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E-mail:hljxmsy@Heilongjiang Xumu Shouyi2009年10月（下）1超声波诊断法主要有A 型超声波诊断仪、多普勒（Doppler ）超声诊断仪（D 型仪）和B 型超声波诊断仪。
用A 型超声波诊断仪对奶牛妊娠60天以后才能做出诊断。
在20世纪70年代A 超技术曾备受青睐，目前已很少应用。
D 型超声波诊断仪可通过测定胎儿和母体血流量、胎动等做较早期的诊断。
将A 型和D 型仪联合使用，可得到既早又准确的结果。
B 型超声波诊断仪可通过探查胎体、胎水、胎心搏动及胎盘等来判断妊娠阶段、胎儿数、胎儿性别及胎儿状态等。
对牛可在配种后24天探测到胚胎。
2乳胶珠凝集抑制试验乳胶珠凝集抑制试验（LAIT ）是—种免疫测定法，可用来快速定性测定奶牛乳中或尿中类绒毛膜促性腺激素（hCG-like ）。
此法是根据奶牛胚泡的绒毛膜滋养层细胞和胎盘子叶都能分泌hCG-like 来进行早期妊娠诊断的。
其原理是将hCG 吸附于聚苯乙烯乳胶珠上作为抗原，与hCG 免疫血清配套作为试剂，供早期妊娠诊断使用。
优点是诊断时间早、准确率高、反应快速（10分钟可检出结果）、设备简单、操作简便，便于在生产中推广应用。
3外源性生殖激素探试法（1）雌激素探试法。
奶牛妊娠后在体内起主导作用的是孕酮，它可以对抗适量的外源性雌激素，使奶牛不表现发情反应。
可在奶牛配种后18～20天，肌肉注射合成雌激素（苯甲酸雌二醇、己烯雌酚）2～3毫克，注射后5天不出现发情者为妊娠。
（2）三合激素探试法。
对配种后30～40天的奶牛肌肉注射三合激素制剂5毫升，如果一周内不出现发情征状，即可诊断为妊娠阳性。
（3）促性腺素释放激素-A （LRH-A ）探试法。
在奶牛配种后第21～27天后注射LRH-A 200～500微克，然后观察配种后35天内奶牛的返情情况，不返情母牛为妊娠。
准确率可达91.9%。
4血清酸滴定法奶牛在妊娠后胚胎快速生长的过程中，机体产生产一种特有的免疫球蛋白，这种球蛋白具有在酸性环境中与其他蛋白质形成低溶性复合物（絮状物）的特性，据此可对奶牛做出早期妊娠诊断。
奶牛早期妊娠诊断ELISA方法的应用及PAG-1单克隆抗体的制备奶牛早期妊娠诊断ELISA方法的应用及PAG-1单克隆抗体的制备导语：奶牛妊娠诊断是养殖业中的重要环节。
早期妊娠诊断有助于及时调整饲养管理措施，提高奶牛的生产性能。
本文将介绍一种常用的奶牛早期妊娠诊断方法——酶联免疫吸附法（ELISA），以及制备PAG-1单克隆抗体的工艺流程。
一、酶联免疫吸附法（ELISA）在奶牛早期妊娠诊断中的应用酶联免疫吸附法（ELISA）是一种常用的免疫学方法，可以用于检测体液中的特定蛋白质。
在奶牛早期妊娠诊断中，ELISA方法可以测定奶牛血液样本中的弗洛伊林相关蛋白（PAG），从而判断奶牛是否怀孕。
一般在妊娠的第24到28天，奶牛血液中的PAG水平会显著升高，通过ELISA方法可以快速、准确地检测出这种变化，判断奶牛是否成功受孕。
ELISA方法的步骤主要包括：1. 样品处理：收集奶牛的血液样本，离心分离，获取血清样品，保存在冰箱中备用。
2. 酶标板涂覆：将PAG抗原溶液均匀地涂覆在96孔酶标板中，密封孔板，在4℃下储存过夜。
3. 抗体结合：将待测样本稀释后加入涂覆好的酶标板孔中，与PAG抗原结合，孵育一定时间。
4. 酶标记抗体结合：加入标记有酶的二抗，培养片刻以促使其与已结合的PAG结合。
5. 反应底物：加入底物溶液，使酶催化反应产生发色物质，反应时间一般为10-30分钟。
6. 反应终止：加入反应终止液，停止酶催化反应，防止进一步产生发色物质。
7. 读取结果：使用酶标仪，在450nm波长下测定反应孔的吸光度值。
8. 结果判定：根据标准曲线和控制孔的吸光度值，判断样本中的PAG含量，从而判断奶牛的妊娠情况。
二、PAG-1单克隆抗体的制备PAG-1是奶牛血浆中的特异性蛋白质，其表达量与奶牛妊娠的状态密切相关。
为了制备PAG-1单克隆抗体，需要先提取并纯化PAG-1抗原，然后将其用于免疫小鼠，最后通过细胞融合技术得到抗原特异性的单克隆抗体。
一、实验目的本实验旨在掌握奶牛妊娠诊断的基本原理和方法，提高奶牛养殖户对奶牛妊娠的早期诊断能力，为奶牛养殖生产提供科学依据。
二、实验原理奶牛妊娠诊断主要依据妊娠母牛体内激素水平的变化，如孕酮、雌激素等。
通过检测这些激素水平，可以判断奶牛是否妊娠。
三、实验材料1. 实验动物：健康黑白花奶牛5头，分别编号为1、2、3、4、5。
2. 试剂与仪器：3%硫酸铜溶液、饱和氯化钠、0.1%氧化镁溶液、医用碘酒、试管、酒精灯、火柴、温度计等。
3. 实验步骤：（1）乳汁诊断法① 分别取1毫升3%硫酸铜溶液加入0.5-1毫升乳汁中，观察乳汁是否凝结。
② 取1毫升乳汁放入试管中，加入1毫升饱和氯化钠，振荡后再加入15毫升0.1%氧化镁溶液，振荡20-25秒。
③ 将试管置于开水中加热1分钟，取出静置3-5分钟后观察，如形成絮状物沉在下半部表明已怀孕，不形成絮状物或集于上部是未孕。
（2）尿液诊断法① 取母牛清晨排出的尿液20毫升放入试管中。
② 加入1毫升醋，再滴入1毫升2%-3%医用碘酒。
③ 用火缓慢加热煮沸，此时试管中从上到下呈现红色表明怀孕，如呈浅黄色、褐绿色，冷却后颜色很快消退则未孕。
四、实验结果1. 乳汁诊断法① 奶牛1、2、3号乳汁凝结，表明已怀孕。
② 奶牛4、5号乳汁不凝结，表明未怀孕。
2. 尿液诊断法① 奶牛1、2、3号尿液在加热煮沸后呈红色，表明已怀孕。
② 奶牛4、5号尿液呈浅黄色、褐绿色，冷却后颜色很快消退，表明未怀孕。
五、实验分析通过本次实验，我们掌握了奶牛妊娠诊断的基本原理和方法。
乳汁诊断法和尿液诊断法均能准确判断奶牛是否妊娠。
在实际生产中，可根据具体情况选择合适的方法进行诊断。
六、实验总结1. 奶牛妊娠诊断是奶牛养殖生产中的重要环节，准确判断奶牛是否妊娠对于提高繁殖效率、降低养殖成本具有重要意义。
2. 本次实验中，乳汁诊断法和尿液诊断法均具有较高的准确性，为奶牛养殖户提供了便捷的妊娠诊断方法。
3. 在实际生产中，应根据奶牛的具体情况选择合适的妊娠诊断方法，以确保诊断结果的准确性。
奶牛妊娠的临床诊断技术概述：临床诊断方法包括外部检查和内部检查两大内容。
1外部检查1．1问诊问诊在医学临床和妊娠诊断上有着重要意义，忽视问诊会大大限制我们的思考或分析空间。
在缺乏特异性诊断方法时，综合诊断就显得十分重要，通过问诊可以最大限度地帮助我们了解动物日前的生理状况，也可以帮助我们确定相应的诊断方法。
、在妊娠诊断时应注意询问以下内容：(1)最后一次配种日期在不同的妊娠阶段，动物生殖器官及体态的变化各有区别，通过询问最后一次配种时间，我们就可以确定相应的检查项目和检验方法。
例如，对牛通过直肠检查进行妊娠诊断时，在怀孕21d以内，主要靠检查卵巢上的黄体状态来进行妊娠诊断；21d以后，可通过检查子宫角形态来确诊妊娠；5个月以后，我们就可以通过直肠触摸子叶、胎儿及子宫中动脉等内容进行妊娠诊断。
(2)最后一次配种后是否再发情：如果最后一次配种后再未发情，则说明该动物可能怀孕；如果曾多次发情，则为没有怀孕。
(3)过去配种、受胎及产生情况：通过询问了解过去配种、受胎及产后情况，可以对母畜的繁殖器官状况及性能做评估，为妊娠诊断提供既往的参考资料。
(4)食欲、膘情及行为方面的变化情况：母畜怀孕后一般会性情变温顺，喜静恶动；食欲显著增加；在怀孕前半期膘情明显好转、被毛变得光亮。
这些都是怀孕的一种表现，相反则可能没怀孕。
(5)乳房及腹围变化情况：动物怀孕后，随着妊娠时间的延长，其乳房和腹围会逐渐变大。
1．2视诊视诊内容也是妊娠诊断一个重要参考资料，在妊娠诊断时，视诊主要包括：(1)是否有胎动；(2)腹围是否变大，下腹壁是否有水肿；(3)乳房是否胀大、水肿。
1．3触诊就是用手隔着腹壁去触摸胎儿，能触摸到胎儿则认为怀孕，否则认为未怀孕。
此妊娠诊断方法一般适用于妊娠中后期的妊娠诊断，其触诊部位和方法也因动物不同而有所区别，牛的触诊部位一般在右侧膝褶前方，多用振荡的手法进行触诊。
1．4听诊就是通过听胎儿心音来判定动物是否怀孕，此方法多用于奶牛这类大家畜，听诊时间在妊娠后半期。
奶牛妊娠诊断常用的方法李 春(黑龙江省肇源县超等乡政府 166500) 奶牛配种后,采取简便且有效的妊娠诊断,能够正确区分空怀奶牛和妊娠奶牛。
对于妊娠奶牛,要适当提高饲养管理水平。
对于空怀奶牛,要查找分析未妊娠的具体原因,并于下个发情期进行补配,从而减少空怀,使产犊间隔缩短,使繁殖率提高。
本文简要介绍奶牛妊娠诊断的常用方法,以供参考。
1 外部观察法奶牛妊娠后,在食欲、眼神、行为、运动、被毛、腹围、泌乳、阴门等方面都会发生变化。
一般情况下,妊娠奶牛采饲量增加,行动稳健,被毛光亮,阴门出现皱褶,黏膜呈苍白色或粉白色,阴蒂颜色变深且增大。
阴道有粘稠状粘液,类似胶皮糖,并有粪便粘夹在阴门最下面的阴毛上。
青年母牛的乳房在妊娠45个月开始发育,腹围逐渐增大,且在妊娠79个月时腹壁右侧显著增大。
外部观察法能够初步断定奶牛是否妊娠,虽然只能作为辅助手段用在生产中,但对奶牛管理具有一定的指导意义,如对照配种日期适时转群、干奶、移入产房,做好保胎工作,避免发生流产,提高营养供给等工作。
2 直肠检查法直肠检查一般是检查员用左手隔着直肠触摸妊娠子宫、子宫中动脉和胎儿的变化情况,并据此判断奶牛是否妊娠和确定妊娠时间。
这种方法是奶牛早期最主要的妊娠诊断方法之一,经验丰富的操作人员,能够在奶牛妊娠40~60天确定是否妊娠,准确率高于95%。
在保定架内,将待检奶牛站立保定,如果没有保定架,也可将牛头栓系于固定的木桩上,最好有一人站立在牛的右后侧进行辅助保定。
操作人员将左手伸入直肠,握住骨盆底部的子宫颈,手指向前伸来找寻子宫间沟,然后握住并分别触摸2个子宫中角,沿子宫角尖端轻柔触摸卵巢。
触摸子宫中动脉时,用手掌贴着骨盆顶向前滑动,通过岬部,向前则可触摸到颤动、游离的子宫中动脉。
奶牛未妊娠时,子宫和卵巢均处于骨盆腔内,两侧的子宫角形状、大小和硬度相同,收缩像绵羊角状,富有坚实感和弹性。
妊娠1个月时,子宫角处于耻骨联合前端,妊角变粗,绵羊角状弯曲度小,质地稍软,有波动感,妊角卵巢变大,且在表面有妊娠黄体突出。
奶牛妊娠的实验室诊断技术
【摘要】动物妊娠诊断的实验室诊断方法也比较多，在此仅将几种比较实用的实验室诊断方法和具有一定应用前景的诊断方法作以简要介绍。
【关键词】奶牛妊娠；实验室；诊断
动物怀孕后，在胎儿、胎盘等作用下，会导致母体的新陈代谢发生一系列变化，从而导致母体血、尿、乳等成分发生变化，这就是实验室妊娠诊断的理论基础。
在早期妊娠诊断方面，大家做了许多研究探索工作，但目前尚无一种完美的实验室诊断方法，理想的早期妊娠诊断技术应该具备下面的几个条件：
一是在配种后一个发情周期之内显示出诊断结果。
二是妊娠诊断的诊断准确率应在85％V A上。
三是对母体和胎儿安全无害。
四是方法简便、经济实用。
动物妊娠诊断的实验室诊断方法也比较多，在此仅将几种比较实用的实验室诊断方法和具有一定应用前景的诊断方法作以简要介绍。
1.牛乳孕酮诊断法
动物妊娠后，外周血液和乳中孕酮浓度升高，牛在妊娠早期(配种后18-24天)就表现出了这一内分泌学变化，通过精确定量分析可以确定妊娠早期(配种21天后)母牛乳汁中孕酮的临界值，根据此临界值则可对应调节测定系统，使其满足定性测定的要求，再通过显色反应或乳胶凝集特征判定是否妊娠。
临床验证表明，在配种后第23天采样，进行孕酮诊断是牛早期妊娠诊断的最佳时间。
1.1孕酮—ELISA(P-ELISA)诊断法
P-ELISA诊断法利用抗原(孕酮)、酶标抗原(酶标记孕酮)与抗体(孕酮抗体)的饱和竞争性结合反应原理，来监测乳样中孕酮浓度．的高低，依据反应系统中所产生的颜色(蓝、黄和粉红)深浅程度，用肉眼定性孕酮在乳样中的浓度范围，从而达到妊娠诊断的目的。
荷兰等国已生产出相应的商品性P-ELISA诊断试剂盒，但我国尚无此类型的商品试剂盒上市，此方法早期妊娠诊断的准确率为84．5％，成本较高。
1.2孕酮乳胶凝集抑制试验
1.2.1诊断原理
孕酮乳胶凝集抑制试验(PLAIT)是一种利用孕酮单克隆抗体和由孕酮包被的胶珠进行乳汁孕酮快速定性测定的免疫学方法。
．其诊断原理是将孕酮包被在特化的乳胶珠上，使奶样中的游离孕酮和胶珠上的孕酮竞争与单克隆抗体上的有限位点相结合，以此来定性显示乳样中孕酮水平高低。
1.2.2诊断方法
将等量乳样、孕酮单克隆抗体和孕酮包被乳胶珠混合在一起，并涂于反应玻板上，当混合物在一狭槽中扩散横过玻片时，乳胶珠与溶液相互作用，形成乳汁薄膜。
如果乳样孕酮含量高，游离态孕酮竞争与孕酮抗体非凝集性结合，在玻板小室内形成平滑状乳膜；相反，如果样品中孕酮含量低，胶珠上的孕酮则与孕酮抗体结合的多，造成胶珠凝集，在玻板上形成粒状乳膜。
此诊断方法操作简便，设备简单，成本也低。
2.早孕因子检测法
早孕因子(EPF)是妊娠早期母体血清中最早出现的一种免疫抑制因子。
它通过抑制母体的细胞免疫使胎儿，免受免疫排斥，得以在母体子宫中存活，所以也叫免疫抑制性早孕因子。
EPF在交配后6-48小时即能在血清中用玫瑰花环抑制试验测出，这给超早期妊娠诊断和受精检查提供了可能。
目前，在牛、羊、猪、兔、人等动物体内均发现EPF存在，EPF将在胚胎移植；不孕症诊断、家畜育种方面发挥重要作用。
哺乳动物胎儿有一半遗传信息来源于父亲，这对母体来说是一种外来异物，但在正常情况下，整个妊娠期并不发生母体排斥胎儿的现象。
母体为何能忍受胎儿这种半非己物的存在呢?人们注意到，母体怀孕后自体免疫防御机能降低是其中的一个重要因素，EPF就是动物在受精后数小时即出现在母体血液中的一种能抑制母体细胞免疫的物质，早期胚胎的发育和存活离不开EPF存在。
目前，EPF测定只能用玫瑰花环抑制试验，这种方法虽然灵敏度高、所用仪器设备简单，但特异性差、费时费工、变异性较大，所以还不能作为一种常规方法在生产上广泛应用。
如果能研究出更好的EPF检测方法，则有可能在动物早期妊娠诊断上取得重大突破。
3.牛胶体金法快速诊断试纸
此方法是近年来研究出的另一种牛妊娠快速诊断方法，准确率高、简单、费用低，很适合于临床生产应用，牛胶体金法快速诊断试纸类似于人妊娠诊断上的“早早孕试纸条”。
目前我国尚在研制阶段，国外已有此产品上市。
但由于牛年复一年的怀孕、泌乳，导致牛乳中总有一定水平的绒毛膜促性腺激素(HCG)存在，所以就难以像人的“早早孕试纸条”一样只考虑定性测定。
国外生产的此类试纸条，尚．不能肉眼判读，必须借助相应的阅读仪器，将此仪器装在挤奶机上，在挤奶过程中就可完成牛的妊娠诊断。
