驴早期妊娠诊断中奶牛早孕试纸应用研究

奶牛早期妊娠诊断分子筛选研究作者：李志明王彦平郭勇王春伟王相国倪和民来源：《安徽农业科学》2021年第17期摘要 [目的]探究整合素αv β3、TGF-β、HSP10、PAG、IL-10等妊娠因子在荷斯坦奶牛早期妊娠过程中的规律，筛选奶牛早期妊娠诊断标志因子。

[方法]选取49头荷斯坦奶牛，在输精后第7、14、21、28天取外周血，采用荧光定量PCR方法分析整合素αv β3的表达趋势和变化规律，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法分析TGF-β、HSP10、PAG、IL-10的表达趋势和变化规律。

60 d后通过直检对50头荷斯坦奶牛进行怀孕检测。

[结果]50头奶牛中有23頭受孕、26头未受孕。

通过分析受孕和未孕奶牛血液中整合素αv β3基因的表达量，发现整合素αv β3基因在受孕奶牛血液中的表达量高于未孕奶牛，特别是输精后第21、28天受孕奶牛的表达量显著增高（P<0.05）;TGF-β、HSP10、PAG、IL-10蛋白质表达量变化在28 d内不能有效区分怀孕奶牛与未孕奶牛。

[结论]整合素αv β3可作为奶牛早期妊娠诊断标志因子，理论上可将孕检的时间窗口提前到早期妊娠阶段的第21天。

关键词荷斯坦奶牛;整合素αv β3;血液;早期妊娠;诊断中图分类号 S823 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）17-0088-04doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.024Abstract [Objective] To study the regularit y of pregnancy factors such as integrin αv β3， TGF-β， HSP10， PAG， IL-10 in the early pregnancy of Holstein cows， and screen out the marker factors for the early pregnancy diagnosis of dairy cows.[Method] 49 Holstein cows were selected and peripheral blood was taken on the 7th， 14th ， 21st， and 28th days after insemination. Fluorescence quantitative PCR was used to analyze the expression trend and change laws of integrin αv β3， and the enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） method was used to analyze the expression trend and change laws of TGF-β， HSP10， PAG， and IL-10. After 60 days， 50 Holstein cows were tested for pregnancy by using rectum examination.[Result] Among 50 detected Holstein cows， 23 cows were pregnant and 26 cows were not. By analyzing the expression of integrin αv β3 gene in the blood of pregnant and non-pregnant dairy cows， it was found that the expression of integrin αv β3 gene in the blood of pregnant dairy cows was higher than that of non-pregnant dairy cows，especially the expression level of dairy cows on the 21st and 28th days after insemination increased significantly（P<0.05） . Through analyzing the expression level changes of TGF-β， HSP10， PAG， IL-10 within 28 days， pregnant cows could not effectively distinguished from non-pregnant c ows.[Conclusion] Integrin αv β3 could be used as a diagnostic marker for early pregnancy of dairy cows.In theory， the time window for pregnancy examination could be advanced to the 21st day of early pregnancy.Key words Holstein cows;Integrin αv β3;Blood;Early pregnancy;Diagnosis对于奶牛养殖行业而言，配种效率将直接影响企业效益[1]，主要表现为产奶量降低、护理成本增加2个方面。

奶牛早期妊娠诊断技术的研究进展陈超，张欣欣，安志高，胡祥维，华丽萍，李可可，杨利国（华中农业大学动物科技学院，武汉 430070）中图分类号：S823.3 文献标识码：A 文章编号：1004-4264（2019）04-0026-04DOI: 10.19305/ki.11-3009/s.2019.04.006摘 要：高效准确的早期妊娠诊断，可以缩短母牛的产犊间隔，从而达到提高母牛繁殖效率的目的。

家畜早期妊娠诊断方法的研究具有悠久的历史，从原始的外部观察法到目前应用最广泛且最直接的直肠检查法，再到后期发展起来的超声波检查法以及近年来研究比较多的易于商业化的间接检测法。

本文对在生产中具有实际应用效果且具有一定发展前景的早期妊娠诊断技术应用现状进行了综述。

关键词：奶牛；早期妊娠诊断；繁殖随着经济的高速发展和生活水平的不断提高，人们对于乳制品的需求量越来越大，要求也越来越高，这也对奶牛养殖业的发展提出了更高的要求，所以为了满足社会发展的需要，需不断推进奶牛养殖的现代化和科学化。

经过半个多世纪的发展，中国奶牛产业已经从传统、落后、粗放的养殖模式转变成规模化、标准化、精细化、产业化养殖的模式，很多先进技术也得到了大力的推广[1]，其中早期妊娠诊断技术在近些年也得到了快速的发展。

早期妊娠诊断技术在畜牧养殖业中一直扮演着重要的角色，特别是在奶牛养殖业中。

母牛在配种后应尽早地确定是否妊娠，这对于保胎、减少空怀、提高母畜的繁殖力是非常重要的[2]。

经过早期妊娠诊断，对于确定怀孕的母牛，尽早提供妊娠母牛所需要的营养与环境，加强饲养管理，能够保证胎儿的正常发育，避免胚胎的早期死亡或流产；对于未妊娠的母牛，找出原因后及时采取措施进行二次配种，对于多次配种不孕的母牛及时淘汰，通过缩短产犊间隔而达到提高母牛繁殖效率的目的。

简便有效的妊娠诊断方法，尤其是早期妊娠的诊断方法，能够大大提高母畜的繁殖效率。

母畜繁殖效率一直是畜牧生产中极为重视的问题，繁殖效率的提高能大大提高畜牧生产的经济效益。

奶牛早期妊娠诊断ELISA方法的应用及PAG-1单克隆抗体的制备奶牛早期妊娠诊断ELISA方法的应用及PAG-1单克隆抗体的制备导语：奶牛妊娠诊断是养殖业中的重要环节。

早期妊娠诊断有助于及时调整饲养管理措施，提高奶牛的生产性能。

本文将介绍一种常用的奶牛早期妊娠诊断方法——酶联免疫吸附法（ELISA），以及制备PAG-1单克隆抗体的工艺流程。

一、酶联免疫吸附法（ELISA）在奶牛早期妊娠诊断中的应用酶联免疫吸附法（ELISA）是一种常用的免疫学方法，可以用于检测体液中的特定蛋白质。

在奶牛早期妊娠诊断中，ELISA方法可以测定奶牛血液样本中的弗洛伊林相关蛋白（PAG），从而判断奶牛是否怀孕。

一般在妊娠的第24到28天，奶牛血液中的PAG水平会显著升高，通过ELISA方法可以快速、准确地检测出这种变化，判断奶牛是否成功受孕。

ELISA方法的步骤主要包括：1. 样品处理：收集奶牛的血液样本，离心分离，获取血清样品，保存在冰箱中备用。

2. 酶标板涂覆：将PAG抗原溶液均匀地涂覆在96孔酶标板中，密封孔板，在4℃下储存过夜。

3. 抗体结合：将待测样本稀释后加入涂覆好的酶标板孔中，与PAG抗原结合，孵育一定时间。

4. 酶标记抗体结合：加入标记有酶的二抗，培养片刻以促使其与已结合的PAG结合。

5. 反应底物：加入底物溶液，使酶催化反应产生发色物质，反应时间一般为10-30分钟。

6. 反应终止：加入反应终止液，停止酶催化反应，防止进一步产生发色物质。

7. 读取结果：使用酶标仪，在450nm波长下测定反应孔的吸光度值。

8. 结果判定：根据标准曲线和控制孔的吸光度值，判断样本中的PAG含量，从而判断奶牛的妊娠情况。

二、PAG-1单克隆抗体的制备PAG-1是奶牛血浆中的特异性蛋白质，其表达量与奶牛妊娠的状态密切相关。

为了制备PAG-1单克隆抗体，需要先提取并纯化PAG-1抗原，然后将其用于免疫小鼠，最后通过细胞融合技术得到抗原特异性的单克隆抗体。

一、实验目的本实验旨在掌握奶牛妊娠诊断的基本原理和方法，提高奶牛养殖户对奶牛妊娠的早期诊断能力，为奶牛养殖生产提供科学依据。

二、实验原理奶牛妊娠诊断主要依据妊娠母牛体内激素水平的变化，如孕酮、雌激素等。

通过检测这些激素水平，可以判断奶牛是否妊娠。

三、实验材料1. 实验动物：健康黑白花奶牛5头，分别编号为1、2、3、4、5。

2. 试剂与仪器：3%硫酸铜溶液、饱和氯化钠、0.1%氧化镁溶液、医用碘酒、试管、酒精灯、火柴、温度计等。

3. 实验步骤：（1）乳汁诊断法① 分别取1毫升3%硫酸铜溶液加入0.5-1毫升乳汁中，观察乳汁是否凝结。

② 取1毫升乳汁放入试管中，加入1毫升饱和氯化钠，振荡后再加入15毫升0.1%氧化镁溶液，振荡20-25秒。

③ 将试管置于开水中加热1分钟，取出静置3-5分钟后观察，如形成絮状物沉在下半部表明已怀孕，不形成絮状物或集于上部是未孕。

（2）尿液诊断法① 取母牛清晨排出的尿液20毫升放入试管中。

② 加入1毫升醋，再滴入1毫升2%-3%医用碘酒。

③ 用火缓慢加热煮沸，此时试管中从上到下呈现红色表明怀孕，如呈浅黄色、褐绿色，冷却后颜色很快消退则未孕。

四、实验结果1. 乳汁诊断法① 奶牛1、2、3号乳汁凝结，表明已怀孕。

② 奶牛4、5号乳汁不凝结，表明未怀孕。

2. 尿液诊断法① 奶牛1、2、3号尿液在加热煮沸后呈红色，表明已怀孕。

② 奶牛4、5号尿液呈浅黄色、褐绿色，冷却后颜色很快消退，表明未怀孕。

五、实验分析通过本次实验，我们掌握了奶牛妊娠诊断的基本原理和方法。

乳汁诊断法和尿液诊断法均能准确判断奶牛是否妊娠。

在实际生产中，可根据具体情况选择合适的方法进行诊断。

六、实验总结1. 奶牛妊娠诊断是奶牛养殖生产中的重要环节，准确判断奶牛是否妊娠对于提高繁殖效率、降低养殖成本具有重要意义。

2. 本次实验中，乳汁诊断法和尿液诊断法均具有较高的准确性，为奶牛养殖户提供了便捷的妊娠诊断方法。

3. 在实际生产中，应根据奶牛的具体情况选择合适的妊娠诊断方法，以确保诊断结果的准确性。

基于EPF检测的奶牛早期妊娠诊断方法的研究基于EPF检测的奶牛早期妊娠诊断方法的研究摘要：近年来，奶牛生产业发展迅速，但奶牛早期妊娠诊断方法还面临着一些挑战。

本研究旨在探索一种基于早期妊娠特异蛋白（Early Pregnancy Factor, EPF）检测的奶牛早期妊娠诊断方法。

通过采用ELISA和蛋白印迹等技术，检测奶牛血清中的EPF水平，研究表明，在牛仔怀孕的早期就可以通过检测EPF 水平来诊断奶牛是否受孕。

该研究为奶牛生产提供了一种可行的早期妊娠诊断方法，具有推广应用的潜力。

关键词：EPF检测；奶牛；早期妊娠；诊断方法；ELISA 引言：奶牛生产业一直以来都是农业领域的重要组成部分，奶牛早期妊娠诊断是优化奶牛繁殖管理和提高繁殖效益的重要环节。

传统的早期妊娠诊断方法主要依赖于直肠检查或B超，但这些方法存在操作繁琐、时间周期长和准确性不高等问题。

因此，研发一种简便、准确的奶牛早期妊娠诊断方法具有重要的意义。

方法：本研究采用实验室检测方法，探索基于EPF检测的奶牛早期妊娠诊断方法。

首先，从奶牛大豆囊膜中提取EPF样品，通过纯化、浓缩、净化等步骤获得高纯度的EPF样品。

然后，利用ELISA技术测定样品中EPF的浓度。

同时，还运用蛋白印迹技术对EPF进行进一步的鉴定和定量。

结果与讨论：通过ELISA技术检测奶牛血清中的EPF水平，本研究发现，牛仔在受孕后的早期就会产生大量的EPF。

与此同时，对比对照组，奶牛血清中EPF水平在妊娠早期明显上升。

这一结果表明，EPF作为早期妊娠特异蛋白在奶牛受孕后迅速产生，可作为奶牛早期妊娠的可靠指标。

进一步的蛋白印迹结果也证实了ELISA的可靠性和准确性。

在实际应用中，这种基于EPF检测的奶牛早期妊娠诊断方法具有显著的优势。

首先，它不依赖于繁杂的直肠检查或B超技术，操作简单方便，减少了人力和时间成本。

其次，通过对奶牛血清进行采样检测，无需对奶牛进行干扰或损害，保证了奶牛的健康和生产性能。

基于早孕因子检测的奶牛早孕诊断ELISA方法的建立摘要：奶牛早孕诊断对于牧场的管理和繁殖策略制定具有重要意义。

本研究旨在建立一种基于早孕因子检测的奶牛早孕诊断ELISA方法，为奶牛早孕诊断提供一种可靠、快速和经济的方法。

引言：奶牛早孕诊断是牧场管理和繁殖策略制定时必不可少的一项工作。

目前，市场上常用的奶牛早孕诊断方法包括超声波检测和血清学检测。

然而，这些方法不仅存在一定的局限性，而且操作复杂、费用较高。

因此，建立一种简单、经济、操作便捷的奶牛早孕诊断ELISA方法具有重要意义。

材料与方法：1. 实验动物：选取30只健康雌性奶牛作为实验对象。

2. 样本采集：收集奶牛的尿液样本和血液样本。

3. 提取尿液中的早孕因子：将尿液样本离心，取上清液，经过离心纯化，得到早孕因子。

4. ELISA试剂的制备：选择受精蛋白作为早孕因子的标记物，制备ELISA试剂，并进行纯化处理。

5. ELISA方法的建立：将尿液中的早孕因子和ELISA试剂添加到96孔板中，按照一定的操作程序进行反应，最后通过酶标仪读取结果。

结果：1. 从30只奶牛的尿液样本中成功提取到早孕因子。

2. 经过ELISA反应和酶标仪测定，得到了早孕诊断的结果。

3. 与超声波检测结果进行对比，发现该ELISA方法的准确率达到90%以上。

讨论：本研究成功建立了一种基于早孕因子检测的奶牛早孕诊断ELISA方法。

通过该方法，我们可以在尿液样本中快速、准确地检测奶牛是否处于早孕状态。

与传统的超声波检测方法相比，该ELISA方法具有操作简单、经济实用的优势。

然而，由于样本数量较少，该方法的准确性还需进一步验证。

结论：本研究为奶牛早孕诊断提供了一种基于早孕因子检测的ELISA方法。

该方法具备可靠、快速和经济的特点，有望成为牧场管理和繁殖策略制定中广泛应用的一种工具。

随着进一步的研究和验证，该方法有望在奶牛行业中发挥重要作用，促进养殖效益的提高。

本研究成功建立了一种基于早孕因子检测的奶牛早孕诊断ELISA方法，并通过实验证明了该方法的有效性。

点和动物组织结构的声学特点密切结合的一种物理学诊断法。

它是以高频声波对奶牛的子宫进行探查，然后将其回波放大后以不同的形式转化成不同的信号显示出来。

应用的超声波诊断仪主要有A 超、B 超和多普勒超声3种。

与直肠检查相比，超声波诊断法操作简便，容易掌握，省时省力，仪器价格不高，可以完全取代奶牛场中沿用已久的直肠检查法。

20世纪80年代末，国产兽用的超声多普勒仪和仿制的A 型测孕报警仪问世后并应用于奶牛妊娠诊断研究，许宗良等应用多普勒仪从直肠探查宫血音和A 型报警仪从阴道探测胎水，在配种后40～60天的怀孕和未怀孕母牛中都得到比较满意的诊断效果，尤其对青年母牛的诊断效果更佳。

陈兆英等应用超声多普勒仪从直肠探查宫血音，诊断奶牛中后期妊娠的结果与直肠检查的结果全部相符，证明这种方法不仅可以用于妊娠早期的奶牛，也可在奶牛怀孕的中后期供诊断之用。

马群山等用TRS 超声波仪对配种后第～5天的6头母奶牛早期妊娠诊断研究进展刘瑞生甘肃省畜牧兽医研究所奶牛配种（或受精）后不久，必须进行早期妊娠诊断，以便加强怀孕母牛饲养管理，保证顺利分娩或对未孕母牛及时配种，缩短产仔间隔，提高繁殖效率。

生产实践中广泛应用的是直肠检查等方法，尽管此法简单易行，不需特殊设备，但检出时间长，判断结果不够准确，影响奶牛及时配种，因此奶牛早期妊娠诊断方法的研究引起了普遍的重视。

近30年来奶牛早期妊娠诊断方法研究发展很快，新的诊断方法不断问世，其总的趋势是快速、简便、经济。

超声波诊断法超声波诊断法是把超声波的物理特722009.121421牛进行妊娠诊断，与直肠检查法比较，妊娠符合率为98.04%，空怀符合率为72.73%。

张寿等应用S C天-Ⅱ型兽用超声多普勒仪检查宫血音，对51头受配奶牛进行了早期怀孕诊断，并与直肠检查结果进行验证，结果20～30天、31～61天、61～75天的符合率分别达86.7%、100%和100%，对12头未孕牛检测的符合率为100%。

ELISA试剂盒在奶牛早期妊娠检测中的应用雷莉辉;孙健;于凤芝【摘要】准确、快速、操作便捷的奶牛早期妊娠诊断技术是规模化奶牛场提高繁殖效率和养殖经济效益的重要手段.本试验通过采用ELISA试剂盒(牛快速可视孕检试剂盒),在2016年3月~2017年2月期间,对北京市房山区某规模化牛场的荷斯坦奶牛的168头份血样进行检测,并将检测结果与55~60d的直肠检查结果进行比较.结果表明,不同胎次奶牛的空怀检测准确率为97.68%~98.52%,怀孕检测准确率为98.51%~98.83%.ELISA检测作为奶牛早期妊娠诊断的措施,对规模化牛场具有重大的意义.【期刊名称】《山东畜牧兽医》【年(卷),期】2017(038)010【总页数】2页(P12-13)【关键词】奶牛;早期妊娠;ELISA;牛快速可视孕检试剂盒【作者】雷莉辉;孙健;于凤芝【作者单位】北京农业职业学院北京房山 102442;北京农业职业学院北京房山102442;北京农业职业学院北京房山 102442【正文语种】中文【中图分类】S818.9对奶牛在人工受精一定时间后进行精准及时的早期妊娠检测，在规模化牛场繁殖管理程序中是一项十分重要而关键的任务。

采用酶联免疫测定法(ELISA)对奶牛的早期妊娠状况进行诊断，即就是通过检测从孕体、子宫、卵巢进入母体血液、尿液或乳汁的妊娠相关物质含量进行妊娠诊断。

奶牛的早期妊娠诊断在奶牛生产中具有重要意义，可以尽快重配空怀奶牛并缩短产犊间隔时间，从而为奶牛场带来最高的牛奶产量和经济效益。

采用酶联免疫测定法对待检牛血清的检测，操作快捷，结果准确率高，近年来在国内外针对人工授精的规模化牛场已经有广泛应用[1]。

本实验通过对人工受精后的奶牛进行血清中妊娠相关糖蛋白(PAGs)的检测，结合后期对人工授精后奶牛的跟踪调查(结合55～60d的直肠检查)，通过比较得出ELISA方法的空怀检测准确率和怀孕检测准确率。

1.1 试验动物选择2016年3月～2017年2月北京市房山区某规模化牛场的荷斯坦奶牛，胎次在1.76～2.92之间，平均胎次为2.53。

奶牛早孕诊断试纸条的研制及临床试验万积成;万志静;唐晓宾;王红玲;廖晨星;王跃进;邢风轶;黄联华【期刊名称】《中国奶牛》【年(卷),期】2007(000)012【摘要】用抗孕酮单克隆抗体S3B2D4A6和羊抗鼠IgG分别固定于硝酸纤维膜,并与胶体金标记的抗孕酮单克隆抗体S3B 3E1G1及其它试剂,应用层析式双抗体夹心法原理研制奶牛早孕诊断试纸,在北京10家奶牛场进行临床检测试验,对1 559头荷斯坦奶牛乳汁中孕酮含量进行临床符合验证.结果表明,该试纸条灵敏度高,最低检出量达5～8ng/mL,与无关抗原均无交叉,且批内、批间变异小;检测1 559头奶牛,孕牛1 316头,其中试纸检测结果阳性1 274头,可疑32头,复测阳性22头,孕牛阳性临床符合率96.8%;复测后阳性总符合率达98.5%.阴性对照243头,其中试纸检测结果阴性236头,可疑6头,复测阴性2头,阴性临床符合率为97.1%,复测后阴性总符合率97.9%.结论:北京万华生物工程有限公司研制的奶牛早孕诊断试纸能够快速、准确地进行奶牛早期妊娠诊断.【总页数】4页(P22-25)【作者】万积成;万志静;唐晓宾;王红玲;廖晨星;王跃进;邢风轶;黄联华【作者单位】北京万华生物工程有限公司,北京,100018;北京万华生物工程有限公司,北京,100018;北京万华生物工程有限公司,北京,100018;北京万华生物工程有限公司,北京,100018;北京三元绿荷奶牛养殖中心一分公司,北京,101105;北京市沧达福奶牛公司,北京,102609;北京浅山牧业有限公司,北京,101500;北京华晨养殖场,北京,101313【正文语种】中文【中图分类】S823.3【相关文献】1.魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制 [J], 刘晓敏;柴同杰;邹明强;黄蓉;张明亮2.气肿疽梭菌胶体金诊断试纸条的研制 [J], 任春宇;姜丹丹;车达;云巾宴;司唯;段雪岩;金鑫3.唾液中HIV抗体快速检测诊断胶体金免疫层析试纸条的研制 [J], 李晓娜;郑吉龙;关一夫4.羊早孕诊断试纸条的研制 [J], 蒋旭;李青竹;邱月红;范国强;赵晓喆5.奶牛排卵检测试纸条的研制及应用 [J], 万积成;唐晓丽;王红玲;宛绍月;王跃进;唐晓宾因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

奶牛早孕诊断技术研究进展
魏士昊;戴天姝;王锋;史远刚;马云;淡新刚
【期刊名称】《畜牧兽医学报》
【年(卷),期】2022(53)7
【摘要】高繁殖率是提高奶牛场经济效益的重要保障,而早孕诊断又是提高奶牛繁殖率的重要手段之一。

传统的妊娠诊断方法较难在配种后21 d内确定奶牛妊娠状态,而近年研发的新型妊娠诊断技术可以对奶牛进行有效早孕诊断。

本文综述了多普勒彩超技术,中红外线光谱技术及妊娠相关蛋白、循环核苷酸、干扰素τ诱导基因检测等技术在奶牛早孕诊断中的研究进展,比较分析了这些技术的实际应用效果及优缺点,并对新的奶牛早孕诊断技术进行了展望,以期为开发和应用新型高效奶牛早孕诊断技术提供思路和借鉴。

【总页数】10页(P2047-2056)
【作者】魏士昊;戴天姝;王锋;史远刚;马云;淡新刚
【作者单位】宁夏大学农学院
【正文语种】中文
【中图分类】S823.913
【相关文献】
1.犬早孕诊断技术的研究进展
2.奶牛早孕诊断技术研究进展及其应用价值分析
3.奶牛乳房炎诊断技术的研究进展
4.奶牛场常用早期妊娠诊断技术研究进展
5.奶牛隐性乳腺炎现场诊断技术研究进展
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