植物内生真菌的分离

植物内生菌的分离钱昆121140041一、实验目的1、掌握对植物内生菌的分离处理方法。

2、熟练掌握对细菌、真菌的染色观察技术。

3、了解微生物分子实验的基本操作流程。

二、实验原理在植物的生态环境中，存在着各种各样的微生物,它们有的附着于植物的表面，有的则生活于植物体内。

对于附着于植物表面和根际的微生物已有很多研究，而对于植物体内微生物的研究却刚刚起步。

但有资料显示, 一些植物内生微生物与宿主发生关系时，可明显增强宿主的抗病性，提高植物的生产力。

因此，合理利用植物的内生微生物具有重要的理论意义和实用价值。

植物内生菌作为微生物研究领域之一，近年来一直备受关注。

内生菌概念在1866年首先由Bary提出的，指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织或器官内部的微生物（主要为真菌和细菌）。

其后的很长时间内，内生菌研究进展缓慢。

直到1993 年，美国蒙大拿州立大学Strobel等从短叶红豆杉的韧皮部位分离到一株产新型抗癌物质紫杉醇的内生真菌，从而启发人们可从植物内生菌寻找与植物产生的相同或相似的化合物，由此促进了植物内生菌的研究。

植物内生菌为植物组织内的正常菌群，包括植物内生真菌、内生细菌和内生放线菌，广泛分布于各种陆生及水生的低等植物和高等植物中。

内生真菌是在宿主植物的茎和叶内生存并完成生活周期的真菌。

这类真菌中，有许多种类很少形成孢子，或者在宿生植物上形成孢子（或者孢子果），不容易识别。

真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间。

与病原菌不同，这些真菌对宿主植物几乎没有害处，它们和植物之间或者是相互依存的共生关系，或者是不太密切的共生关系。

对于现已分离得到的植物内生细菌，一般可分为专性内生细菌与兼性内生细菌，前者指至今只能在植物体内分离得到的细菌；后者指能在植物根际与土壤中分离得到，也能在植物体内分离得到的细菌，而且种类居多。

根据内生细菌对宿主植物生长发育的影响可以将其分成三类：第一类对植物的作用是中性的，即尚未发现它们的内生定殖对宿主植物生长与繁殖有影响；第二类对植物生长发育有促进作用，如能提高宿主植物抗病、抗逆能力，或能通过固氮与分泌激素促进植物生长发育等；第三类对植物生长具有负面影响，在特别条件下接种到原宿主植物或另外的宿主植物会诱发植物病害。

分离植物内生真菌操作流程1.材料准备：植物样本、剪刀、镊子、70%乙醇、3%次氯酸钠（本实验用4?）、酒精灯、计时器、平板、锥形瓶，无菌水，离心管（带盖，灭菌）、打开无菌操作台灭菌30min。

（1）植物样本的采集：选取生长状态良好，不要有病斑或者枯枝烂叶，每种植物实行三株标本，必须具有叶子、叶柄和枝条及其他部位，将样本名字写下在小纸条上放到上装标本的袋子里，檀香的标本与写著名字的纸条一同偷拍，样本上存有脏东西时，恳请用纸轻轻盖住，若不确切植物名字，恳请将整棵植物偷拍领用作鉴别，并搞好有关记录。

（2）制作pda固体培养基，在无菌操作台中倒平板，每瓶250ml的培养基大概倒15个板，等待其凝结后用作注射。

2.清洗：认真用清水将标本洗净，洗去标本表面的灰尘，去除枯叶，备用。

3.取样：（1）在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位展开采样，穗序5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取5~10mm，若是比较粗的枝干或圆圆的果实之类的，总之比较大的，则将它切开，再剪取样本，样本不要剪的太大或太小。

（2）每种植物的叶子，叶柄，枝干等其他部位，每种部位注射两块板，小板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中，小板每个接种四个样本即左上、右上、左下，右下，计算好所要剪的样本数，尽量多剪几个，以免后面的表面灭菌中冲洗时被冲掉。

（3）若植物标本存有余下，且是没烧完的，再次上装不好，放在冰箱里，水泵，洗过的扔掉。

（4）每种植物标本所剪的样本放到一个50ml的离心管中，放到试管架上，并且每个离心管上要标好所对应的植物标本。

4.表面杀菌：在无菌操作台中展开（1）先向各离心管内倒入适量（10~20ml）70%乙醇，拧紧盖子，用计时器已经开始计时1min,每10秒钟摇晃离心管几次，并使其充份杀菌。

（2）1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管中样本好像出来，盛满的样本不要再放进其中，也不要用手遇到样本，样本不可以碰触至除了离心管以外的东西。

d植物内生菌分离处理方法刘明志。

南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。

热带亚热带植物学报，2011，19(4):360～364剥取红豆杉的老树皮，截成2～3 cm长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次。

用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成0．5 cm左右长的小块，接种于加有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。

每皿放置10块，依次编号，置于25℃恒温培养箱中培养。

幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成1 cm长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA固体培养基上培养。

红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。

1刘金花。

黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。

２０１１，３３（４）：２７～３０黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的VA培养基平板培养泡1min,用无菌水冲洗5次。

待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离。

2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011, 38(1): 8?13将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗 2 次, 75%酒精浸泡 1 min, 再用 2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入 75%酒精中浸泡 30 s,接着用无菌水漂洗 3 次, 平放于 NA 平板上, 28 °C培养 2?3 d。

取最后一次漂洗液涂布 NA 平板作为对照。

内生菌分离和纯化。

将 NA 平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离 1-2 次直到获得纯培养3孙传伯。

红树植物内生真菌的分离鉴定及抗菌活性菌株的筛选陈昭华;伍菱;杨秋明;王骥妍;朱敏佳;杜希萍【摘要】本文对厦门集美红树植物无瓣海桑(Sonneratia apetala),海马齿(Sesuvium portulacastrum)和秋茄(Kandelia candel)的多个部位进行内生真菌的分离和形态鉴定,并采用菌饼法对分离到的内生真菌进行抗菌活性筛选.结果显示,从3种红树植物的根、茎、叶中分离得到25株内生真菌,分别隶属8个类群,以链格孢属和曲霉属为主,分别占菌株总数的28.0％和24.0％;有19株菌株对至少一种指示菌有抑制作用,占菌株总数的76.0％.研究结果表明,红树植物来源的内生真菌数量多,种属丰富,同时具有良好的抗菌活性,是研究抗菌活性化合物的重要资源.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2013(022)003【总页数】4页(P263-266)【关键词】红树植物;内生真菌;分离鉴定;抗菌活性【作者】陈昭华;伍菱;杨秋明;王骥妍;朱敏佳;杜希萍【作者单位】集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;福建省食品微生物与酶工程重点实验室,福建厦门361021;福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心,福建厦门361021;厦门市食品与生物工程技术研究中心,福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】Q939内生真菌(endophyte)是指生活于健康植物组织内部、不引发植物产生明显病症的一类真菌。

不但对促进宿主植物的生长发育，增强抗逆性起到重要作用，而且许多内生真菌能产生与宿主相同或相似的生物活性物质［1-2］。

目前已从植物内生真菌中发现多种具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗菌、杀虫、免疫抑制、酶抑制剂或激活剂等活性代谢产物，在医药业、农业的生物防治方面都显示出重要的应用价值［3-6］。

d植物内生菌分离处理方法文献材料前处理第一次消毒第二次消毒（含三消）处理对照培养基刘明志，2011 南方红豆杉的老树皮、幼茎、叶截成2～3 cm长的小段，去除树皮层75%酒精中浸泡30s0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次研磨成匀浆液，倾倒于PDA上切成0．5 cm左右的块，接种于有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。

每皿10块刘金花2011 黄花蒿的根，茎，叶叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口）将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min1%的次氯酸钙溶液浸泡1min,用无菌水冲洗5次置于含双抗的V A培养基平板培养待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离宋培勇2011 珙桐茎、叶和叶柄将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗2 次75%酒精浸泡 1min再用2%NaClO 溶液中浸泡3 min, 转入75%酒精中浸泡30 s,接着用无菌水漂洗3 次,取最后一次漂洗液涂布NA 平板作为对照平放于NA 平板上,28 °C培养2−3 d孙传伯2011 台湾7303毛豆全株采回的样本用自来水洗净, 并用无菌纸吸干水分, 并用无菌纸吸干水分,切取支根110 cm长的小段, 须根切成115 cm的小块用75% 酒精浸泡5m in、7m in、10min分别用0.1% 升汞溶液处理4 m in、6m in、8 m in进行表面灭菌,此试验分别重复3次。

最后用无菌水冲洗4次,。

最后用无菌水冲洗4次将组织块在研钵中充分研磨成匀浆最后一次冲洗液涂3种不同培养基平板, 26~ 28e下培养2~ 3d, 筛选出最佳消毒时间和培养基, 将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗4次,取上清液涂抹于培养基上。

以无菌水冲洗为对照试验。

取上清匀浆涂抹于3种不同培养基上, 取匀浆涂布于不同培养基平板, 每浓度重复3次, 然后将培养皿置于26~ 28e 恒温箱中培养2~ 3d, 观察培养出的菌落形态精品文档张鑫2011 植物圣罗勒的健康叶子将叶子用流水冲洗10 min1% 的次氯酸钠中浸泡10min0．02 mol / L、pH7．0 的无菌磷酸钾缓冲液( PB) 漂洗4 次加无菌水将材料研磨涂布培养李铭, 2011 石耳目地衣为了诱导产孢，黑化菌株在光照/黑暗( 12 h∶12h) 条件下，于2%的PDA培养基上，18℃下培养 3 个月刘杰凤2011 健康的小白菜，染病的小白菜根，茎，叶流水冲洗干净，剪成小段75％酒精中浸泡3min10％次氯酸钠浸泡茎为8 min，根和叶由于气孔较茎大，浸泡5 min即可，然后用无菌水浸泡多次，每次3 min无菌条件下用适量的PBS缓冲液捣碎以最后一次的漂洗液作对照，30 ℃下培养一个星期搅拌后静置3 min，取上清液0．5 mL分别涂布于分离培养基平板上，每种材料做3次平行精品文档朱士茂2011 新采集的银杏枝条，叶子和根在自来水中冲洗干净，然后将枝条和根截成 3 －4cm长，将叶子和叶柄分开，分别将根，枝，叶放在不同的灭菌后的广口瓶中（一），根的表面灭菌: 0. 1%的土温20 消毒1min，无菌蒸馏水冲洗 2次。

植物内生真菌分离方法的研究何佳;刘笑洁;赵启美;陈钧【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2009(030)015【摘要】目的:对准确分离植物内生真菌的方法和适宜的培养条件进行研究.方法:采用75%乙醇、次氯酸钠溶液(活性氯含量1.3%～5.2%)浸泡和无菌水洗涤工艺对植物材料进行表面火菌,以火菌强度逐步递减的方式,确定最佳分离植物内生真菌的表而灭菌强度;设置超净工作台无菌状态检测对照、漂洗液无菌检测对照和组织印迹无菌检测对照3种对照处理,确保适度的表面灭菌强度;采用不同的培养基分离培养内生真菌.结果:高浓度杀菌剂短时间处理比低浓度杀菌剂长时间处理更适合植物内生真菌的分离;使用10%马铃薯葡萄糖双抗培养基、22℃低温培养,能抑制快生型菌株的疯长,从而使慢生型菌株拥有一定的生长空间,最大限度地分离所有植物内生真菌;同时设置3种对照处理可以确保植物内生真菌分离的准确性.结论:设计合适的表面灭菌方法、表面灭菌效果检测方法和分离培养方法对植物内生真菌的分离至关重要.【总页数】4页(P180-183)【作者】何佳;刘笑洁;赵启美;陈钧【作者单位】河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳,471003;河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳,471003;河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳,471003;江苏大学食品与生物工程学院,江苏,镇江,212013【正文语种】中文【中图分类】Q939.92【相关文献】1.植物内生真菌分离培养的研究方法 [J], 王利娟;贺新生2.一株藜芦植物内生真菌代谢产物的分离鉴定研究 [J], 姬志林;关会敏;杨本寿;陈有为3.5种药用植物内生真菌的分离纯化及生物活性研究 [J], 郭钦;杨中铎;孙建慧4.四种药用植物内生真菌的分离及抗单胺氧化酶的活性研究 [J], 苟文博;杨中铎;周格格5.禾本科植物内生真菌研究13:禾本科植物内生真菌的分离鉴定及基因组DNA的快速提取 [J], 王永;纪燕玲;王晗;陈永敢;王志伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

2020.08种植技术金莲花，又称旱荷、旱莲花寒荷，为毛茛科金莲花属的植物，一年生或多年生草本。

金莲花有清热解毒，消炎止痛，清热散风，平肝明目的功效。

为探究金莲花内生真菌次生代谢产物活性，通过对兴隆山金莲花的内生菌分离纯化，确定其种类和数量并分析其形态学特征，为后期探究具有高度开发价值的有生物活性的天然产物新型生物资源奠定基础。

1　实验材料1.1　实验所用植物的材料来源采自兰州市榆中县兴隆山的金莲花，由指导老师郭俊珍老师鉴定。

图11.2　仪器与设备量筒、玻璃棒、烧杯、培养皿、锥形瓶、电子分析天平、VS-1300-U超净工作台、生化恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、电热鼓风干燥箱1.3　药品与试剂75%酒精、升汞0.1%、葡萄糖、琼脂粉、注射用青霉素钠、注射用硫酸链霉素、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。

2　实验方法2.1　培养基的制作称取200g土豆，洗去泥沙，去皮切块，利用蒸馏水煮沸至土豆成泥。

用八层纱布过滤并将滤液置于烧杯中，向烧杯中加入20g葡萄糖和25g琼脂，搅拌溶解并转移至1000mL的量筒中进行稀释。

分装，高压蒸汽锅灭菌，待溶液降至约55℃时加入青霉素钠和硫酸链霉素于超净工作台中倒平板，接种。

2.2　内生真菌的培养从采样袋中挑选出叶，茎，根无损伤且无虫害的金莲花植株用无菌水冲洗干净。

在超净工作台中依据组织切割法将金莲花的叶、茎和根切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，将切割好的小块于无水乙醇浸泡2min，无菌水漂洗2～3次，而后于0.1%的升汞溶液中浸泡2min再次用无菌水漂洗2～3次后，用无菌滤纸吸干表面的水分。

将灭菌后的小块置于制好的培养基上，每板放置5块片，密封膜密封，于27℃的培养箱中培养3～7d。

将最后的漂洗液涂布于一个平板内一起放入培养箱中，观察是否有细菌长出，以检验上述操作是否灭菌完全。

3.3　分离纯化菌落出现在切口。

根据菌落形态，色差和生长时间，挑取每个菌落的边缘菌丝并转移到分离培养基平板进行再培养。

5种药用植物内生真菌的分离及其抑菌活性的研究周生亮;陈才法;房兴堂;蒋虹;魏志文【期刊名称】《江苏师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2007(025)004【摘要】从樟树、女贞、十大功劳、绞股蓝及荔枝草的叶片、叶柄、茎和枝条等部位分离内生真菌,并以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌为试验菌对分离的内生真菌进行了抑菌活性筛选.结果从5 种药用植物中共分离出124株内生真菌,其中37株内生真菌对一种或多种供试菌有抑制作用,高抗菌活性菌株有11 株.【总页数】4页(P69-72)【作者】周生亮;陈才法;房兴堂;蒋虹;魏志文【作者单位】徐州师范大学,江苏省药用植物生物技术重点实验室,江苏,徐州,221116;徐州师范大学,江苏省药用植物生物技术重点实验室,江苏,徐州,221116;徐州师范大学,生命科学学院,江苏,徐州,221116;徐州师范大学,江苏省药用植物生物技术重点实验室,江苏,徐州,221116;徐州师范大学,江苏省药用植物生物技术重点实验室,江苏,徐州,221116【正文语种】中文【中图分类】Q939.92【相关文献】1.药用植物马蔺的内生真菌分离及其抑菌活性的研究 [J], 毕江涛;潘星;黄盼盼;马飞;关晓庆2.秦岭药用植物防风内生真菌的分离鉴定及抑菌活性研究 [J], 张影珍;马养民;王鹏飞;田从丽3.药用植物二色补血草内生真菌分离及其抑菌活性初步研究 [J], 毕江涛;潘润霞;黄盼盼;吕雯;关晓庆4.濒危药用植物南方山荷叶内生真菌分离及其抑菌活性初步研究 [J], 毕江涛;潘润霞;王静;代金霞;贺达汉5.濒危药用植物沙冬青内生真菌分离及其抑菌活性初步研究 [J], 毕江涛;李萍;马飞;关晓庆;贺达汉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。