小鼠原代肝细胞的分离与培养

小鼠提原代肝细胞原理
小鼠提原代肝细胞是一种实验室技术，用于研究和探索肝脏生物学和疾病机制。

其原理主要包括以下几个步骤：
1. 鼠标准备：选取适合的小鼠作为实验对象，例如常用的实验小鼠品种如C57BL/6等。

2. 消化和分离：通过注射合适的麻醉药物使小鼠进入无意识状态，然后进行腹腔解剖，取出肝脏组织。

将肝脏组织切碎并进行酶消化，将肝细胞从其他细胞分离出来。

3. 培养和传代：将分离得到的原代肝细胞放入适当的培养基中，并提供适宜的营养物质和环境条件，使其在培养皿中继续生长和增殖。

当细胞充分增殖并达到一定密度时，可以进行传代，即将细胞从原培养皿中分离并重新分配到新的培养皿中。

4. 鉴定和确认：对传代后的细胞进行鉴定和确认，例如通过形态学观察、细胞计数、细胞功能检测等方法，确保细胞的纯度和活性。

同时，可使用特异性标记物如肝细胞特异性蛋白等进行免疫染色，确认细胞的特异性。

通过小鼠提原代肝细胞，科研人员可以获得高质量的原代肝细胞样本，用于开展各种疾病模型、药物筛选和机制研究等实验。

该技术为肝脏疾病的治疗和预防提供了重要的实验基础。

小鼠肝外胆管上皮细胞的分离、原代培养及鉴定方法一、引言。

小伙伴们，今天咱们来聊聊小鼠肝外胆管上皮细胞这个超有趣的话题呢。

研究这个细胞对于了解肝脏相关的生理机能还有疾病啥的可重要啦。

这就像是探索一个小世界里的小秘密一样。

那要研究它呀，就得先把细胞从老鼠身体里分离出来，然后进行原代培养，最后还得鉴定一下是不是咱们想要的那种细胞。

这一套流程可有点复杂，但超级酷哦。

二、小鼠肝外胆管上皮细胞的分离。

1. 准备工作。

咱得先准备好小老鼠啦。

这小老鼠的选择也有讲究呢，要健康的，这样它的细胞才健康嘛。

然后就是各种工具，像超精细的手术器械，这就像是给细胞做手术的手术刀一样。

还有那些特殊的试剂，比如说能让细胞保持活性的试剂，这就像给细胞喝的营养水。

2. 解剖获取胆管组织。

把小老鼠麻醉后，就小心翼翼地开始解剖。

这时候可得像个超级细心的工匠一样，沿着肝脏找到肝外胆管。

这个胆管小小的，但是在显微镜下看可神奇了。

要把胆管完整地取出来，可不能伤到周围的组织，不然就可能影响到细胞的质量啦。

3. 细胞的释放。

取出来的胆管组织，还要用一些特殊的酶来处理，让胆管上皮细胞从组织里释放出来。

这就像把小种子从果实里剥出来一样。

这些酶的浓度和处理时间都要把握好，浓度高了或者时间长了，细胞可能就被破坏了，那就前功尽弃啦。

三、小鼠肝外胆管上皮细胞的原代培养。

1. 培养环境的准备。

得给细胞准备一个舒适的小窝，也就是培养皿啦。

培养皿里要铺上合适的基质，就像给细胞铺床一样。

这个基质要能让细胞很好地附着生长。

然后还要调好培养箱的温度、湿度和二氧化碳浓度，这就像给细胞创造一个合适的小气候。

温度不能高也不能低，湿度也要刚刚好，二氧化碳浓度也是关键因素呢。

2. 细胞接种。

把分离出来的细胞小心翼翼地接种到培养皿里。

这就像把小种子种到土里一样。

接种的密度也很重要，如果太密了，细胞之间就会互相抢营养，长不好；要是太稀了，又浪费资源。

3. 培养过程中的观察和维护。

在细胞培养的过程中，要像照顾小宝宝一样，经常去观察它们。

小鼠肝细胞原代培养+灌注我把我整理和收集战友的一些资料供你分享：材料：小鼠器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

操作步骤：1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。

2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。

3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。

4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。

6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。

7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。

8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。

10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

肝细胞生长不良涉及到细胞的取材、分离、纯化、培养条件，现分别介绍如下，首先介绍原代肝细胞的分离。

目前肝细胞的分离主要采用经典的改良的Salgon经门静脉插管两步灌流法分离肝细胞。

具体操作步骤如下：1: 供体肝脏的游离：选择Mercedes手术切口，即人字型切口，进入腹腔，暴露肝脏，分离肝脏镰状韧带、左、右三角韧带（为了便于手术，可以用生理盐水纱布将肝脏轻柔的向下牵引，并向两侧移动，显露膈下空间），解剖肝十二指肠韧带，确认胆总管，应尽可能靠近远心端结扎（从十二指肠后面进行）。

分离肝动脉，确认胃十二指肠动脉，并将其仔细结扎，但切勿影响肝动脉腔。

小鼠原代肝细胞分离方法引言：小鼠原代肝细胞分离是研究肝脏生理和病理过程中常用的实验手段。

本文将介绍一种常用的小鼠原代肝细胞分离方法，旨在为科研工作者提供参考和指导。

材料与仪器：- 小鼠- 75%乙醇- 磷酸盐缓冲盐水（PBS）- 培养基- 消化液- 离心管- 离心机- 显微镜- 细胞计数板方法：1. 准备工作a. 确保实验室环境干净，无细菌污染。

b. 消毒所需的仪器和材料，如离心管、培养皿等。

c. 准备所需的培养基和消化液，并将其预先加热至37℃。

2. 小鼠准备a. 使用75%乙醇对小鼠进行消毒，并将小鼠放置在消毒好的工作台上。

b. 使用显微镜观察小鼠的外部特征，确保小鼠健康无异常。

3. 小鼠肝脏采集a. 将小鼠固定在手术台上，用消毒的剪刀剪开腹腔。

b. 小心地将腹腔内的肝脏暴露出来，并使用消毒的注射器注入适量的PBS冲洗肝脏表面，以去除血液。

4. 肝脏消化a. 将肝脏放入含有预先加热至37℃的消化液的培养皿中。

b. 使用剪刀或刀片将肝脏切碎成小块，确保充分暴露细胞表面。

c. 将培养皿放入37℃恒温培养箱中，进行消化反应。

消化时间根据实验需要而定，通常为30-60分钟。

5. 细胞分离a. 用吸管轻轻吸取消化液中的细胞，转移到新的离心管中。

b. 将离心管放入离心机中，以1000rpm的速度离心5分钟，以沉淀细胞。

c. 倒掉上清液，保留细胞沉淀。

d. 加入适量的培养基，轻轻悬浮细胞，并进行细胞计数。

6. 细胞培养a. 将细胞悬浮液均匀地分配到预先消毒好的培养皿中。

b. 在37℃恒温培养箱中，以5% CO2的条件下培养细胞。

c. 定期观察细胞的形态和增长情况，并根据需要进行后续实验。

讨论：小鼠原代肝细胞分离是一项常见的实验技术，用于研究肝脏生理和病理过程。

本文介绍的方法是一种经典的分离方法，通过肝脏消化和离心沉淀的步骤，成功地获得了小鼠原代肝细胞。

该方法具有操作简单、高效可靠的特点，适用于多种实验需求。

小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。

分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。

注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。

小鼠原代肝细胞培养及细胞增殖的分子机制研究细胞增殖是生物体生长和发育的重要过程，也是生物体不断更新、修复和再生的关键环节。

肝脏是一个细胞增殖活跃的器官，在肝脏组织受到损伤时，原代肝细胞从G0期重新进入G1期，进行增殖复制，以恢复受损组织。

因此，研究原代肝细胞的培养和细胞增殖分子机制，对于治疗肝脏疾病和肿瘤有重要的意义。

一、小鼠原代肝细胞培养方法小鼠原代肝细胞培养可采取悬浮培养法或贴壁培养法，其中贴壁培养法是最常用的方法之一。

贴壁培养法分为单层培养和三维培养两种方式。

单层培养法是将小鼠肝细胞分离和培养在含有培养基和血清等营养物质的培养皿上，细胞可以黏附于培养皿底部形成单层肝细胞。

这种培养方法常用于细胞增殖和分化实验中。

三维培养法则是将肝细胞培养在类似于肝实质的支架中，使之形成三维结构，这种培养方法可用于肝脏疾病和肝细胞转化研究。

二、小鼠原代肝细胞增殖与细胞周期细胞增殖是一种高度有序的生物过程，受到一系列分子间相互作用的调节。

在小鼠原代肝细胞中，增殖过程主要分为细胞周期的四个时期：G1期、S期、G2期和M期。

其中，S期是DNA合成期，在这期间，DNA聚合酶启动并开始合成新的DNA链。

细胞周期主要受到细胞因子、信号转导途径和细胞周期蛋白等分子的调节。

其中CDK4和CDK6是G1期调节蛋白，它们与细胞周期蛋白D（CyclinD）结合，促进细胞从G1期进入S期。

细胞周期调节蛋白CDK1和CyclinB主要调节细胞从G2期进入M期。

同时，Tp53，Rb等一些肿瘤抑制蛋白也起到重要作用，它们在癌症等疾病中的失调造成了DNA损伤修复的延迟和细胞周期的异常。

三、小鼠原代肝细胞增殖的信号通路小鼠原代肝细胞增殖不仅受到细胞周期调节蛋白的调节，在信号通路的调节下也会发生变化。

目前已知的信号通路包括Wnt/β-catenin信号通路，TGF-β信号通路，VEGF信号通路等。

Wnt/β-catenin信号通路的激活可以促进小鼠原代肝细胞增殖，同时也与肝癌细胞的形成有关。

一种小鼠原代肝细胞的分离与培养方法
肖勋立;黄聪聪;武利雪;胡慧怡;何学珍;胡立业;喻理德
【期刊名称】《宜春学院学报》
【年(卷),期】2024(46)3
【摘要】目的:探索一种高效、稳定的小鼠原代肝细胞分离方法,并延长其体外培养的时间。

方法:取成年雄性C57BL/6小鼠,以含双抗的D-Hanks灌流液经肝门静脉充分灌注肝脏,然后以0.2 mg/mL的Ⅳ型胶原酶灌注消化,接着过滤、离心、洗涤,获得小鼠原代肝细胞。

通过台盼蓝染色检验小鼠原代肝细胞活率,利用倒置显微镜观察肝细胞的形态变化,糖原染色鉴定细胞纯度,添加ITS-X和HGF细胞因子延长小鼠原代肝细胞的体外培养时间。

结果:平均每只成年小鼠肝脏可提取获得原代肝细胞约2×107个,台盼蓝染色显示细胞活率均超过95%,糖原染色结果表明此方法获得的原代肝细胞纯度高于95%,通过添加HGF和ITS-X两种细胞因子能够有效地延长肝细胞形态的体外维持时间。

结论:本实验在原有小鼠原代肝细胞两步灌流分离法和培养的基础上,经过优化,成功建立了一种高效、稳定的小鼠原代肝细胞分离和培养方法,为肝脏的体外研究提供了技术保障。

【总页数】5页(P45-48)
【作者】肖勋立;黄聪聪;武利雪;胡慧怡;何学珍;胡立业;喻理德
【作者单位】井冈山大学附属医院药剂科;江西中医药大学药学院
【正文语种】中文
【中图分类】R331
【相关文献】
1.一种简易小鼠原代肝细胞分离方法
2.一种小鼠原代肝细胞培养方法
3.一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法
4.一种简化的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法
5.国际风电总承包项目里程碑付款计划设定分析
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1、小鼠肝脏Kupffer 细胞分离、纯化参照Tetsuya Abe等的方法并加以改进。

腹腔注射2%戊巴比妥钠（40mg/kg），沿腹部正中做一约2cm 的切口，完全暴露门静脉，经门静脉置入18G 套管针，置入位置约距离肝门1cm，插入约0.8cm，4-0 丝线固定后，立即剪开下腔静脉，用无钙灌注液进行灌注，灌注速度约为10ml/min,同时剪开上腔静脉，灌注过程见图 1.1、图1.2。

灌注5min，共灌注无钙灌注液50ml/只，灌注后肝脏体积膨大、颜色变浅，解剖剪分离取下肝脏，去除结缔组织及胆囊，在75%的酒精里漂洗5s，然后用PBS 漂洗三次，以防污染。

放到盛有PBS 的50ml 无菌瓶中，每批细胞需要灌注3-5 只小鼠。

待所有小鼠肝脏灌注好之后，一起放到细胞培养皿中，用眼科剪剪碎，加入0.1% 四型胶原酶，每只约需5ml，放至37℃CO2培养箱，消化一小时，摇匀一次/15 min，并用移液枪轻轻吹打1min。

待组织块消化完全，细胞基本散落形成细胞悬液后，过350 目滤网2 次，以去除未消化的组织块和结缔组织。

用15ml 离心管收集细胞悬液，300 rpm×3 min，离心两次，收集上清，可以去除大部分的小鼠肝脏细胞。

然后，1500 rpm×5 min，弃上清，收集沉淀，用含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640 培养基悬浮细胞沉淀。

Percoll不连续密度梯度离心，2000g×20min，4℃；各层为上：细胞悬液2ml，中：25%Percoll 3ml，下：50%Percoll 3ml（用15ml 离心管，2-3 管/只）。

先将50%的Percoll液3ml 置于离心管底部，再沿着离心管管壁缓慢加入25%Percoll3ml在50%Percoll 液上面，最后沿着管壁缓慢加入细胞悬液2ml 于最上层，见图1.3 。

离心后可见四层区带：最上一层为细胞碎片；第二层为富含肝窦内皮细胞的区带；第三层为富含Kupffer 细胞的区带；第四层为积于管底的沉淀，主要是红细胞，见图1.4 。