小鼠原代肝细胞的分离与培养

小鼠提原代肝细胞原理
小鼠提原代肝细胞是一种实验室技术，用于研究和探索肝脏生物学和疾病机制。

其原理主要包括以下几个步骤：
1. 鼠标准备：选取适合的小鼠作为实验对象，例如常用的实验小鼠品种如C57BL/6等。

2. 消化和分离：通过注射合适的麻醉药物使小鼠进入无意识状态，然后进行腹腔解剖，取出肝脏组织。

将肝脏组织切碎并进行酶消化，将肝细胞从其他细胞分离出来。

3. 培养和传代：将分离得到的原代肝细胞放入适当的培养基中，并提供适宜的营养物质和环境条件，使其在培养皿中继续生长和增殖。

当细胞充分增殖并达到一定密度时，可以进行传代，即将细胞从原培养皿中分离并重新分配到新的培养皿中。

4. 鉴定和确认：对传代后的细胞进行鉴定和确认，例如通过形态学观察、细胞计数、细胞功能检测等方法，确保细胞的纯度和活性。

同时，可使用特异性标记物如肝细胞特异性蛋白等进行免疫染色，确认细胞的特异性。

通过小鼠提原代肝细胞，科研人员可以获得高质量的原代肝细胞样本，用于开展各种疾病模型、药物筛选和机制研究等实验。

该技术为肝脏疾病的治疗和预防提供了重要的实验基础。

小鼠肝外胆管上皮细胞的分离、原代培养及鉴定方法一、引言。

小伙伴们，今天咱们来聊聊小鼠肝外胆管上皮细胞这个超有趣的话题呢。

研究这个细胞对于了解肝脏相关的生理机能还有疾病啥的可重要啦。

这就像是探索一个小世界里的小秘密一样。

那要研究它呀，就得先把细胞从老鼠身体里分离出来，然后进行原代培养，最后还得鉴定一下是不是咱们想要的那种细胞。

这一套流程可有点复杂，但超级酷哦。

二、小鼠肝外胆管上皮细胞的分离。

1. 准备工作。

咱得先准备好小老鼠啦。

这小老鼠的选择也有讲究呢，要健康的，这样它的细胞才健康嘛。

然后就是各种工具，像超精细的手术器械，这就像是给细胞做手术的手术刀一样。

还有那些特殊的试剂，比如说能让细胞保持活性的试剂，这就像给细胞喝的营养水。

2. 解剖获取胆管组织。

把小老鼠麻醉后，就小心翼翼地开始解剖。

这时候可得像个超级细心的工匠一样，沿着肝脏找到肝外胆管。

这个胆管小小的，但是在显微镜下看可神奇了。

要把胆管完整地取出来，可不能伤到周围的组织，不然就可能影响到细胞的质量啦。

3. 细胞的释放。

取出来的胆管组织，还要用一些特殊的酶来处理，让胆管上皮细胞从组织里释放出来。

这就像把小种子从果实里剥出来一样。

这些酶的浓度和处理时间都要把握好，浓度高了或者时间长了，细胞可能就被破坏了，那就前功尽弃啦。

三、小鼠肝外胆管上皮细胞的原代培养。

1. 培养环境的准备。

得给细胞准备一个舒适的小窝，也就是培养皿啦。

培养皿里要铺上合适的基质，就像给细胞铺床一样。

这个基质要能让细胞很好地附着生长。

然后还要调好培养箱的温度、湿度和二氧化碳浓度，这就像给细胞创造一个合适的小气候。

温度不能高也不能低，湿度也要刚刚好，二氧化碳浓度也是关键因素呢。

2. 细胞接种。

把分离出来的细胞小心翼翼地接种到培养皿里。

这就像把小种子种到土里一样。

接种的密度也很重要，如果太密了，细胞之间就会互相抢营养，长不好；要是太稀了，又浪费资源。

3. 培养过程中的观察和维护。

在细胞培养的过程中，要像照顾小宝宝一样，经常去观察它们。

小鼠肝细胞原代培养+灌注我把我整理和收集战友的一些资料供你分享：材料：小鼠器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

操作步骤：1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。

2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。

3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。

4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。

6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。

7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。

8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。

10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

肝细胞生长不良涉及到细胞的取材、分离、纯化、培养条件，现分别介绍如下，首先介绍原代肝细胞的分离。

目前肝细胞的分离主要采用经典的改良的Salgon经门静脉插管两步灌流法分离肝细胞。

具体操作步骤如下：1: 供体肝脏的游离：选择Mercedes手术切口，即人字型切口，进入腹腔，暴露肝脏，分离肝脏镰状韧带、左、右三角韧带（为了便于手术，可以用生理盐水纱布将肝脏轻柔的向下牵引，并向两侧移动，显露膈下空间），解剖肝十二指肠韧带，确认胆总管，应尽可能靠近远心端结扎（从十二指肠后面进行）。

分离肝动脉，确认胃十二指肠动脉，并将其仔细结扎，但切勿影响肝动脉腔。

小鼠原代肝细胞分离方法引言：小鼠原代肝细胞分离是研究肝脏生理和病理过程中常用的实验手段。

本文将介绍一种常用的小鼠原代肝细胞分离方法，旨在为科研工作者提供参考和指导。

材料与仪器：- 小鼠- 75%乙醇- 磷酸盐缓冲盐水（PBS）- 培养基- 消化液- 离心管- 离心机- 显微镜- 细胞计数板方法：1. 准备工作a. 确保实验室环境干净，无细菌污染。

b. 消毒所需的仪器和材料，如离心管、培养皿等。

c. 准备所需的培养基和消化液，并将其预先加热至37℃。

2. 小鼠准备a. 使用75%乙醇对小鼠进行消毒，并将小鼠放置在消毒好的工作台上。

b. 使用显微镜观察小鼠的外部特征，确保小鼠健康无异常。

3. 小鼠肝脏采集a. 将小鼠固定在手术台上，用消毒的剪刀剪开腹腔。

b. 小心地将腹腔内的肝脏暴露出来，并使用消毒的注射器注入适量的PBS冲洗肝脏表面，以去除血液。

4. 肝脏消化a. 将肝脏放入含有预先加热至37℃的消化液的培养皿中。

b. 使用剪刀或刀片将肝脏切碎成小块，确保充分暴露细胞表面。

c. 将培养皿放入37℃恒温培养箱中，进行消化反应。

消化时间根据实验需要而定，通常为30-60分钟。

5. 细胞分离a. 用吸管轻轻吸取消化液中的细胞，转移到新的离心管中。

b. 将离心管放入离心机中，以1000rpm的速度离心5分钟，以沉淀细胞。

c. 倒掉上清液，保留细胞沉淀。

d. 加入适量的培养基，轻轻悬浮细胞，并进行细胞计数。

6. 细胞培养a. 将细胞悬浮液均匀地分配到预先消毒好的培养皿中。

b. 在37℃恒温培养箱中，以5% CO2的条件下培养细胞。

c. 定期观察细胞的形态和增长情况，并根据需要进行后续实验。

讨论：小鼠原代肝细胞分离是一项常见的实验技术，用于研究肝脏生理和病理过程。

本文介绍的方法是一种经典的分离方法，通过肝脏消化和离心沉淀的步骤，成功地获得了小鼠原代肝细胞。

该方法具有操作简单、高效可靠的特点，适用于多种实验需求。

小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。

分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。

注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。

小鼠原代肝细胞培养及细胞增殖的分子机制研究细胞增殖是生物体生长和发育的重要过程，也是生物体不断更新、修复和再生的关键环节。

肝脏是一个细胞增殖活跃的器官，在肝脏组织受到损伤时，原代肝细胞从G0期重新进入G1期，进行增殖复制，以恢复受损组织。

因此，研究原代肝细胞的培养和细胞增殖分子机制，对于治疗肝脏疾病和肿瘤有重要的意义。

一、小鼠原代肝细胞培养方法小鼠原代肝细胞培养可采取悬浮培养法或贴壁培养法，其中贴壁培养法是最常用的方法之一。

贴壁培养法分为单层培养和三维培养两种方式。

单层培养法是将小鼠肝细胞分离和培养在含有培养基和血清等营养物质的培养皿上，细胞可以黏附于培养皿底部形成单层肝细胞。

这种培养方法常用于细胞增殖和分化实验中。

三维培养法则是将肝细胞培养在类似于肝实质的支架中，使之形成三维结构，这种培养方法可用于肝脏疾病和肝细胞转化研究。

二、小鼠原代肝细胞增殖与细胞周期细胞增殖是一种高度有序的生物过程，受到一系列分子间相互作用的调节。

在小鼠原代肝细胞中，增殖过程主要分为细胞周期的四个时期：G1期、S期、G2期和M期。

其中，S期是DNA合成期，在这期间，DNA聚合酶启动并开始合成新的DNA链。

细胞周期主要受到细胞因子、信号转导途径和细胞周期蛋白等分子的调节。

其中CDK4和CDK6是G1期调节蛋白，它们与细胞周期蛋白D（CyclinD）结合，促进细胞从G1期进入S期。

细胞周期调节蛋白CDK1和CyclinB主要调节细胞从G2期进入M期。

同时，Tp53，Rb等一些肿瘤抑制蛋白也起到重要作用，它们在癌症等疾病中的失调造成了DNA损伤修复的延迟和细胞周期的异常。

三、小鼠原代肝细胞增殖的信号通路小鼠原代肝细胞增殖不仅受到细胞周期调节蛋白的调节，在信号通路的调节下也会发生变化。

目前已知的信号通路包括Wnt/β-catenin信号通路，TGF-β信号通路，VEGF信号通路等。

Wnt/β-catenin信号通路的激活可以促进小鼠原代肝细胞增殖，同时也与肝癌细胞的形成有关。

一种小鼠原代肝细胞的分离与培养方法
肖勋立;黄聪聪;武利雪;胡慧怡;何学珍;胡立业;喻理德
【期刊名称】《宜春学院学报》
【年(卷),期】2024(46)3
【摘要】目的:探索一种高效、稳定的小鼠原代肝细胞分离方法,并延长其体外培养的时间。

方法:取成年雄性C57BL/6小鼠,以含双抗的D-Hanks灌流液经肝门静脉充分灌注肝脏,然后以0.2 mg/mL的Ⅳ型胶原酶灌注消化,接着过滤、离心、洗涤,获得小鼠原代肝细胞。

通过台盼蓝染色检验小鼠原代肝细胞活率,利用倒置显微镜观察肝细胞的形态变化,糖原染色鉴定细胞纯度,添加ITS-X和HGF细胞因子延长小鼠原代肝细胞的体外培养时间。

结果:平均每只成年小鼠肝脏可提取获得原代肝细胞约2×107个,台盼蓝染色显示细胞活率均超过95%,糖原染色结果表明此方法获得的原代肝细胞纯度高于95%,通过添加HGF和ITS-X两种细胞因子能够有效地延长肝细胞形态的体外维持时间。

结论:本实验在原有小鼠原代肝细胞两步灌流分离法和培养的基础上,经过优化,成功建立了一种高效、稳定的小鼠原代肝细胞分离和培养方法,为肝脏的体外研究提供了技术保障。

【总页数】5页(P45-48)
【作者】肖勋立;黄聪聪;武利雪;胡慧怡;何学珍;胡立业;喻理德
【作者单位】井冈山大学附属医院药剂科;江西中医药大学药学院
【正文语种】中文
【中图分类】R331
【相关文献】
1.一种简易小鼠原代肝细胞分离方法
2.一种小鼠原代肝细胞培养方法
3.一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法
4.一种简化的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法
5.国际风电总承包项目里程碑付款计划设定分析
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1、小鼠肝脏Kupffer 细胞分离、纯化参照Tetsuya Abe等的方法并加以改进。

腹腔注射2%戊巴比妥钠（40mg/kg），沿腹部正中做一约2cm 的切口，完全暴露门静脉，经门静脉置入18G 套管针，置入位置约距离肝门1cm，插入约0.8cm，4-0 丝线固定后，立即剪开下腔静脉，用无钙灌注液进行灌注，灌注速度约为10ml/min,同时剪开上腔静脉，灌注过程见图 1.1、图1.2。

灌注5min，共灌注无钙灌注液50ml/只，灌注后肝脏体积膨大、颜色变浅，解剖剪分离取下肝脏，去除结缔组织及胆囊，在75%的酒精里漂洗5s，然后用PBS 漂洗三次，以防污染。

放到盛有PBS 的50ml 无菌瓶中，每批细胞需要灌注3-5 只小鼠。

待所有小鼠肝脏灌注好之后，一起放到细胞培养皿中，用眼科剪剪碎，加入0.1% 四型胶原酶，每只约需5ml，放至37℃CO2培养箱，消化一小时，摇匀一次/15 min，并用移液枪轻轻吹打1min。

待组织块消化完全，细胞基本散落形成细胞悬液后，过350 目滤网2 次，以去除未消化的组织块和结缔组织。

用15ml 离心管收集细胞悬液，300 rpm×3 min，离心两次，收集上清，可以去除大部分的小鼠肝脏细胞。

然后，1500 rpm×5 min，弃上清，收集沉淀，用含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640 培养基悬浮细胞沉淀。

Percoll不连续密度梯度离心，2000g×20min，4℃；各层为上：细胞悬液2ml，中：25%Percoll 3ml，下：50%Percoll 3ml（用15ml 离心管，2-3 管/只）。

先将50%的Percoll液3ml 置于离心管底部，再沿着离心管管壁缓慢加入25%Percoll3ml在50%Percoll 液上面，最后沿着管壁缓慢加入细胞悬液2ml 于最上层，见图1.3 。

离心后可见四层区带：最上一层为细胞碎片；第二层为富含肝窦内皮细胞的区带；第三层为富含Kupffer 细胞的区带；第四层为积于管底的沉淀，主要是红细胞，见图1.4 。

一、实验目的1. 掌握小鼠原代肝细胞的分离和培养方法；2. 了解肝细胞在体外培养过程中的生物学特性；3. 探讨肝细胞培养条件对细胞生长和功能的影响。

二、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠（体重20-25g）；2. 培养基：RPMI 1640培养基（含10%新生牛血清、1%双抗、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺）；3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、0.2%胶原酶、台盼蓝染色液；4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、离心机、培养箱等。

三、实验方法1. 小鼠原代肝细胞的分离（1）处死小鼠，取出肝脏；（2）将肝脏放入含有RPMI 1640培养基的培养皿中，用剪刀剪成1mm³左右的小块；（3）加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化10min；（4）加入0.2%胶原酶，37℃水浴消化30min；（5）消化过程中每隔5min轻轻摇动培养皿，使肝细胞充分释放；（6）消化结束后，将消化液过滤，收集肝细胞悬液；（7）用RPMI 1640培养基洗涤肝细胞悬液2次，去除未消化的组织碎片；（8）将肝细胞悬液离心（1000r/min，5min），弃去上清液；（9）用RPMI 1640培养基重悬肝细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。

2. 肝细胞培养（1）将肝细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；（2）每隔2-3天更换新鲜培养基；（3）观察肝细胞的生长情况，记录细胞贴壁、伸长、伪足形成等过程；（4）利用台盼蓝染色法检测细胞存活率；（5）观察肝细胞在培养过程中的形态学变化。

3. 肝细胞功能检测（1）收集培养24h后的肝细胞，用RPMI 1640培养基洗涤2次；（2）加入0.5%台酚蓝染液，37℃水浴染色30min；（3）用RPMI 1640培养基洗涤细胞，去除未结合的染料；（4）用酶标仪检测吸光度（A）值，计算肝细胞对台酚蓝的摄取量。

四、实验结果1. 肝细胞分离与培养（1）分离得到的肝细胞形态为圆形、椭圆形或不规则形，细胞核清晰可见；（2）细胞存活率约为64.1%；（3）细胞在培养过程中呈典型的上皮样细胞形态，胞浆内有空泡和脂滴，相邻细胞伸长的伪足相互连接。

小鼠原代肝细胞提取步骤1. 引言1.1 背景介绍小鼠原代肝细胞是一种非常重要的细胞类型，可以用于研究肝脏相关的生物学问题。

肝脏是人体最大的内脏器官，具有重要的生理功能，如代谢、解毒、合成蛋白等。

研究小鼠原代肝细胞提取方法对于深入了解肝脏生理功能具有重要意义。

在过去的研究中，科学家们通过提取小鼠原代肝细胞，成功地模拟了肝脏在体内的功能，为肝脏疾病的研究提供了重要工具。

小鼠原代肝细胞也被广泛应用于肝脏细胞培养、药物代谢与毒性研究等领域。

小鼠原代肝细胞的提取方法的改进和优化对于促进相关领域的发展具有积极作用。

通过对小鼠原代肝细胞提取方法进行研究，可以更好地理解肝脏生理功能、疾病发生机制以及药物代谢途径。

优化提取方法，提高细胞纯度和活力，将有助于更精确地进行实验研究，为临床治疗提供更有效的参考依据。

在这一背景下，研究小鼠原代肝细胞提取方法具有重要的意义和应用前景。

1.2 研究意义小鼠是常用的实验动物之一，其肝脏细胞具有一定的再生能力，并且与人类的肝脏细胞在生物学特性上有很多相似之处。

小鼠原代肝细胞提取具有重要的研究意义。

通过对小鼠原代肝细胞的提取和培养，可以更好地研究肝脏细胞的生长、增殖和功能。

这对于深入了解肝脏生理功能、疾病发生机制以及药物代谢具有重要意义。

小鼠原代肝细胞的提取可以为基因编辑技术、药物筛选等研究提供重要的工具和平台。

通过对小鼠原代肝细胞的提取和培养，可以更好地模拟体内情况，从而加深对相关疾病的认识、寻找新的治疗方法。

小鼠原代肝细胞的提取对于肝脏生物学研究和药物研发具有重要的意义，有助于推动相关领域的进步和发展。

2. 正文2.1 小鼠原代肝细胞提取前准备工作小鼠原代肝细胞提取前准备工作是成功提取肝细胞的关键步骤之一，其主要目的是为了确保提取到的肝细胞具有较高的活力和纯度。

在进行肝细胞提取前，需要进行以下准备工作：1. 选择合适的小鼠模型：选择健康、年龄相仿的小鼠作为实验材料，确保实验结果的可靠性。

1、在前一天晚上铺三明治培养基的下层胶：100ml超纯水+114ul冰醋酸，然后到细胞房超净台用0.22um的滤膜过滤后加入1.6ml 的I型鼠尾胶原后铺板6-well plate：1000ul12-well plate：500ul24-well plate：250ul96-well plate：30ul铺板后晃荡混匀，打开盖子置于超净台中，开紫外灯过夜，第二天吸弃上层液体，收起plate备用（若要放置长时间，则要用封口膜）；2、在前一天确认buffer1、beffer2（未加酶）是否准备好Buffer1：1*EBSS，0.5mM EGTA，无Ca、Mg；Buffer2：1*EBSS，0.2mg/ml 胶原酶IV，10mM HEPES（500ml；1.191g），2mM CaCl（500ml；0.11g）两种buffer都用NaHCO3调pH至7.3~7.5，不可低于7.3；3、当天上午器材灭菌，两个铁饭盒，one for剪刀，小镊子，橡胶管，细线，another for三个筛子，2把弯头镊子,1把剪刀；两个fisher瓶子装过滤后的buffer1,buffer2；4、准备30ml的WEM（或DMEM）置于4°，盛放剥下的肝脏；预先打开37°水浴槽两个；buffer1,buffer2过滤除菌，并置于37°中预热；检查泵是否正常工作；※灌流一只20g左右的小鼠肝脏，buffer1需100ml即够，buffer2需60ml，加0.18mg/ml 的胶原酶IV。

5、解剖腹腔与胸腔之间的部分，找到门静脉顺行插管，（橡皮管内径为4.8mm），先用buffer1灌注，调节流速为3.1rpm（约5ml/min），灌流6min。

然后用buffer2，调节流速为3.1rpm，将60mlbuffer2灌完（最好控制在8min内）；6、剪下肝脏组织放至预先放在4°冰箱的WEM中；去细胞房预冷离心机7、准备4-5个10cm dish，将肝脏并WEM一并倒入dish清洗一下，转入倒有DMEM的dish中，用镊子轻轻撕去肝脏表面一层膜（撕时要抖动，以便干细胞掉下来），再将肝脏转入新dish中继续撕；8、将dish中的细胞悬液倒入筛子中，用新dish盛接，筛下来的细胞悬液转移至50ml离心管；9、初步离心，50g，2min，4°，吸弃上清；离心过程中配制梯度离心液：5ml 10*PBS + 45ml percoll + 50ml DMEM10、加25ml梯度离心液重悬（先加2ml重悬，再补加）：1500rpm 8min，4°，吸弃上清；离心过程中配制PM液11、加30ml DMEM重悬50g，2min，4°，吸弃上清；12、重复步骤11（可不重复）；13、加入PM 5ml（根据细胞量来决定加多少），混匀后计数6孔板，2ml，5*10E5个/ml14、4h后换PM液（PM要预热）24h后换成FM液（若铺上胶则不能预热）。

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法1材料与方法1.1动物2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。

1.2试剂D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。

1.3鼠肝组织块培养1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。

2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。

5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。

待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。

1.4鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。

小鼠肝细胞原代培养实验具体方法及步骤将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

具体步骤1. 将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。

2. 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS液的平皿中。

3. 用手术剪将脏器剪成小块（大小约1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心（1 000 rpm，5 min）。

4. 视组织或细胞量加入5-6倍（3-5 ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5. 加入3-5 ml含血清的培养液以中止胰酶消化作用。

6. 用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。

7. 再次离心5 min，弃上清液。

8. 加入无血清培养液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9. 加入含血清的培养液1-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。

10. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

注意1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。

细胞计数可在有菌环境中进行。

2. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。

3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞盖住，以防止细菌落入。

4. 操作前要洗手，进入超净工作台后要用75％酒精或0.2％新洁尔灭擦拭手。

试剂瓶口也要擦拭。

5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼。

金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，且冷却后才能夹取组织。

吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。

6. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

7. 不能用手触及消毒器皿的工作部分，工作台面上的用品摆放要布局合理。

8. 瓶子开口后要尽量保持45°斜位。

9. 吸溶液的吸管等不能混用。

矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。

如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。

㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。

(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。

如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。

对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。

二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。

2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。

㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。

2、矿产品价格稳定性及变化趋势。

三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。

2、矿区矿产资源概况。

3、该设计与矿区总体开发的关系。

㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。

2、矿床开采技术条件及水文地质条件。