植物内生真菌的分离

1、PDA培养基（用于分离、培养植物内生真菌）：马铃薯（去皮）200g , 葡萄糖20g , 蒸馏水1000 ml , 琼脂粉15g。

用于分离内生真菌时在倒平板之前加入已过滤除菌的氯霉素和硫酸链霉素各50 µ g/ml，用于抑制细菌的生长。

2、NA培养基（用于分离、培养植物内生细菌）：牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。

用于分离内生细菌时在倒平板之前加入已过滤除菌的放线菌酮50µg/ml，用于抑制真菌生长。

115℃，20min 灭菌。

3、LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g 蒸馏水至1000 mL,pH=7.0；4、DSM1培养基：磷酸三钾26.631 g（pH=7.0)，二水柠檬酸三钠9.999 g，硫酸镁0.2465 g，硫酸铵19.821 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，胰蛋白胨10 g，葡萄糖1 g 蒸馏水至1000 mL，pH=7.0；5、DSM2培养基：磷酸三钾26.631 g（pH=7.0)，二水柠檬酸三钠9.999 g，硫酸镁0.2465 g，硫酸铵19.821 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，细菌学蛋白胨10 g，葡萄糖1 g 蒸馏水至1000 mL,pH=7.0；6、Msgg培养基：磷酸钾5 mmoL/L(pH7.0)，MOPs 100 mmoL/L（pH7.0），MgCl2 2 mmoL/L，CaCl2 700 mmoL/L，MnCl2 50 µM，FeCl3 50 µM，ZnCl2 1 µM，VB1 2 µM，甘油0.5 %，谷氨酸0.5 %，色氨酸50 µg/mL，苯丙氨酸50 µg/mL，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。

7、N%NA培养基：牛肉膏3.0 g，细菌学蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂粉N*10 g，8、BGM1培养基：牛肉膏3 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，磷酸三钾26.631 g（pH7.0），二水柠檬酸三钠9.999 g，硫酸镁0.2465 g，硫酸铵19.821 g，葡萄糖1 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。

商洛黄芩内生真菌分离鉴定及抗植物病原菌活性筛选摘要:采用组织分离法从健康黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)植株的根､茎､叶中分离获得36株内生真菌,经鉴定隶属于12属,链格霉属为优势属｡对峙试验结果显示,分离获得的内生菌中有31株对一种或多种植物病原菌有不同程度的抑制作用, 占分离菌的86%;有6株菌对一种或多种病原菌的抑菌率在75%以上,占分离菌的17%｡对这6株菌培养滤液的抑菌活性也进行了测定,结果表明对峙试验中产生抑菌带的菌株其培养滤液抑菌活性也高｡在6株筛选到的活性菌株中,SBF02和SBF06对棉立枯病菌抑制效果较好;SBF08和SBF27对苹果干腐病菌抑制效果较好; SBF11和SBF27对茄腐皮病镰孢霉抑制效果较好;SBF08和SBF32分别对烟草赤星病菌和草燕麦镰孢霉抑制效果较好｡关键词:黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi); 内生真菌;分离;抑菌活性Isolation of Endophytic Fungi from Scutellaria baicalensis Growing in Shangluo Region and Screening of Their Inhibitory Activities to Plant PathogensAbstract: Thirty-six strains of endophytic fungi were isolated from the roots,stems and leaves of healthy Scutellaria baicalensis Georgi with tissue method. They were identified as twelve fungal genera among which Alternaria was the dominant genus. The results of antagonistic cultivation indicated that thirty-one strains of endophytic fungi, accounting for 86% of all the isolates, could inhibit one plant pathogens or more to some extent; and the inhibitory activity of six strains, seventeen percent of total isolates; was significant at least to one plant pathogens, with the anti-bacterial ratio higher than 75%. Antimicrobial activity of six strains’s culture filtrates were also detected and presented that the strains producing inhibition band in antagonistic cultivation also showed remarkable inhibitory activity to indicative pathogens in the test of culture filtrates. Among six screened strains, SBF02 and SBF06 showed remarkable inhibitory activity to Rhizoctonia solani Kühn, SBF08 and SBF27 showed remarkable inhibitory activities to Botryosphae riadothidea, SBF11 and SBF27 showed remarkable inhibitory activities to Fusarium solani(Mart.), and SBF08 and SBF32 showed remarkable inhibitory activities to Alternaria alternata and Fusarium avenaceum respectively.Key words: Scutellaria baicalensis Georgi; endophytic fungi; isolation; inhibitory activity内生真菌普遍存在于健康植物各种组织､器官和细胞间隙内,与宿主之间建立了紧密的生态关系,产生的次生代谢产物对提高植物对各种生物和非生物胁迫的抵抗能力发挥着重要的作用｡因此,内生菌已成为筛选新型抗生素和其他生理活性物质的重要资源[1,2]｡尤其近年来随着人们对使用化学农药存在残留､容易引发抗性和再猖獗等隐患问题的深刻认识,从药用植物中分离筛选具有生防作用的内生菌以研发生物农药更是一个新兴的研究热点[3-5]｡黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)为唇形科植物,主要以其根部入药,现代医学研究表明,黄芩含有40多种活性成分,具有抗氧化､抗过敏､抗菌､抗病毒等多方面的功效[6]｡目前有关黄芩内生真菌抗菌活性的研究主要集中在对医学病原菌的抑制方面,而对植物病原菌的抑制研究很少｡由于不同地理环境和气候条件下内生真菌有一定差异,陕西商洛地区具有从北温带向南暖湿带过渡的地理和气候特征,黄芩是驰名的五大商药之一,但对商洛黄芩内生真菌的研究尚未见报道｡本实验对商洛黄芩内生真菌进行了分离鉴定,并测定了内生真菌对5种植物病原菌的抑菌活性,以期获得具有良好抑菌活性的菌株,为寻找新型抑菌物质和研发生物农药提供依据｡1 材料与方法1.1 材料1.1.1 植物材料分离内生菌所用植物材料为黄芩,于2009年8月采自商洛香菊药源基地,取健康植株的根､茎､叶组织样品,装入保鲜袋内带回实验室,4 ℃冷藏保存,2 d内样品处理完毕｡1.1.2 供试植物病原真菌选用以下5种植物病原菌为供试靶标菌:烟草赤星病菌(Alternaria alternata),苹果干腐病菌(Botryosphae riadothidea),棉立枯病菌(Rhizoctonia solani Kühn),茄腐皮病镰孢霉[Fusarium solani(Mart.)],草燕麦镰孢霉(Fusarium avenaceum)｡供试植物病原菌由陕西省微生物研究所提供｡1.1.3 培养基内生真菌的分离纯化以及靶标菌的培养采用PDA固体培养基;内生真菌的发酵用PDA液体培养基;内生菌的鉴定用查氏培养基和促孢培养基,促孢培养基配方如下:KH2PO4 1 g, KNO3 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g,KCl 0.5 g,淀粉0.2 g,葡萄糖0.2 g,蔗糖0.2 g,琼脂20 g,水1 000 mL, pH自然｡1.2 方法1.2.1 内生真菌的分离与纯化内生真菌分离采用组织块分离法[7,8]｡将新鲜黄芩的根､茎､叶用自来水冲洗干净,分别切成约0.5 cm的小段(片),每个部位选标样32块,无菌条件下按下列程序进行表面消毒:75%乙醇(15~20 s)→无菌水(3~4次)→0.1%的升汞(3~5 min)→无菌水(4~5次),叶等幼嫩组织处理时间稍短｡再于无菌条件下将上述表面消毒的样品切成0.2 cm长的小段或0.2 cm×0.2 cm的小片接种于含0.04%氯霉素的PDA平板上,置28 ℃恒温培养5 d 左右｡待组织块断面边缘长出菌丝后,根据菌落形态和颜色等的不同用接种针挑取尖端菌丝分别移至新的PDA培养基上,反复转接纯化,得到纯培养菌株,4 ℃保藏备用｡为了检验对材料表面消毒是否彻底,以消毒后不做任何切割的样品作为对照,于相同条件下培养,如对照平板无菌丝长出则证明表面消毒灭菌彻底,分离的真菌来自植物组织内部,否则分离结果无效｡1.2.2 内生真菌的形态观察与初步鉴定挑取在PDA培养基上纯化好的菌株尖端菌丝接种于查氏培养基和产孢培养基上,培养一段时间后观察菌落､菌丝体和孢子的形态特征,参考有关文献将分离的内生真菌鉴定到属[9-11]｡以点植培养法进行菌落观察和常规镜检:用接种针从斜面上取少量孢子,点植于平板上适当的位置,倒置平板于恒温箱中, 28 ℃培养4､7､10 d,观察菌落特征｡取少量菌丝,用乳酸石炭酸棉蓝染色液染色,进行常规镜检｡以插片法观察培养基内和气生菌丝:将真菌接种到平板上,插上灭菌盖玻片后培养,使真菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上｡观察时轻轻取出盖玻片置于载玻片上,直接观察｡以印片法观察孢子及菌丝体形态:将要观察的菌落先印在盖玻片上,放置于滴有少量乳酸石炭酸棉蓝染色液的载玻片上直接观察｡根据鉴定结果,计算内生真菌的分离率｡分离率=某一指定类型内生真菌株数/分离样品组织块总数×100%1.2.3 拮抗真菌的初步筛选拮抗真菌初步筛选采用对峙培养法[6,11]:在无菌条件下将内生真菌和供试病原菌活化好,用打孔器制成直径为0.5 cm的菌饼分别移至PDA平板上,二者相距2.5 cm,同时以只接病原菌的平板作对照,处理和对照均设3次重复,置于28 ℃下恒温避光培养｡观察记录对峙培养中病原菌菌落的生长和抑菌现象,测量菌丝扩展半径,根据抑菌率初步筛选出对病原菌生长具有抑制作用的内生真菌｡抑制率=(对照菌落半径-处理菌落对峙面半径)/对照菌落半径×100%1.2.4 初筛拮抗真菌培养滤液活性的测定1)摇瓶培养:将分离的拮抗作用较好的内生真菌在斜面培养基上活化,待生长旺盛后,在无菌条件下用直径为0.5 cm的打孔器沿菌落边缘打下10块菌饼,并用接种针挑取接种至含200 mL PDA液体培养基的500 mL锥形瓶中,28 ℃,120 r/min 恒温摇床振荡培养10 d后,无菌条件下过滤除去菌丝,滤液用于代谢产物活性的测定[12]｡2)活性测定:按生长速率法,取20 mL滤液与150 mL熔化的PDA培养基(50~60 ℃)混匀制成平板, 接种直径为0.5 cm的病原菌菌饼于平板上,以不加滤液的PDA平板作对照,每个处理重复3次, 28 ℃下静置培养5 d, 测量菌落直径, 同时观察对照情况,计算抑制百分率｡2 结果与分析2.1 商洛黄芩内生真菌的分离与鉴定结果从8月份采集的商洛黄芩的96个组织块中分离到36株内生真菌,总分离率为37.50%,其中根､茎､叶各分离到14､10､12株,分离率分别为43.75%､31.25%､37.50%｡分离菌株经鉴定隶属于12个属,根､茎､叶分别有8､4､5属,优势属为链格孢属,有12株,占总分离菌的33.33%(表1)｡总体看来,商洛黄芩中分布的内生真菌比较丰富,不同组织部位内生真菌的数量相差不大,但属种分布存在明显差异｡2.2 内生真菌对病原真菌的拮抗作用筛选结果对峙培养测试表明,商洛黄芩中存在丰富的抗菌活性菌株,分离的36株内生真菌中有31株对5种植物病原菌中至少1种有不同程度的拮抗作用,占总分离真菌的86.11%(表2)｡在活性菌株中,对苹果干腐病菌有抑制作用的菌株最多,有25株,占活性菌株总数的80.65%,且14株菌抑菌率在60%以上,其中从叶部分离到的菌株SBF27的抑菌率达82.36%｡对茄腐皮病镰孢霉､烟草赤星病菌､棉立枯病菌和草燕麦镰孢霉抑菌率在60%以上的菌株分别为12､10､8和7株,综合分析得知,36株分离菌中对至少1种病原菌的抑菌率在60%以上的菌株有21株,占总菌株数的58.33%｡对峙试验显示不同内生真菌对同一病原菌的抑制效果差异较大,以对苹果干腐病菌的抑制为例,SBF23对它的抑制率是15.31%,而SBF27对它的抑菌率达82.36%;同一内生真菌对不同病原菌的抑制程度也不相同,如菌株SBF02､SBF08和SBF32对5种病原菌都有较强的抑菌率,而其他菌株只对特定的病原菌产生较强的拮抗效应,拮抗作用因病原菌的不同表现出较大的差异｡可见内生真菌对病原真菌的拮抗作用具有一定选择性｡此外,从对峙试验中发现,内生菌对病原菌的抑制作用也有多种表现形式｡有的内生菌对病原菌产生抑菌带,在显微镜下可以看到病原菌菌丝出现萎缩､断裂p 2.3 初筛菌株培养滤液的活性测定结果测定结果表明,初筛得到的6株菌的培养滤液对5种病原真菌均有不同程度的抑制作用(表3),其中SBF02和SBF06对棉立枯病菌,SBF08和SBF27对苹果干腐病菌,SBF11和SBF27对茄腐皮病镰孢霉,SBF08和SBF32分别对烟草赤星菌和草燕麦镰孢霉的抑制率都在60%以上,抑菌活性最强的是SBF27对苹果干腐病菌的抑制,抑制率为71.37%｡观察发现,培养滤液抑菌活性较高的一般都使病原菌菌落长势变慢,气生菌丝减少,显微镜下可见菌丝变短,末端膨大且少有分枝｡而对照菌丝生长正常,菌丝粗壮,分枝较多且有大量分生孢子产生｡通过比较培养滤液抑菌活性测定和对峙培养的结果发现,培养滤液抑菌活性较高的菌株原来在对峙培养中抑菌率也高且有抑菌带产生,如菌株SBF08对苹果干腐病菌的抑制等,说明这些菌株对相应病原菌的抑菌活性物质是分泌到菌丝外的｡但同时也发现,有些在对峙培养中抑菌率较高但无抑菌带产生的菌株,其培养滤液对相应病原菌的抑菌活性却比较低,如菌株SBF11对苹果干腐病菌的抑制等｡这说明它们对相应病原菌的抑制可能是借菌丝的快速生长优势,与病原菌争夺空间和营养而产生抑菌作用的｡3 结论与讨论对商洛黄芩内生菌的分离鉴定和抗植物病原菌活性测定结果表明,商洛黄芩内生菌具有丰富的多样性,属种分布在根､茎､叶中存在明显差异,活性菌株的比例也较高;实验显示隶属于不同属的菌株对同一病原菌表现出不同程度的拮抗活性,而同一属的菌株其抗菌范围以及抗菌活性既相似又有差异｡黄芩内生菌的多样性和抗菌活性的选择性表明其可以作为生防农药开发的重要资源｡实验筛选出了6株高活性的菌株,其中,SBF02(镰刀菌属)和SBF06(青霉属)对棉立枯病菌抑制效果较好;SBF08(木霉属)和SBF27(链格孢属)对苹果干腐病菌抑制效果较好;SBF11(头孢霉属)和SBF27(链格孢属)对茄腐皮病镰孢霉抑制效果较好;SBF08(木霉属)和SBF32(链格孢属)分别对烟草赤星病菌和草燕麦镰孢霉抑制效果较好｡这些菌株的种的鉴定有待进一步研究,如用分子标记方法进行聚类分析等｡内生菌对病原菌抑制作用有各种表现形式,在本实验中,对峙试验产生抑菌带的菌株其培养滤液的抑菌活性也较高,病原菌在活性物质的作用下,菌落萎缩,菌丝断裂､消解｡关于活性物质的具体成分､性质和对病原菌的作用靶点需要进一步提取和分析研究｡内生真菌在黄芩中属种分布的组织差异性可能是由于不同组织的结构､营养､代谢特征等内部环境有别,不同的内生菌在黄芩生长过程中承担的作用不同,因而使内生菌在不同的部位定植｡值得注意的是,正是由于内生菌和植物建立了密切的生态关系,一旦从寄主植物中分离出来后,自身的一些特性也会随之改变[13]｡如在试验中经常会发现,有些活性菌株经多次转接培养或长时间保存后出现菌种退化､抗菌活性降低等现象,这可能是人工培养基成分和保存条件与植物组织的差异所致｡因此,还应对活性菌株的生理生化特性进行测定,以确定内生菌离体培养､保存以及产生活性物质的最适条件,为生防农药开发奠定基础｡参考文献:[1] 史应武,娄恺,李春.植物内生菌在生物防治中的应用[J].微生物学杂志,2009,29(6):61-64.[2] 石晶盈,陈维信,刘爱媛.植物内生菌及其防治植物病害的研究进展[J].生态学报,2006,26(7):2395-2400.[3] 刘霞,党峰峰,贺晓龙,等.陕北野生甘草内生菌的分离及抑菌活性筛选[J].西北植物学报,2010,30(10):2110-2115.[4] 刘建玲,陈宝宝,刘永红,等.半夏内生菌的分离与初步鉴定[J].中国中药杂志,2009,34(18):2304-2307.[5] 张雪兵,史应武,王晓霞,等.醉马草内生菌的分离､鉴定及杀虫效果[J].微生物学报,2010,50(4):530-536.[6] 李青莲,苏红,池维丹,等.野生黄芩内生真菌的分离鉴定及抗菌活性筛选[J].微生物学通报,2010,37(3):381-388.[7] 王建美,田呈明,过颂新,等.黄栌根内生真菌分离鉴定及拮抗真菌筛选[J].菌物研究,2008,6(1):35-39.[8] 方中达.植病研究方法[M]. 第三版.北京:中国农业出版社,1998. 124-125.[9] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979.[10] 邢来君,李明春.普通真菌学[M].北京:高等教育出版社,1991.[11] 邓振山,赵龙飞,张薇薇,等.银杏内生真菌的分离及其对苹果腐烂病病原菌的拮抗作用[J].西北植物学报,2009,29(3):608-613.[12] 王伟,翟梅枝,徐文涛,等.核桃内生菌的分离及代谢产物活性研究[J]. 西北农业学报,2008,17(1):77-81.[13] 蔡永欢,花日茂,柏钰,等.喜树内生真菌的分离及其对植物病原菌的抑菌活性测定[J].安徽农业大学学报,2010,37(4):748-752.。

青阳参内生真菌分离与鉴定【摘要】目的：从云南民间药用植物青阳参的根、茎和叶中分离内生真菌，并进行分类鉴定。

方法：利用平板分离法分离内生真菌。

通过显微形态观察分类鉴定。

结果：从植物根、茎和叶中共分离获得34株内生真菌，其中25 株真菌经鉴定归属为5目，7 科，12个属。

结论：结果表明青阳参植物内生真菌存在多样性，不同部位内生真菌的数量、组成与种群分布存有差异。

【关键词】青阳参；内生真菌；分离；分类鉴定Isolation and Identification of Endophytic Fungi From Cynanchum Otophyllum SchneidLU Ze-bao( Chuxiong Medical College ，Chuxiong Yunnan 675005 ，China)【Abstract 】Objective ：To isolate and identify endophytic fungi from the root ，stem and leaf of Cynanchum otophyllum Schneid, which is one of Yunnan ' flok medicinal plant. Method：The methods of plate cultivation was uesd to isolate endophytic fungi. Identification of endophytic fungi was carried out by morphology. Result ：34 strains of endophytic fungi were isolatedfrom the root ，stem and leaf of plant ，which belonged to twelve genera，seven families and five orders. Conclusion ：Studies shown that the diversities of endophytic fungi in Cynanchum otophyllum Schneid made obviously a great difference inquantity ，composition and distribution.【Key words 】Cynanchum otophyllum Schneid ；Endophytic fungi ；Isolation ；Identification青阳参( Cynanchum otophyllum Schneid )是萝摩科鹅绒藤属( Cynanchum Linn. )植物，属多年生草本缠绕植物，根茎入药，一直在云南民间流传沿用，主产于云南中部、西北部和东北部地区。

《三株植物内生真菌次级代谢产物及其生物活性研究》一、引言植物内生真菌是生态系统中不可或缺的组成部分，它们与宿主植物之间形成了复杂的共生关系。

近年来，随着对植物内生真菌的深入研究，越来越多的次级代谢产物被发现并展现出独特的生物活性。

本文将针对三株植物内生真菌的次级代谢产物及其生物活性进行详细研究，旨在为相关领域的研究提供理论依据。

二、材料与方法1. 材料本研究选取了三株具有代表性的植物内生真菌，分别来自不同地区和不同种类的植物。

这些真菌经过分离、纯化后，用于后续的实验研究。

2. 方法（1）次级代谢产物的提取与分离：采用适当的溶剂对内生真菌进行提取，通过柱层析、薄层扫描等技术分离出次级代谢产物。

（2）生物活性检测：通过体外实验和体内实验，检测次级代谢产物的生物活性，如抗菌、抗肿瘤、抗氧化等。

（3）结构鉴定：利用现代分析技术，如核磁共振、质谱等，对次级代谢产物的结构进行鉴定。

三、实验结果1. 次级代谢产物的提取与分离结果通过适当的溶剂提取和柱层析、薄层扫描等技术，成功分离出三株内生真菌的次级代谢产物。

这些产物在紫外灯下呈现不同的荧光特性，表明其化学结构具有多样性。

2. 生物活性检测结果（1）抗菌活性：三株内生真菌的次级代谢产物均表现出不同程度的抗菌活性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用。

其中，某株真菌的代谢产物对某种病原菌的抑制效果尤为显著。

（2）抗肿瘤活性：通过体外实验，发现某株内生真菌的次级代谢产物具有显著的抗肿瘤活性，能够抑制肿瘤细胞的生长。

这一结果为抗肿瘤药物的研究提供了新的思路。

（3）抗氧化活性：三株内生真菌的次级代谢产物均具有一定的抗氧化活性，能够清除自由基，减轻氧化应激对机体的损伤。

3. 结构鉴定结果通过现代分析技术，成功鉴定了三株内生真菌次级代谢产物的化学结构。

这些产物包括多种酮类、酚类、萜类等化合物，具有不同的生物活性。

四、讨论本研究发现的三株植物内生真菌的次级代谢产物具有丰富的生物活性，如抗菌、抗肿瘤、抗氧化等。

蛇足石杉体内抑制乙酰胆碱酯酶活性物质的内生真菌的分离凌庆枝;董丽辉;范三微;何军邀;高莉莉;黄贝贝;魏兆军【摘要】[目的]从蛇足石杉体内分离筛选出具有体外抑制乙酰胆碱酯酶活性的内生真菌.[方法]取野外采集的蛇足石杉的叶、茎和根进行表面消毒后接种于PDA培养基,分离出内生真菌后进行摇瓶发酵,超声提取其发酵产物,以DTNB法检测其发酵产物在体外抑制乙酰胆碱酯酶的活性.[结果]从根、茎、叶中分离得到194株内生真菌,在马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中发酵后,对内生真菌发酵提取液进行体外AChE抑制活性检测；共有31株内生真菌显示出体外AChE抑制活性,抑制活性较强的有13株,抑制率在50.2％～80.5％.其中从蛇足石杉茎部位分离得到9株,叶部位分离得到4株.[结论]从蛇足石杉体内可分离出内生真菌,该内生真菌的发酵产物在体外有较强的抑制乙酰胆碱酯酶活性,这可能是寻找乙酰胆碱酯酶抑制药物的有效途径之一.%[Objective] To isolate endophytic fungi with acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activities from Huperziaserrata(Thunb. ) Trev. [Method] Stems, leaves and roots of H. serrata were collected from the open field. Then, they were inoculated on PDA culture medium after the surface sterilization. Based on the isolation of endophytic fungi, shaking flask fermentation was conducted; and fermentation products were extracted by ultrasound. Inhibitory effects in vitro of fermentation products on AChE were detected by DTNB method. [ Result] A total of 194 endophytic fungi were isolated from the roots, stems and leaves. After the fermentation in potato glucose liquid medium (PDB), in vitro AChE inhibitory activity was detected in endophytic fungi fermentation extracting liquid. 31 endophytic fungi showed in vitro AChEinhibitory activity. Among them, 13 strains had relatively strong inhibitory activity, with the inhibitory rate being 50. 2% -80.5%. 9 strains were isolated from the H, serrata stems; and 4 strains were isolated from leaves. [ Conclusion ] Endophytic fungi could be isolated from the H. serrata. The fermentation products of the endophytic fungi showed relatively strong in vitro inhibitory activity to AChE, which might be one of the effective approaches to find the inhibitory drugs of AChE.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(000)030【总页数】3页(P14706-14707,14712)【关键词】蛇足石杉[Huperzia serrata(Thunb.)Trev.];内生真菌;乙酰胆碱酯酶;抑制【作者】凌庆枝;董丽辉;范三微;何军邀;高莉莉;黄贝贝;魏兆军【作者单位】浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽合肥230009【正文语种】中文【中图分类】S567蛇足石杉［Huperzia serrata(Thunb.)Trev.］是石杉科(Huperiaceae)石杉属(Huperzia)的蕨类植物，又名千层塔、山芝、蛇足草等，分布于东北、福建、广东、广西、云南和贵州等地。

植物内生真菌的分类鉴定方法植物内生真菌是一类生活在植物组织内部的真菌，它们与植物形成共生关系，对植物的生长发育具有重要的影响。

对植物内生真菌的分类鉴定具有重要的意义。

本文将介绍植物内生真菌的分类鉴定方法，包括形态学鉴定、分子生物学鉴定和代谢产物鉴定等多种方法，以期为相关研究工作者提供参考。

一、形态学鉴定形态学鉴定是最常用的真菌分类鉴定方法之一。

对于植物内生真菌来说，通过观察其菌丝体、分生孢子、子实体等形态特征，可以初步确定其分类地位。

一般来说，菌丝体的形态特征包括菌丝的直径、分枝情况和颜色等，分生孢子的形态特征包括大小、形状、颜色和产孢部位等，而子实体的形态特征则包括大小、形状、颜色和孢子堆积情况等。

通过对这些形态特征的观察和比对，可以初步确定植物内生真菌的分类地位。

二、分子生物学鉴定随着分子生物学技术的发展，分子生物学鉴定成为了真菌分类鉴定的重要手段之一。

通过对植物内生真菌的核酸序列进行测定和比对，可以确定其与已知真菌的亲缘关系，从而确定其分类地位。

常用的分子生物学鉴定方法包括PCR扩增、基因测序、序列比对和系统发育分析等。

通过这些方法，可以得到植物内生真菌的分子特征，为其分类地位的确定提供重要依据。

三、代谢产物鉴定四、综合鉴定综合鉴定是指通过多种鉴定方法综合分析真菌的形态特征、分子特征和生物活性等信息，最终确定其分类地位。

由于植物内生真菌具有复杂的生物学特性，单一的鉴定方法往往难以达到准确的鉴定目的。

通过综合运用形态学鉴定、分子生物学鉴定和代谢产物鉴定等多种方法，可以更准确地确定植物内生真菌的分类地位。

在实际研究中，针对不同的研究对象和目的，可以灵活地选择和组合上述鉴定方法，以获得最可靠的鉴定结果。

随着科学技术的不断进步，还有待于发展更多更有效的鉴定方法，为植物内生真菌的分类鉴定提供更多的选择和支持。

希望本文的介绍对相关研究工作者有所帮助，促进植物内生真菌研究领域的发展和进步。

安徽农学通报，Anhui Agri，Sci，Bull，2019，25（10）植物内生真菌的分类鉴定方法甘森宁陆梅颖肖志邦倪伟徐继英*（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730124）摘要：该文介绍了植物内生真菌分类鉴定的方法，主要包括形态学鉴定和分子生物学鉴定2种方法。

关键词：植物；内生真菌；鉴定中图分类号S663.9文献标识码A文章编号1007-7731（2019）10-0036-02真菌广泛存在于自然界中，且种属繁多，有些菌种形态上并无明显差异，仅靠形态特征或生理、生化指标，很难把握真菌之间的亲缘关系［1］。

虽然现代分子生物学技术在真菌分类研究中应用广泛，真菌分类和系统发育研究也取得了很大的进展［2］，但形态学鉴定仍是鉴定真菌的重要参考依据。

对真菌进行分类鉴定时，多采用形态学、分子生物学相结合的方法。

1形态学鉴定传统的真菌分类主要参照魏景超《真菌鉴定手册》［3］，依据真菌形态、理化特性及超微特征等表型特征，进行初步分类工作。

目前形态学的鉴定主要使用光学显微镜和扫描电镜2种技术。

1.1光学显微镜根据内生真菌在PDA培养基上的培养特征（生长速度、大小、菌落纹饰、质地、边缘）进行分类及去重复，采用透明胶带法粘贴好菌丝，镜检观察真菌分生孢子梗、分生孢子形态及大小等显微特征，参考文献［4］进行内生真菌的初步分类。

1.2扫描电镜近年来，越来越多的学者将扫描电镜技术应用于真菌的形态学鉴定中，传统的光学显微镜虽然也能观察到真菌的基本形态，但真菌的表面超微结构必须使用扫描电镜进行观察，在SEM下可清晰地分辨出真菌的菌丝、大分生孢子和小分生孢子［5］。

采用插片法培养菌株让其菌丝生长与玻璃片表面，取出玻璃片。

首先用2.5%戊二醛在磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0）中固定样品超过4h，然后洗涤3次。

在PBS中用1%（W/V）锇酸锇（OsO4）后固定1h，再次洗涤3次。

通过一系列乙醇（50，70，80，90，95和100%）将样品在每个步骤脱水约15～20min，转移到乙醇和乙酸异戊酯的混合物（v︰v=1︰1）约30min，然后转移到纯的乙酸异戊酯约1h。

植物内生真菌的分类鉴定方法植物内生真菌是一类与植物共生生活的真菌，它们生活在植物的根系、茎皮、叶片等部位，并与植物形成密切的生态关系。

这些内生真菌可以对植物的生长发育、抗病能力和环境适应性产生重要影响。

准确鉴定植物内生真菌的分类和系统发育关系对于了解其功能和应用具有重要意义。

植物内生真菌的分类鉴定方法主要包括形态学、生理学、生物化学和分子生物学等方面的特征鉴定。

下面将详细介绍这些方法。

形态学鉴定是最传统也是最常用的植物内生真菌分类鉴定方法之一。

通过观察真菌在不同生长阶段的菌丝形态、菌落形状、分生孢子的形态特征等，可以初步确定真菌的分类群和属级别。

形态学鉴定需要专业的真菌学技术和显微镜观察手段，通常需要进行染色、制作切片等操作。

生理学鉴定是根据真菌生长和代谢特点来进行分类鉴定的方法。

通过对真菌进行不同培养基上的生长试验，观察生长速度、产生孢子的能力、耐受温度、耐受盐碱等生理特性，可以初步确定真菌的生理类型和分类群。

生物化学鉴定是通过真菌在代谢过程中产生的特定酶活性或代谢产物进行分类鉴定的方法。

可以通过检测真菌分泌的特定酶活性（如脲酶、过氧化酶等）或特定代谢产物（如色素、次生代谢产物等）来判断其分类群和功能特性。

分子生物学鉴定是近年来广泛应用的一种植物内生真菌分类方法。

分子生物学鉴定主要是通过提取真菌基因组DNA，进行DNA序列分析和比对。

基于16S rRNA基因或18S rRNA 基因序列的系统发育树构建方法被广泛应用于真菌分类和系统演化研究。

还有利用多克隆体系分析研究真菌群落结构和多样性的方法，如利用PCR扩增ITS区域序列，然后通过高通量测序分析真菌菌株之间的物种多样性和同一物种的遗传变异等。

植物内生真菌的分类鉴定方法植物内生真菌是一类与植物形成共生关系的微生物，它们可以在植物根系内或表皮上生长，为植物提供养分并帮助植物抵御外界环境的压力。

对植物内生真菌进行分类鉴定是了解其生态与生物学特性的重要手段，也为植物保护和资源利用提供依据。

本文将介绍植物内生真菌的分类鉴定方法。

一、形态学鉴定形态学鉴定是最基本的真菌分类鉴定方法之一。

通过观察菌丝、分生孢子、子实体等形态特征，可以初步判断内生真菌的分类归属。

形态学鉴定需要在显微镜下进行观察，对标本的处理和染色是必不可少的步骤，以突出真菌的形态特征，帮助分辨不同种属之间的差异。

二、分子生物学鉴定随着分子生物学技术的发展，分子鉴定方法在真菌分类中的应用逐渐增多。

分子生物学鉴定主要通过PCR扩增真菌特异基因或序列（如ITS、LSU等），并通过测序确定目标基因的序列，然后与数据库中已知的序列进行比对，以确定内生真菌的物种归属。

三、生理生化鉴定生理生化鉴定主要是通过真菌代谢产物、酶活性、生理特性等方面的差异，对不同内生真菌进行鉴定和分类。

比如可以通过真菌在不同培养基上的生长情况、对不同碳氮源的利用情况、产酶能力等进行分析，从而对内生真菌进行初步鉴定。

四、基因组学鉴定随着第二代测序技术的快速发展，基因组学鉴定成为新兴的真菌分类鉴定方法。

通过对内生真菌的基因组进行测序、比对和功能分析，可以更全面地了解内生真菌的遗传变异、功能基因和生物学特性，进而对其进行准确的分类鉴定。

五、生态学鉴定生态学鉴定是指通过对内生真菌与植物的共生关系、生长环境等生态特征进行观察和分析，从生态位的角度对内生真菌进行分类鉴定。

比如通过对内生真菌的寄主植物种类、地理分布、生境类型等进行调查，可以为内生真菌的分类鉴定提供重要的生态学数据。

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81360682）；广西科学基金项目（桂科青0728049）作者简介：谭小明，男，博士，助理研究员研究方向：药用植物菌根生物学研究*通讯作者：周雅琴，女，助理研究员研究方向：内生真菌抗菌活性研究Tel /Fax ：（0771）5602461E-mail ：Zhouyaqin2009@濒危药用植物八角莲内生真菌分离鉴定及抗菌活性研究谭小明，余丽莹，周雅琴*（西南濒危药材资源开发国家工程实验室，广西药用植物园，南宁530023）摘要：目的考察广西八角莲［Dysosma versipellis (Hance )M.Cheng ］内生真菌的多样性并筛选具有抗菌活性的菌株。

方法采用琼脂块法筛选具有抗菌活性的内生真菌;应用ITS-rDNA 法鉴定所有分离的内生真菌，并对具有强抗菌活性的菌株进行形态学观察。

结果从八角莲根茎叶中共获得19株真菌，其中根12株，叶5株，茎2株;鉴定结果表明，这19株真菌分属于8目13属。

抗菌活性筛选发现DV04对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、大肠杆菌(Escherichia coli )和白色念珠菌(Can-dida albicans )均有较强的抗菌活性，鉴定结果显示，该菌株属于Leptodontidium 属暗色有隔真菌(DSE )真菌。

结论八角莲中存在丰富的内生真菌，DV04菌株可作为抗菌活性候选菌株进行深入研究。

关键词：八角莲;抗菌活性;内生真菌;暗色有隔真菌doi :10.11669/cpj.2014.05.004中图分类号：Ｒ931文献标志码：A文章编号：1001－2494（2014）05－0363－04Isolation ，Identification and Antimicrobial Activities of Endophytic Fungi of Dysosma versipellis （Hance ）M.ChengTAN Xiao-ming ，YU Li-ying ，ZHOU Ya-qin *（National Engineering Laboratory of Southwest Endangered Medicinal ＲesourcesDevelopment ，National Development and Ｒeform Commission ，Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant ，Nanning 530023，China ）ABSTＲACT ：OBJECTIVETo examine the diversity and antimicrobial activities of the endophytic fungi of Dysosma versipellis（Hance ）M.Cheng.METHODSThe identification of the fungi was carried out by rDNA-ITS sequence analysis.The antimicrobialactivities of the isolated endophytic fungi were determined by agar block test.ＲESULTSNineteen strains of various endophytes wereobtained from the roots ，stems and leaves of D .versipellis ，which were molecularly identified to belong to eight catalogues and thirteen genuses.The DV04had remarkable antimicrobial activities to Staphylococcus aureus ，Escherichia coli ，and Candida albicans .Morpho-logical and molecu1ar identification demonstrated that DV04represented Leptodontidium sp..CONCLUSIONThe endophytic fungiin Dysosma versipellis are diverse and rich.Some strains such as DV04deserve further research as an alternative antimicrobial resource.KEY WOＲDS ：Dysosma versipellis （Hance ）M.Cheng ；antimicrobial activity ；endophytic fungi ；dark septate endophyte （DSE ）药用植物体中普遍存在丰富的内生真菌［1］。

植物内生真菌的分类鉴定方法
植物内生真菌是指在植物体内寄生并与植物形成共生关系的真菌。

对于这些真菌的分
类鉴定方法主要包括形态学鉴定、生物学鉴定和分子生物学鉴定等。

形态学鉴定是最直观、最常用的分类鉴定方法之一。

通过观察和比较真菌菌丝、孢子、菌落、菌核、果体等形态特征，可以判断出真菌属和种的归属。

黑根菌属黑根镰刀菌的菌
丝为单核，有长的横生分枝，菌核呈褐色，果体紫黑色。

白粉菌科白粉菌属的菌丝为多核，具有横生的分枝，菌核呈圆形或卵形，果体呈白色。

生物学鉴定是通过进行专门的生物学实验，观察真菌生长的生理生化特征，来推断真
菌的分类归属。

土壤真菌属梅毒菌的菌丝生长在培养基上呈红棕色，产生特殊的丝状结构，菌核不产生孢子。

通过进行真菌的感染试验，可以判断真菌对不同寄主植物的寄主范围。

分子生物学鉴定是近年来兴起的一种分类鉴定方法，通过提取真菌样品的DNA，并进
行特定基因片段的PCR扩增和序列分析，来确定真菌的亲缘关系和分类归属。

常用的基因
片段有核糖体DNA、小次单位核糖体rRNA基因、线粒体DNA、DNA延伸子等。

这种方法的优势是准确性高、重复性好、速度快，但需要相应的实验设备和技术。

植物内生真菌的分类鉴定方法包括形态学鉴定、生物学鉴定和分子生物学鉴定等多种
方法。

这些方法可以根据不同的目的和条件选择使用，以达到准确鉴定真菌的目的。

第42卷第2期2021年5月Vol.42,No.2May,2021吉林师范大学学报(自然科学版)Journal of Jilin Normal University(Natural Science Edition)doi：10.16862/ki.issn1674-3873.2021.02.020人参内生真菌的分离鉴定及其生防功能的初步验证曹昆，高福泉，董佳伟，徐洪伟”（吉林师范大学吉林省植物资源科学与绿色生产重点实验室，吉林四平136000）摘要:人参主要产于中国的东北和朝鲜半岛，因为其具有极高的药用价值而被认为是草药中最重要的植物.内生真菌是一种有趣的微生物，它和植物形成互惠共利的联系.不同的内生真菌能够根据寄主及所处的生态环境的不同而产生不同的代谢物质.此外，内生真菌还能够促进宿主种子的萌发、茎的生长和诱导宿主耐受生物和非生物胁迫.本实验从7个地点进行采样,一共分离获得107株人参内生菌.对其中的29株内生菌进行ITS分子验证，比对后的结果表明主要的内生真菌是镰刀菌和木霉菌.另外还有冻土毛霉和艾米斯托克篮状菌.鉴于木霉菌的生防功能，平板对峙实验的结果表明，木霉菌能够抑制病原镰刀菌和韦状节抱霉的生长.这些实验结果表明人参拥有各种不同的内生真菌，这些内生真菌为新的生物活性的化合物的鉴定以及病原菌的生物防治提供了基础.关键词:人参；内生真菌;生防中图分类号:Q939文献标志码:A文章编号：1674-3873-（2021）02-0122450引言人参（Panax ginseng C.A.Meyer）属于五加科药用植物，具有两降三抗的药用功效，因其药用价值极高而为人们所推崇,也被人们称为中药之王•人参主要产于中国的东北地区和朝鲜半岛,并在中国的吉林省规模化种植［1］.人参的根腐病是造成人参减产和影响人参品质的最重要的因素之一，根腐病是土传病害，防治困难•常见的病原菌包括尖抱镰刀菌和腐皮镰刀菌•主要侵染人参的根茎部,初期表现不明显，中后期叶片逐渐萎蔫直至死亡［2］.植物内生真菌是一类在整个或大部分的生命周期中,都与植物生活在一起,并且不对植物产生病害的一类真菌［3］.实际上，大多数的植物体内都含有内生真菌，内生真菌可以大体上分为两大类:麦角菌科（C）和非麦角菌科（NC）内生真菌•前者是通过系统性种子传播的方式进行传播•后者还没有很好的分类,但大多数属于子囊菌门和担子菌门［3］.20世纪70年代植物内生菌在全世界范围内引起了科学家们的极大兴趣⑷，研究发现含有毒性生物碱和内生菌的植物对生物和非生物胁迫表现出抗性•例如在苇状羊茅植物体内发现麦角菌科的内生真菌，这种内生菌能够对取食苇状羊茅的牛产生毒性，从而对植物宿主起到保护作用⑷.M.Shoresh等［5］将暗适应条件下生长的拟南芥转移至强光环境下，植物的叶片由于强光带来的损伤而变成红色，但是接种哈茨木霉T22的植株没有受到类似的损伤.内生真菌在植物组织内部广泛存在，由于在其内部长期存在并与之共同进化，内生真菌和宿主形成了互利共生的关系•一些内生真菌能够协助宿主抵御病虫害，促进植物的生长和提高植物的抗逆性•人参作为中药之王,与之共生的内生真菌可能含有某些特殊的次生代谢物质，可用于医药领域的研究.病害是造成人参减产的重要因素,分离具有抗生作用的重要的内生菌，对于防治病害,也具有重要的意义.收稿日期：2021-02（3基金项目：中央引导地方科技资金项目（202002016JC）第一作者简介:曹昆（1982—）,男'吉林省延吉市人'讲师'博士•研究方向：植物分子生物学.通讯作者:徐洪伟（1964—）,男'吉林省公主岭市人'教授'博士'硕士生导师•研究方向：基因工程.第2期曹昆，等：人参內生真菌的分离鉴定及其生防功能的初步验证1232实验材料和方法2.1实验材料在7个地点(汪清县，棒槌园沟，海拔73m N43.19E130.28；抚松县池西区白溪林场，海拔885m N42.02E127.40；长白县十四道沟镇，海拔1191m N41.32E127.56；临江市四道沟镇岗头村，海拔817m N41.43E127.08；江源区正岔街道新开村，海拔627m N42.07E126.39；靖宇县龙泉镇侯家店村，海拔600m N42.25E126.38；靖宇县蒙江乡中华村，海拔585m N42.23E126.45)开展人参的采集工作，选取健康的人参植株•取材后立即低温保存,邮寄回实验室并开展工作•2.2人参的表面灭菌取人参的根和茎部位，用流水冲洗去掉表面的泥土•吸水纸去除表面的水.75%的乙醇消毒1min,无菌水冲洗3次，无菌滤纸将其表面的水分吸干.消毒液(V(次氯酸钠)：V(水)=1：8)浸泡处理15min,再用无菌水冲洗3次(最后一次冲洗的水用于涂平板做阴性对照)，无菌滤纸吸干水分•将根和茎切成1cm的小段平放在PDA培养基上培养•2.3人参内生真菌的分离纯化28弋培养3d,观察是否有菌落形成•有单菌落形成后，立即挑取到新的PDA培养基中进行纯化培养并保存菌种.2.4DNA的提取本实验采用SDS法提取真菌的基因组DNA,取0.2g菌丝液氮研磨成粉末，加入1mL裂解液(0.2mol/L Tris-HCL(pH8.0),50mmol/L EDTA,2%SDS,0.1mol/L NaCl),65T水浴30min,加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇，混匀并静置2min,10000g离心10min,取上清液加入到新的离心管中，加入等体积的氯仿再次抽提，混匀后静置2min,10000g离心10min.取上清液,加入等体积的异丙醇，混匀.室温放置10min,10000g离心10min，弃上清液.75%的乙醇洗涤沉淀,10000g离心5min,弃去乙 醇并用无菌风吹干,加入含RNA酶的水溶解沉淀获得所需的DNA.2.5ITS扩增和比对弓I物：ITS-1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')ITS-4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')对模板DNA进行扩增,反应条件为：预变性94T,5min；变性94T,30s,退火55T,30s,延伸72T,50s, 30个反应循环;延伸72T,10min.电泳并将扩增好的条带切下做胶回收，与T载体做酶联反应,转化,测序•将测序的结果与NCBI的数据库进行比对.2.6平板对峙实验在9cm的平板的两端，分别接种内生菌绿色木霉和病原菌燕麦镰刀菌以及韦状节抱霉，观察菌落生长情况.3实验结果3.1内生菌的分离我们将人参的根和茎段接种到PDA培养基上,3d后观察，外植体贴近培养基的一侧长出白色的菌丝•但是作为阴性对照，涂布有最后一次洗涤外植体的水的培养基，并没有长出菌落•说明外植体周围的菌丝为人参内生真菌•共分离获得107株内生菌•我们对其进行形态学初步观察后，选取29株内生菌做进一步的分子检测.3.2内生菌的分子鉴定我们将29株真菌的测序结果在NCBI网站上进行序列比对，结果发现它们从属的层次上可以划分为4类:镰刀菌属、篮状菌属、木霉菌属和毛霉(见图1).镰刀菌属的数量最多达到14株,木霉属的为13株.镰刀菌中包括：芳香镰抱菌(FusariurnredoZens)、尖抱镰刀菌(Fusariurnoxysporurn)和腐皮镰刀菌(FusariurnsoZani).蓝状菌属包括一种菌为艾米斯托克篮状菌(TaZaromycesamestoZkiae).木霉菌属包括4个菌种，分别为哈茨木霉(T ricAodermaAarzianum)、勾状木霉(TricAodermaAamatum)、绿色木霉124吉林师范大学学报（自然科学版）第 42 卷（Frichoderma. ©iride ）和康宁木霉（Frichodermaboningii ）.毛霉包括一种为冻土毛霉（MucorhiemaZis ）.另 外,还有两株内生真菌在数据库中没有注释.（A ）腐皮镰刀菌；（B ）绿色木霉；（C ）芳香镰抱菌；（D ）冻土毛霉；（E ）尖抱镰刀菌；（F ）哈茨木霉图1人参根和茎段分离得到的部分内生真菌Fig. 1 Partial endophytic fungi obtained from the isolation of ginseng root and stem3・3内生菌的生防功能向PDA 培养基上分别接种内生菌绿色木霉和燕麦镰刀菌以及韦状节抱霉，我们发现绿色木霉的生 长不受限制,而两种病原菌的生长速率明显放缓，特别是韦状节抱霉的生长明显受到抑制（见图2）.这 说明绿色木霉菌能够有效地抑制两种病原菌燕麦镰刀菌和韦状节抱霉的生长.(b )I傢色木畫韦状节砲劃.IK.丿严麦镰刀菌乞丫绿色木霍（A ）绿色木霉vs 燕麦镰刀菌；（B ）绿色木霉vs 韦状节抱菌图2平板对峙实验Fig. 2 Plate confrontation experiment4结果与讨论真菌在解决世界农业问题方面扮演着重要的角色.由于内生真菌长期存在于植物的组织中并与其 共同进化,因此一些内生真菌能够防治病虫害.例如印度梨形抱不仅能够增强宿主的抗病性，而且能够 提高宿主的生物量和对非生物胁迫的抗性⑶.本实验中，我们共分离获得107株菌株，根据菌落的形态 特征,对其中29株内生菌进行了 ITS 测序.并将结果进行了基因比对，可以把获得的菌种分为4个属: 镰刀菌属、篮状菌属、木霉菌属和毛霉.我们分离的菌株数量并不多,这一方面可能与吉林东部地区的气第2期曹昆，等：人参內生真菌的分离鉴定及其生防功能的初步验证125候条件有关，另一方面可能与我们对外植体的消毒的严谨度有关.镰刀菌因其产生的分生抱子形似镰刀而取名为镰刀菌,又因其分类中的很多菌种属于致病菌而恶名昭彰•镰刀菌的传播方式分为两种，即垂直传播和水平传播•前者是由母代到子代的传播，后者通过外源侵入寄主的方式进行传播•镰刀菌中的植物病原菌侵入植物维管或导管组织后,常导致植物根系出现腐烂、叶片萎蔫和促进植物疯长的现象[6].本文通过分子鉴定获得的29株菌中，有14株菌属于镰刀菌属，在种上划分为芳香镰抱菌、尖抱镰刀菌和腐皮镰刀菌•这样的实验结果似乎与内生菌的对植物的益生作用相悖,但上述菌种也不仅仅只包括一个种，也是复合种[7].而且并不是所有的镰刀菌都只能为植物带来病害，有些植物内生镰刀菌还可以成为生防菌，这些内生非致病菌通过竞争和生态位排斥的方式,对致病镰刀菌起到排斥作用•例如:铀ia等[8]分离获得3株内生木贼镰刀菌(Fusariumeguiseti)，单独施用时能显著地促进梨树的生长•和燕麦镰刀菌联合施用时，能显著地减少根部燕麦镰刀菌的定殖和根腐病的发生;N.Benhamou等[9]研究发现，植物内生菌尖抱镰刀菌Fo47通过抗菌和重寄生，以及诱导植物产生防御应答的方式,能够有效地对抗终极腐霉(PytAiumuZtimum)对黄瓜的致病危害;I.Iori等[10]试图从分子系统发育的角度来解析病原镰刀菌和非致病镰刀菌，但是二者的分子系统发育特征并没有明显的不同•镰刀菌的内生行为与它的生防菌的作用之间的关系也是研究的热点，同样值得从分子生物学的角度对其进行深入的挖掘.木霉属于丝状子囊真菌属，是土壤中一种很常见的微生物•在热带土壤中，每克土壤中含有10~ 103个抱子•本文通过分子鉴定的方法共分离获得13株木霉内生菌，包括哈茨木霉、勾状木霉、康宁木霉和绿色木霉•木霉定殖于单子叶或双子叶植物的根系上，根际中的木霉和次生代谢物质有利于植物的生长和对矿质元素的吸收.G.Harman等[11]研究发现，向豆科植物施加哈茨木霉T22,植物根系变得发达，产量增加到123%.D.L.Lindsey等[12]向无菌的番茄组培苗施加绿色木霉，植物的株高和鲜重分别增加28%和8%.在矿质元素吸收方面，哈茨木霉T22能够溶解磷酸岩、Fe3+、Cu2+、Mn"+and Zn0•此夕卜,它还能够产生可溶性代谢物用于还原Fe3+和Cu2+生成Fe(I)-Na2-邻菲咯啉二磺酸和Cu(I)-Na2-2, 9-二甲基-4,7-联苯-1,10-菲咯-线二磺酸[13].这种螯合和还原作用增加了植物对土壤中的营养元素的吸收,从营养学的角度也就解释了木霉对植物生长的促进作用•在抵御非生物胁迫方面，木霉菌表现同样出色•当培养基中的水势降低到-0.2~-0.3MPa时，种子的发芽率受到了显著影响•而施加哈茨木霉T22的种子在受到相同干旱胁迫条件下，仍然保持较高且均一的萌发率[14].此外，在生物胁迫方面，木霉通过霉菌寄生和激活宿主免疫应答的方式在植物抗病方面发挥着重要的作用.Harman研究发现：向植物喷施生防试剂哈茨木霉T22,能有效控制病原菌对叶面和果实侵害[11].在我们的研究中，平板对峙实验同样表明绿色木霉对镰刀菌有抑制的作用.和前面两种真菌相比，有关冻土毛霉在植物中的研究相对较少.A.H.Molla和H.I.Khan研究发现:冻土毛霉可用于污水处理,经冻土毛霉和哈茨木霉处理的污水，水质得到了明显的净化,83%~100%的金属离子被过滤去除•使用污水直接浸泡种子,萌发率最高为30%.而经过冻土毛霉和哈茨木霉净化后的污水，种子萌发率为100%[15].因此冻土毛霉有螯合金属离子的功效•D.B.Wietse等[16]研究发现，向植物的根部接种冻土毛霉BHB1和哈茨木霉PvdG2够改变根际周围的细菌群落结构•这些新增加的细菌一方面能够产生几丁质酶对抗病原菌,另一方面与病原菌竞争根系分泌物和空间，使病原菌处于“饥饿”的状态•因此冻土毛霉同样有对抗病原菌的功效.以上的实验结果表明：无论是我们分离得到的镰刀菌，还是木霉或冻土毛霉都有潜力成为人参的生防菌,为人参的抗病研究做有益的探索.参考文献[1]YLN T K.Brief introduction of Panax ginseng C.A.Meyer[J].J Korean Med Sci,2001,I6：S3-5.[2]ZHENG Y K,MIAO C P,CHEN H H,et al.Endophytic fungi harbored in Panax notoginseng:Diversity and potential as biological control agentsagainst host plant pathogens of root-rot disease[J].J Ginseng Res,2017,4I(3)：353-360.[3]RODRIGLEZ R J,JR J F W,ARNOLD A E,et al.Fungal endophytes:Diversity and functional roles[J].New Phytol, 2009,182(2)：3I4-330.[4]LI X Z,SONG M L,YAO X,et al.The effect of seed-borne fungi and EpicAZo endophyte on seed germination and biomass of Elymus sibiricus[J].Front Microbiol,20I7,8：2488-2496.126吉林师范大学学报（自然科学版）第42卷[5]SHORESH M,HARMAN G E,MASTOURI F.Induced systemic resistance and plant responses to fungal biocontrol agents[J].Annu RevPhytopathol,2010,48(1)：21-43.[6]谢安娜，徐浩飞，张志林，等•致病镰刀菌的研究进展[J].湖北工程学院学报,2020,40(6)：3741.[7]BAAYEN R P,O'DONNELL K,BONANTS P J,et al.Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identifymonophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease[J].Phytopathology,2000,90(8)：891-900.[8]首I^I A,BAANOVI J,FINCKH M R.Endophytic Fusarium eguiseti stimulates plant growth and reduces root rot disease of pea(Pisum sativumL.)caused by Fusarium avenaceum and PeyroneZZaea pinodeZZa[J].Eur J Plant Pathol,2017,148：271-282.[9]BENHAMOU N,GARAND C,GOULET A.Ability of nonpathogenic Fusarium oxysporum strain Fo47to induce resistance against PythiumuZtimum infection in cucumber[J].Appl Environ Microb, 2002,68(8)：4044-4060.[10]IORI I,IKUO K.Molecular phylogeny and diversity of Fusarium endophytes isolated from tomato stems.[J]Fems Microbiol Ecol,2015,91(9)：fiv098-1-fiv098-16.[11]HARMAN G E,PETZOLDT R,COMIS A,et al.Interactions between Frichoderma harzianum Strain T22and maize inbred line Mo17andeffects of these interactions on diseases caused by Pythium uZtimum and CoZZetotrichum graminicoZa[J].Phytopathology2004,94(2)：147-153.[12]LINDSEY D L,BAKER R.Effect of certain fungi on dwarf tomatoes grown under gnotobiotic conditions[J].Phytopathology,1967,57：1262-1263.[13]ALTOMARE C,NORVELL W A,BJoRKMAN T,et al.Solubilization of phosphates and micronutrients by the plant-growth-promoting andbiocontrol fungus Frichoderma harzianum Rifai1295-22[J].Appl Environ Microb,1999,65(7)：2926-2933.[14]MASTOU RI F,BJORKMAN T,HARMAN G E.Seed treatment with Frichoderma harzianum alleviates biotic,abiotic,and physiological stressesin germinating seeds and seedlings[J].Phytopathology,2010,100(11)：1213-1221.[15]MOLLA A H,KHAN H I.Detoxification of textile effluent by fungal treatment and its performance in agronomic usages[J].Environ Sci PollutR,2018,25：10820-10828.[16]WIETSE D B,HUNDSCHEID MPJ,KLEIN GPJA,et al.Antifungal rhizosphere bacteria can increase as response to the presence ofsaprotrophic fungi[J].PloS One,2015,10(9)：e0137988-1-e0137988-15.Isolation and identification of endophytic fungi in ginsengand preliminary verification of its biocontrol functionCAO Kun,GAO Fun-guan,DONG Jia-wei,^ong-wei(Jilin Provioncial Key Laboratory of Plant Resources Science and Green Production,Jilin Normal University,Siping13600,China)Abstract:Ginseng has extremely high medicinal value,mainly produced in Northeast China and the Korean Peninsula,and is considered to be the most precious plant among herbs.Endophytic fungus is an interesting microorganism,and it forms a mutually beneficial relationship with plants.Many endophytes brought benefits to their host plants.Due to the different host and the ecological environment in which they depended,various endophytes can produce different metabolites.In addition,endophytes can benefit their host in different ways, such as promoting germination and boosting their growth,inducing host plants to tolerate biotic or abiotic stress.In this experiment,samples were taken from7locations and a total of107strains of ginseng endophytes were isolated.Fusarium and Frichoderma were idetified as dominant endophytic fungi based on morphological traits and ITS sequences from29strains of endophytes.In addition to these two kinds of fungi,the ITS sequence alignment also revealed that MucorhiemaZis and Falaromycesamestolkiae exist in our interested fungus.Plate confrontation experiment shows that Frichoderma.viride can inhibit the growth of Fusarium avenaceum and Arthrobacter reedi/ormis.The results suggested that ginseng harbors diversified endophytic fungi that would provide a basis for the identification of new bioactive compounds,and for effective biocontrol of ginseng root rot.Key words：ginseng；endophytic fungi；biological control（责任编辑：林险峰）。