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单核细胞处理过程以下将详细介绍单核细胞的处理过程，主要包括细胞分离、纯化和保存等步骤。
1. 细胞分离：单核细胞通常从外周血、骨髓或者组织中获得。
对于外周血单核细胞的分离，常用的方法有密度梯度离心和磁珠分离。
密度梯度离心是通过在离心过程中离心介质的密度差异，将单核细胞分离出来。
常用的离心介质如Ficoll-Hypaque。
磁珠分离是通过将针对单核细胞特异性抗体（如CD14抗体）结合在磁珠上，然后将其与细胞混合，利用磁力将单核细胞与其他细胞分开。
2.细胞纯化：分离得到的单核细胞通常含有其他细胞类型的污染物，如红细胞、淋巴细胞和血小板。
为了提高单核细胞的纯度，可以使用巨噬细胞亲和柱或负选择方法进一步纯化。
巨噬细胞亲和柱是一种利用巨噬细胞表面表达的特定受体与抗体结合的纯化方法。
常用的巨噬细胞亲和柱有CD14柱，可以高效地将单核细胞纯化。
负选择方法则通过使用针对非单核细胞特异性抗体和磁珠结合，将非单核细胞选择性地去除。
3.细胞保存：为了进行后续的实验操作或长期保存，单核细胞需要被储存。
常用的保存方法有冷冻和低温保存。
冷冻保存是将单核细胞在冷冻液中快速冷冻并保存在液氮或者低温冰箱中。
常用的冷冻液为含有10%二甲基亚砜（DMSO）和90%胎牛血清的培养基。
低温保存是将单核细胞在低温液态氮中保存，可以避免冷冻和解冻过程对细胞的损伤。
4.细胞培养：单核细胞可以通过培养来进一步研究其生物学特性和功能。
常用的培养基为RPMI1640，其中添加胎牛血清、抗生素和细胞增殖剂等。
为了促进巨噬细胞的分化，还可以添加刺激因子，如大肠杆菌脂多糖（LPS）。
培养过程中，需要定期更换培养基并观察细胞的生长情况。
5.细胞实验：处理得到的单核细胞可以用于各种实验，如流式细胞术、酶联免疫吸附实验（ELISA）和功能实验等。
例如，流式细胞术可以用于检测单核细胞表面分子的表达水平，从而研究其分化和激活状态。
ELISA可以用于检测细胞培养上清液中的细胞因子水平。
密度梯度离心法分离细胞器顺序
密度梯度离心法分离细胞器有多种不同方法和顺序，以下是其中两种常见的方法：
1.Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法。
其分布由上到下依次为：稀释的血浆层和血小板层、单个核细胞层、粒细胞层和红细胞层。
2.Percoll分层液法：是连续密度梯度离心分离法，由上到下依次为：死细胞层和血小板层、血浆层、富含单核细胞组分层、富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。
Percoll分层液法是纯化分离单核细胞和淋巴细胞的一种较好方法。
外周血单个核细胞的分离
概述
外周血单个核细胞是一种白细胞。
通过分离单个核细胞，可以进行多种分子生物学实验和临床应用。
本文将介绍两种分离外周血单个核细胞的方法。
方法
密度梯度离心
1.将外周血收集到 EDTA 管中。
2.将 3 毫升 Ficoll-Paque™ PLUS 加入到 15 毫升离心管中。
3.轻轻加入同等体积的外周血到离心管，保持液面平整。
4.以 400g 的速度离心 40 分钟。
在离心温度达到室温前离心室门不得
打开。
5.用温和的力度将上清液吸出到新的离心管中，并在 1200g 的速度下
洗涤 2-3 次。
6.已经分离的单个核细胞可以在非抗凝血样上重悬。
此过程中加入生长
培养基以维持细胞质稳定。
磁性负选择法
1.将外周血收集到 EDTA 管中。
2.加入红细胞淋巴细胞分离液，根据厂家指南染色。
3.加入磁性微珠混合液，使单个核细胞与微珠组合。
4.放入磁场中过滤掉未与微珠组合的细胞及其他血细胞。
5.经过多次洗涤和离心，单个核细胞可以在非抗凝血样上重悬。
此过程
中加入生长培养基以维持细胞质稳定。
密度梯度离心法和磁性负选择法是分离外周血单个核细胞的两种有效方法。
这些方法对于多种分子生物学实验和临床应用都非常有用。
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
密度梯度离心法分离血液单个核细胞14级拔尖赵子杰 141270054一．实验目的1.掌握密度梯度离心法。
2.进一步熟练显微镜的细胞观察方法。
二．实验原理1.血液单个核细胞分离原理外周血细胞由密度不同的红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、血小板等组成。
对人血液来讲，其中红细胞密度最大，为1.09~1.11g/L；粒细胞密度次之，为1.080~1.092g/L；单核细胞、淋巴细胞及NK细胞密度相近，为1.050~1.077g/L；血小板密度最小，只有1.030~1.060g/L；将其中的单核细胞、淋巴细胞、NK细胞等统称为外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC）。
图1：血细胞分类当将稀释的抗凝血叠加于适宜密度（与单个核细胞密度相近）的淋巴细胞分离液之上，经适当的离心力离心一段时间后，不同种类细胞因密度而分布于离心管的不同位置，红细胞和粒细胞密度大于分层液，沉积于管底；血小板则因密度小而悬浮在血浆中；其中与分层液密度相当的单个核细胞分布在血浆层和分层液之间的界面。
图2：分离液分离原理2.显微镜操作技巧（1）旋转物镜转换器到10×物镜，先将粗调焦螺旋外旋，使标本升至最高点。
（2）一边用眼睛通过目镜观测标本，一边逐渐向内旋转粗调焦螺旋，直至视野中出现晃动的液体，观测细胞即在其中。
（3）如视野中细胞太小，转换物镜至40×高倍镜，一般稍微向外旋转微调焦螺旋即可看到清晰的物像。
三．实验器材1.肝素抗凝鸡血：先给注射器中吸入0.1mL 180IU／mL肝素钠溶液，鸡翅下静脉采血5mL。
2.10mL低速离心机。
3.托盘天平。
4.10mL离心管。
5.胶头滴管。
6.40mL小烧杯等。
四．实验试剂1.肝素钠溶液：用生理盐水配成180IU/mL。
2.D-Hanks液。
3.人淋巴细胞分离液：市售。
20℃时密度应为（1.077±0.001）g/L。
密度梯度离心法分离脐血单个核细胞方法的优化任思坡;吴秀娟;罗小虎;李全双;韩光宇;谭昆;拾莉;耿跃春【期刊名称】《现代检验医学杂志》【年(卷),期】2012(027)001【摘要】目的对密度梯度离心法分离脐血单个核细胞的方法进行优化,以提高该方法分离脐血单个核细胞的收率.方法脐血40份,每份40 ml,分为常规组和优化组,每组20份.常规组脐血与NS1∶1混合稀释后,直接通过Ficoll分离液分离单个核细胞；优化组通过先将脐血洗涤一次,加入等量NS充分吹打混匀,200目筛网过滤,保持细胞悬液和Ficoll分离液1:1的体积比进行分离操作.对每份分离得到的脐血单个核细胞通过白细胞稀释液稀释后计数.结果常规组分离后的白膜层有11份界面不清晰,同时均混有少量的红细胞.优化组分离后的白膜层有1份界面不清晰,仅有极少的红细胞混入.两种方法收集的脐血单个核细胞数比较,优化组多于常规组(P＜0.01).结论通过对密度梯度离心法的步骤进行优化,可提高脐血单个核细胞的分离效果.【总页数】3页(P101-103)【作者】任思坡;吴秀娟;罗小虎;李全双;韩光宇;谭昆;拾莉;耿跃春【作者单位】徐州市医学科学研究所,江苏徐州221006;徐州医学院,江苏徐州221002;徐州医学院,江苏徐州221002;徐州市医学科学研究所,江苏徐州221006;徐州市医学科学研究所,江苏徐州221006;徐州市医学科学研究所,江苏徐州221006;徐州市医学科学研究所,江苏徐州221006;徐州市医学科学研究所,江苏徐州221006【正文语种】中文【中图分类】R446.113【相关文献】1.密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞方法的优化 [J], 郝洪波;任思坡;谢晓东2.密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞方法的优化 [J], 郝洪波;任思坡;谢晓东;3.Ficoll密度梯度离心法分离腹水单个核细胞方法的优化 [J], 杨永强;张巧玲4.密度梯度离心法分离单采浓缩白细胞悬液中单个核细胞方法探讨 [J], 王富英; 廖群艳5.Ficoll密度梯度离心法分离猪外周血单个核细胞条件的探讨 [J], 张素华;林丹丹;张美娟;陈雪松;徐进梅;单昊;吴观陵;吴海玮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
密度梯度离心法分离P B M C 操作流程(总2页)本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March密度梯度离心法分离PBMC1.在15mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液Ficoll。
2.取5mL抗凝静脉血与5mL无菌PBS按照1：1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，动作一定要轻，注意保持清楚的界面。
外周血，PBS，淋巴细胞分离液最终体积比为1：1：1。
3. 水平离心400g×30分钟。
（注意：为保证分离效果，需将离心机升降速率调至最低，即升速为1，降速为0，这样调整后，升降速会比较慢，总体离心时间约为1小时。
）4.离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。
在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
此外，还含有血小板。
血浆和PBS单个核细胞淋巴细胞分离液红细胞和粒细胞5.去除部分上层液体（用移液管吸取，不可倾倒），余下约1mL，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。
置入另一15mL离心管中，加入5倍以上体积的PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。
6.末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞，可根据情况适量增减时间。
7. 加入10mL PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。
8. 末次离心后，弃上清，加入含有10%FBS的RPMI1640，重悬细胞，计数，计算细胞活力。
用本法分离PBMC，每1mL全血可分离得到1~2×106 PBMC，不同人个体之间存在一定差异。
活细胞百分率在95％以上。
注意：1.所有操作都应在无菌条件下进行。
2.在分离前Ficoll和PBS等试剂均需在37℃恒温水浴中预热半小时以上。
3.吸取单个核细胞时不可避免会吸到Ficoll，而Ficoll密度比细胞要大，因此步骤5中需加入足量PBS稀释，若PBS体积太小可能会导致细胞无法离心收集。
密度梯度离心法分离淋巴细胞实验报告1、实验目的掌握密度梯度法分离单个核淋巴细胞2、实验原理红细胞和多核白细胞的比重（1.092左右）比淋巴细胞的比重（1.075-1.090）大，因此利用一种比重介于1.075~1.092之间的等渗溶液（淋巴细胞分离液）作密度梯度离心，使不同比重的细胞按不同的密度梯度分布。
3、实验试剂和器材Balb/c鼠，1640培养基，淋巴细胞分离液，镊子，剪刀，金属网，研棒，平皿，枪头、15ml离心管、移液器、离心机、白瓷盘、酒精棉球、烧杯。
4、实验步骤1、对Balb/c鼠先用摘眼球放血并拉脊椎处死。
2、用酒精棉球擦拭小鼠腹部，用剪刀和镊子在腹部剪开一个小口，用手撕开小鼠的皮毛，使肌肉裸露，用剪刀和镊子剪开肌肉，取脾脏。
去除血细胞及脂肪组织，用2ml 1640进行清洗。
3、将清洗过的脾脏放到置于平皿中的金属网上，先加入1ml 1640，用研磨棒压碎脾脏成单细胞，补加2ml 1640冲洗金属网。
4、将研磨的单细胞悬液小心的靠壁滴加入5ml体积的淋巴细胞分离液的液面上（小心不破坏淋巴细胞分离液液面），2000r/min，离心20min，此时离心管中由上至下细胞分四层。
用枪头小心吸取第二层的环状乳白色淋巴细胞层，放入加入了约10ml的PBS的离心管中，充分混匀，1500r/min，离心5min，弃上清。
剩余约100ul PBS，重悬，混匀，即得淋巴细胞悬液。
5、实验结果1、离心后溶液分为四层，最上层为粉红色澄清液体，第二层处于分界处，稍微发白模糊，第三层为透明状液体，有少量絮状漂浮物，最下层为深红色沉淀。
2、最后得到的淋巴细胞悬液较为浑浊，颜色发白。
6、实验分析及讨论（一）实验讨论1、淋巴细胞分离液看起来是无色透明的，实际上由两种糖分构成，具有梯度，故可以对淋巴细胞产生分离作用。
2、再去脾脏前要确保小鼠已被处死，避免小鼠挣扎造成污染。
3、在解剖前用酒精棉球擦拭小鼠腹部，即可起到消毒作用，又可以弄湿鼠毛露出皮肤，方便解剖。
