一、形态学鉴定形态学鉴定是最常用的真菌分类鉴定方法之一。

对于植物内生真菌来说，通过观察其菌丝体、分生孢子、子实体等形态特征，可以初步确定其分类地位。

一般来说，菌丝体的形态特征包括菌丝的直径、分枝情况和颜色等，分生孢子的形态特征包括大小、形状、颜色和产孢部位等，而子实体的形态特征则包括大小、形状、颜色和孢子堆积情况等。

通过对这些形态特征的观察和比对，可以初步确定植物内生真菌的分类地位。

二、分子生物学鉴定随着分子生物学技术的发展，分子生物学鉴定成为了真菌分类鉴定的重要手段之一。

通过对植物内生真菌的核酸序列进行测定和比对，可以确定其与已知真菌的亲缘关系，从而确定其分类地位。

常用的分子生物学鉴定方法包括PCR扩增、基因测序、序列比对和系统发育分析等。

通过这些方法，可以得到植物内生真菌的分子特征，为其分类地位的确定提供重要依据。

三、代谢产物鉴定四、综合鉴定综合鉴定是指通过多种鉴定方法综合分析真菌的形态特征、分子特征和生物活性等信息，最终确定其分类地位。

由于植物内生真菌具有复杂的生物学特性，单一的鉴定方法往往难以达到准确的鉴定目的。

通过综合运用形态学鉴定、分子生物学鉴定和代谢产物鉴定等多种方法，可以更准确地确定植物内生真菌的分类地位。

在实际研究中，针对不同的研究对象和目的，可以灵活地选择和组合上述鉴定方法，以获得最可靠的鉴定结果。

随着科学技术的不断进步，还有待于发展更多更有效的鉴定方法，为植物内生真菌的分类鉴定提供更多的选择和支持。

希望本文的介绍对相关研究工作者有所帮助，促进植物内生真菌研究领域的发展和进步。

安徽农学通报，Anhui Agri，Sci，Bull，2019，25（10）植物内生真菌的分类鉴定方法甘森宁陆梅颖肖志邦倪伟徐继英*（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730124）摘要：该文介绍了植物内生真菌分类鉴定的方法，主要包括形态学鉴定和分子生物学鉴定2种方法。

关键词：植物；内生真菌；鉴定中图分类号S663.9文献标识码A文章编号1007-7731（2019）10-0036-02真菌广泛存在于自然界中，且种属繁多，有些菌种形态上并无明显差异，仅靠形态特征或生理、生化指标，很难把握真菌之间的亲缘关系［1］。

虽然现代分子生物学技术在真菌分类研究中应用广泛，真菌分类和系统发育研究也取得了很大的进展［2］，但形态学鉴定仍是鉴定真菌的重要参考依据。

对真菌进行分类鉴定时，多采用形态学、分子生物学相结合的方法。

1形态学鉴定传统的真菌分类主要参照魏景超《真菌鉴定手册》［3］，依据真菌形态、理化特性及超微特征等表型特征，进行初步分类工作。

目前形态学的鉴定主要使用光学显微镜和扫描电镜2种技术。

1.1光学显微镜根据内生真菌在PDA培养基上的培养特征（生长速度、大小、菌落纹饰、质地、边缘）进行分类及去重复，采用透明胶带法粘贴好菌丝，镜检观察真菌分生孢子梗、分生孢子形态及大小等显微特征，参考文献［4］进行内生真菌的初步分类。

1.2扫描电镜近年来，越来越多的学者将扫描电镜技术应用于真菌的形态学鉴定中，传统的光学显微镜虽然也能观察到真菌的基本形态，但真菌的表面超微结构必须使用扫描电镜进行观察，在SEM下可清晰地分辨出真菌的菌丝、大分生孢子和小分生孢子［5］。

采用插片法培养菌株让其菌丝生长与玻璃片表面，取出玻璃片。

首先用2.5%戊二醛在磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0）中固定样品超过4h，然后洗涤3次。

在PBS中用1%（W/V）锇酸锇（OsO4）后固定1h，再次洗涤3次。

通过一系列乙醇（50，70，80，90，95和100%）将样品在每个步骤脱水约15～20min，转移到乙醇和乙酸异戊酯的混合物（v︰v=1︰1）约30min，然后转移到纯的乙酸异戊酯约1h。