食源性阪崎肠杆菌研究进展

简述食品中大肠杆菌的快速检测方法相关研究进展摘要：大肠菌群的快速检测是食品、药品卫生监督检验迫切需求，本文从免疫学技术，酶学的技术，分子生物学技术，传统检测方法改进技术，物理化学技术，其它技术方面对大肠菌群快速检测方法研究进展进行综述，并对其存在问题及应用前景进行分析。

这些方法各有优缺点，免疫学技术和分子生物学技术灵敏度高，但假阳性率高，无法区分死活菌；酶学的技术和物理化学技术特异性好，省时省力，但这些方法成本较高，不适合基层实验室使用；传统检测方法改进技术结果准确，但费时费力。

因此，仍需要发展一种新的方法解决所存在的问题。

要真正实现大肠菌群的快速检测还需要不断进行科学研究，以寻找一种能够真正实现成本低、灵敏度好、准确性高并且检测速度快的更合适的方法。

关键词：食品；大肠菌群；快速检测；研究1引言大肠菌群为一群在37C、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽胞杆菌的统称。

这些细菌多存在于温血动物粪便中，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然存在的主要原因。

因此，大肠菌群被国际上公认为检测各种水质、医药及食品在流行病学上安全性的指示菌。

如果检测到大肠菌群呈阳性结果，那么便表明食品、药品或者水质存在大肠菌群，已经被粪便污染。

大肠菌群的数量与受到的污染程度成正比，数量越多，受污染越严重。

目前我国国家标准主要用多管发酵法来检测大肠菌群多管发酵法作为一种传统的检测方法已沿用多年，其准确性、权威性无可质疑，但该方法费时费力，而且检测所需的费用较高，已无法满足人们对食品、药品安全现场监测的要求，因此，现在食品、药品卫生监督检验迫切需要一种更加有效、快速的大肠菌群检测方法。

近年来，世界各国针对大肠菌群的快速、定量检测技术都进行了专门的研究，本文综述了大肠菌群快速检测技术的研究进展，并对其存在问题及应用前景进行分析。

2大肠菌群主要的快速检测方法2.1免疫学技术免疫学方法检测原理是依据抗原和抗体特异性反应。

12. 食源性阪崎肠杆菌病的主要致病
食源性疾病培训考试
科室：姓名：得分：
技术职称：
填空题（每空4分，共100分）
1、食源性疾病的特征包括食物传播、爆发性、地区性、季节性和散发
性。

2. 按发病机制分，食源性疾病可分为食源性感染和食物中毒。

3. 食源性疾病监测和报告的对象包括感染性病例、中毒性病例、异常病
例、和食源性疾病暴发事件。

4. 食源性疾病暴发事件是指发病人数在2 人及以上或出现1名及1名以上死亡
病例的食源性疾病事件。

5.引起食源性诺如病毒病的主要食品是贝类，此外，受污染的沙拉、水果、
三文治、蛋糕、冰霜、冰块等也能引起食物中毒。

6. 生或未煮熟的菜豆含有较丰富的红细胞凝集素和皂苷，这两种生物毒素进
入人体后发挥生物作用而导致食源性菜豆中毒。

7.
于动物性毒素中毒。

8.食源性单核细胞增生李斯特菌病的易感人群包括孕妇、免疫力低下、和
新生儿。

9. 紫绀是食源性亚硝酸盐中毒的临床表现之一。

10. 食用发芽或表皮变为青绿色的马铃薯、未成熟的番茄可导致患龙葵碱中
毒。

食源性疾病是头号食品安全问题，其中主要是致病性微生物引起的食源性疾病。

作为普通消费者，如何预防食源性疾病、保障我们家人的身体健康？下面将以预防微生物性食源性疾病为重点，科学解读如何保障食品安全。

中毒性等疾病，包括食物中毒。

通俗的讲就是“吃出来的病”，这些致病因素既有化学性的、生物性的，也有动植物性的等。

2. 微生物性食源性疾病究竟有多严重？在发达国家，每年患食源性疾病的人数高达30%。

美国每年每6人中就有1人因为吃了被污染的食品而生病，每年仅仅是沙门氏菌感染造成的直接医疗费用损失就达3.66亿美元。

您的食品安全吗？—— 远离食源性疾病2014年收到全国30个省（区、市）食源性疾病暴发事件（包括食物中毒）1480起，患病17651人，其中死亡111人，而这仅仅是实际发病情况的“冰山一角”。

 这些小小的微生物小到我们肉眼都看不见，经常隐匿于食物和各种环境中，稍不留神就可能遭到它们的袭击，导致食源性疾病的暴发。

3. 婴幼儿健康的敌人——阪崎肠杆菌阪崎肠杆菌是谁？阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）是存在于环境中的一种微生物，具有耐热、耐干燥、对渗透压的忍耐力较强等特点，可长时间生存在干燥的环境中。

如果奶粉在冲调、存放时操作不当，就可能被环境中的阪崎肠杆菌污染，而被其污染的婴儿配方粉正是婴幼儿感染的主要病因食品。

阪崎肠杆菌的危害是什么？阪崎肠杆菌最容易袭击1岁以下，特别是早产、出生体重偏低、免疫力低下的婴幼儿，可引起新生2第一篇 食源性疾病潜伏在你我身边儿脑膜炎、菌血症等严重疾病，死亡率高达20-50%。

一是由于婴儿的胃酸pH值比成人高，对细菌的杀伤力还不够强，阪崎肠杆菌可以安全抵达婴儿肠道中，并在那里避难、生存；二是因为婴儿的血脑屏障还未发育完全，阪崎肠杆菌又可趁虚而入，轻松进入婴儿脑部引发脑膜炎。

如何避免婴幼儿感染阪崎肠杆菌？世界卫生组织建议：①婴儿配方粉应使用不低于70℃的热水冲调，并且冲调后应在2小时内尽快喂哺；②如需预先冲调，冲调后应快速冷却且存放在不超过5℃的冰箱内，并在冲调后24小时内饮用，喂哺前必须重新加热；③对于早产、体重低或免疫力低等高风险婴儿，应使用商业无菌的液态婴儿配方奶。

纳米粒子应用于微生物检测的研究进展陶珊珊;李云霞;赵琨;陈雯雯;赵渝【摘要】食源性致病菌是引发食源性疾病的主要因素,如何有效地检测出食源性致病菌的存在是食源性疾病预防与控制的关键环节.目前,应用于食源性致病菌检测领域的纳米粒子技术已日益成熟.系统介绍了光学纳米粒子、磁性纳米粒子等技术在微生物致病菌检测中的应用.【期刊名称】《上海师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(043)006【总页数】6页(P612-617)【关键词】金纳米粒子;荧光硅纳米颗粒;量子点;上转换荧光纳米粒子;磁性纳米粒子【作者】陶珊珊;李云霞;赵琨;陈雯雯;赵渝【作者单位】上海师范大学生命与环境科学学院上海200234;上海师范大学植物种质资源开发中心,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院上海200234;上海师范大学植物种质资源开发中心,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院上海200234;上海师范大学植物种质资源开发中心,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院上海200234;上海师范大学植物种质资源开发中心,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院上海200234;上海师范大学植物种质资源开发中心,上海200234【正文语种】中文【中图分类】TS207.4近几年来,世界范围内的食品安全恶性事故频繁爆发[1],食源性疾病的爆发率大幅上升已引起了世界各地政府的关注,更给世界人民带来了巨大的痛苦和损失.因而,如何快速、灵敏地检测出食源性致病菌的存在已成为控制食品安全问题的关键.传统的食源性疾病的检测方法都要经过分离培养、生化鉴定等步骤,存在操作耗时繁琐、检测灵敏度低和容易出现假阴性等缺点[2],在应对突发性食品安全公共事件上,不能满足快速、准确、灵敏和特异性高等要求.近几十年来,纳米粒子技术在食源性致病菌的检测领域不断发展[3-4].本文作者主要从荧光纳米粒子、磁性纳米粒子等方面介绍了纳米粒子在微生物致病菌快速检测中的应用.1 光学纳米粒子快速检测技术荧光纳米粒子由于其具有的化学及光学特性,能产生较高的灵敏度,已经被许多课题研究小组用于微生物菌剂的检测[5-6].1.1 金纳米粒子金纳米粒子是较受欢迎的纳米材料.依赖其独特光学特性,以及在生物液体里的惰性和稳定性使它成为纳米粒子材料诊断中最常用的材料之一.金纳米粒子(AuNPs)广泛被应用于微生物分析、检测和识别领域.通过选择合适的合成方法,可以很容易地形成不同大小和形状的金纳米粒子.AuNPs很容易被硫醇化的DNA探针和蛋白质分子修饰[1](图1),这一特点使它优于其他类型的纳米粒子.金纳米粒子的另一独特特性是呈现出明显的红色,这使诊断测验的敏感性增强,可视性高.此外,金纳米粒子常用于免疫层析试纸条(ICS)生物传感器[7](图2).ICS已经实现对传染性病原体及毒素的快速、灵敏检测.目标菌和金纳米粒子聚合成红色沉淀,诊断测试中,不需要任何仪器的协助,仍可很容易地看清目标反应,在测试区,检测线为红线,可视化很高[8].同时,金纳米粒子具有较高的消光系数,以及在可见光中具有较宽的吸收光谱,可以克服许多传统荧光素的局限性[9].Zhu研究小组开发了一个混合了金、银2种纳米粒子的局部表面等离子体共振生物传感器,用于金黄色葡萄球菌肠毒素B检测.这种传感器可直接检测肠毒素B至ng/mL级别,而用于检测肠毒素B的其他表面等离子体共振生物传感器则需要采取扩增的步骤来实现这一目标灵敏度[11].图1 金纳米粒子与硫醇化DNA分子结合原理图[1]图2 免疫层析试纸条用于微生物检测原理[10]1.2 荧光硅纳米颗粒荧光检测试验对于微生物学家并不新鲜,因为荧光显微镜和分光荧光计广泛应用于诊断和实验室研究.荧光硅纳米颗粒容易被生物修饰并可通过荧光显微镜或分光荧光计来检测微生物[12].掺杂二氧化硅纳米粒子的染料可以用来探测生物分子,比其他荧光纳米颗粒具有更高的灵敏度[13].单个荧光二氧化硅纳米粒子可保留数千染料分子,而在免疫荧光测定抗体的直接荧光标记中只有极少数染料分子.因此,利用二氧化硅纳米粒子可以提高检测灵敏度达几百倍.此外,相比于其他荧光纳米粒子,染料中掺杂的二氧化硅纳米颗粒具有光稳定性和增强发光的优点.它们已被广泛地用于生物分子的检测,例如asDNA、抗体、细胞等[14].二氧化硅纳米粒子可保留有机或者金属染料,该染料可以附着在纳米颗粒的表面或包含在纳米粒子内部.用于成像的纳米颗粒嵌入染料分子后,可免受光的照射,表现出更强的耐光性[15].纳米颗粒可以很容易被抗体或者核酸分子化学功能化和生物修饰化,经化学修饰后的纳米颗粒表面生成的氨基或羧基基团能够使荧光纳米粒子共价连接抗体[16].包被的染料荧光纳米颗粒与抗体结合后,增强了测定的灵敏度,使检出限降低到单个细胞水平[17].这种检测方法对一些苛刻性细菌或者生长比较缓慢的细菌检测非常有利.例如结核杆菌,该菌需要很长的培育时间和特殊的培养条件.Qin研究组曾使用荧光二氧化硅纳米颗粒灵敏地从细菌混合物及标准唾液样品中检测出结核分枝杆菌,结核分枝杆菌结合到A蛋白上,A蛋白被掺杂有二氧化硅纳米粒子的联吡啶钌(RuBpy)修饰[14].另外,在佛罗里达大学的Tan课题研究小组使用荧光二氧化硅纳米颗粒检测单一样品中的多种细菌.该纳米粒子包含不同浓度的染料分子,被同一波长激发后会产生不同的颜色.通过缀合不同细菌对应的抗体的纳米粒子能够检测样品中的3种细菌,每种细菌对应一种颜色[12].1.3 量子点在过去的20年里,半导体纳米颗粒及量子点的光电子特性以及在生命科学研究中的应用备受研究者的关注,主要应用于生物检测[18].量子点是纳米级的半导体晶体,具有独特的光学特性,作为荧光标记物可用于免疫分析、DNA杂交试验及微生物检测[19].大部分用于检测细菌的光学生物传感器是基于对有机染料或者蛋白质荧光团荧光排放量的测量.然而,常见的荧光团具有较多的缺点[20](如微弱的耐光性和低强度),且不适用于多种细菌的检测.量子点可以克服这些限制,它们具有光稳定性,且表现出高量子产率[21].通过改变量子点的尺寸和它的化学组成可以使其发射光谱覆盖整个可见光区,故可使用量子点同时检测多个细菌[22].Zhao等使用连接上抗体的量子点与MNPS能够同时检测出鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏杆菌、大肠杆菌O157:H7[23].相比传统有机染料(如异硫氰酸荧光素),量子点可有效提高测定的灵敏度,这一优势通过简单的荧光测定大肠杆菌O157:H7血清型即可表现出才来.Liu研究小组发现了基于流动室微孔免疫滤镜的生物传感器的发展系统,这种传感器以量子点树枝石纳米晶体作为荧光标记[24],可用来捕捉大肠杆菌O157:H7,使用这种生物传感器系统,检测限可低至2.3 CFU/mL.Abdelhamid等使用壳多糖修饰的CdS量子点标记细菌进一步用于生物成像[7].Xu等构建了连接有量子点的免疫层析试纸条,用于快速检测空肠弯曲杆菌,检测限达到104 cfu/mL,是金试纸条检测灵敏度的10倍[25].1.4 上转换发光纳米粒子上转换荧光材料是在长波长的激发下,发出短波长光的一类荧光材料.它们大多属于稀土掺杂的无机材料,如镱、铒共掺杂的氟化钇、氟化钇钠、氟化镧等.上转换荧光纳米材料在980 nm红外光激发下,能发出不同颜色的可见光,与传统的荧光物质相比,上转换纳米荧光材料作为荧光材料探针,干扰小,具有较高的信噪比、良好的耐光以及检测灵敏度高[26].上转换荧光材料多用于生物荧光标记和生物成像[27]等方面.Qu等构建了一种上转荧光材料免疫层析技术,快速定量检测出布鲁氏菌[29].2 磁性纳米粒子用于细菌检测2.1 磁性分离纳米粒子由于具有较高的物理和化学稳定性、生产成本低、易于生物修饰,并且使用磁铁易于分离和浓缩细菌等优点[30],故在纳米医学领域,磁性纳米颗粒的应用已经变得越来越广泛.Joo小组通过连有单克隆抗体的超顺磁性Fe3O4纳米粒子从牛奶中分离出沙门氏菌[31].细菌复合物再连接到转化酶,并分散在蔗糖溶剂中,通过蔗糖水解为葡萄糖与果糖,通过血糖仪来测量葡萄糖的浓度来间接测定沙门氏细菌的浓度,检测限可达10 cfu/mL.检测原理如图3所示.图3 Fe3O4纳米粒子分离沙门氏菌原理图[31]利用磁性纳米粒子能够从复杂的溶液体系中,捕获和分离微生物细菌,分离出纯培养物用于分析实验.氨基功能化的纳米磁珠(AF-MNPs)能够有效的捕获与分离细菌,这种AF-MNPs可以快速的从水溶液、食品以及尿液中分离出细菌[32].另外,氨基修饰的Fe2O3纳米粒子与连有量子点的不同抗体结合后,形成了类似“三明治”的复合体结构,能够有效的从食品样品中分离出多种食源性致病菌细菌,检测限可达10-3 cfu/mL.使用磁性纳米粒子可以富集分离目标菌.Chockalingam研究小组发现经阿拉伯糖修饰的Fe3O4纳米粒子可用于分离检测S.aureus细菌[33],3 min内,检测限可达8～10 cfu/mL.Jin研究小组使用连接氨基酸的Fe3O4@AA能够有效的从水中分离出枯草芽孢杆菌、大肠杆菌15597,分离率很高[34].2.2 基于核磁共振技术的细菌检测近几年,一种以核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)为原理的生物大分子检测方法受到了广泛的关注.对于同一体积比的磁纳米颗粒而言,水溶液中磁纳米颗粒直径由小变大,对水中质子的T2弛豫时间的影响也由小变大.由于生物材料上具有的抗原决定簇,可以与免疫功能化磁珠的抗体特异性结合,进一步会使免疫功能化磁珠富集在生物大分子上,引起实验体系中横向弛豫时间(T2)的变化,NMR可以敏感的检测到这一变化[35].目前,这一技术路线已经在核酸、蛋白、藻类毒素等的检测中得到了应用,显示了极高的灵敏度[36].Perez等以DNA-DNA、蛋白-蛋白、蛋白-小分子以及酶相互作用为模型,证实了磁性弛豫转换(magnetic relaxation switches,MRS)能高灵敏度、高特异性的检测分子间的相互关系,并且在混合体系中(如全细胞融胞产物),这一变化能被直接检测[37].Colombo等研究表明,采用生物功能化的磁珠,结合横向弛豫时间的变化(ΔT2),可以在飞摩尔水平特异性的检测人血清白蛋白(anti-HSA).Kim等采用NMR方法开展的对人绒毛膜促性腺激素(hCG)的检测研究表明[38],最低检测限达到3.57 nmol/L.Wei ma等的研究表明,采用基于低场磁共振方法的免疫传感器,可以在一个反应中高灵敏度的检测湖水中的环形七肽微囊藻毒素[39],检测限达到0.6 ng/g,检测范围为1～18 ng/g.在对微生物样本的检测中,Koh等采用NMR免疫传感器对流感病毒抗体的检测表明,检测灵敏度可以达到1.4×10-7 mol.Perez等采用NMR方法对单纯性疱疹病毒(HSV)与腺病毒(ADV)检测研究表明,最低可以在10μL体系中检测到5个病毒粒子[37].Kaittanis等构建了NMR免疫探针,对血液与牛奶中的鸟分枝杆结核菌(MAP)进行检测研究,最低检测限达到15.5cfu/mL.Kaittanis等采用葡聚糖包被的NMR探针,对血液中的金黄色葡萄球菌进行药敏评价,研究了在复杂、不透明体系中NMR免疫探针检测方法的可行性[40].Zhao等构建了连接阪崎肠杆菌抗体的NMR传感器,检测中当溶液中细菌数目增多,E.sakazakii 抗原会竞争溶液中有限数目的纳米磁珠,导致T2的改变.NMR免疫探针核磁共振检测方法,不仅能在复杂体系中高灵敏度、特异性的检测目标生物分子,而且具有目标浓度越低,ΔT2值越高的特点[41].3 展望传统的食源性细菌检测耗费时间较长,检测灵敏度较低,而基于纳米粒子的检测技术为有效快速检测致病菌提供了技术支持;生物传感器逐渐成为成本合理的便携式设备,具有高灵敏度、使用方便等优点,但挑战依然存在,超灵敏度细菌检测依然存在挑战;依据纳米粒子的生物传感器为同时检测多种细菌提供了良好的依据;纳米粒子提供了信号放大的作用,同时具有光学及电学特性,使部分细菌的超灵敏度检测成为可能,将纳米粒子检测应用于更多微生物致病菌的研究需要研究者不断地探索;使用不同尺寸的量子点可以同时检测大肠杆菌和鼠伤寒杆菌.尽管量子点用于检测食品、农业、环境样品中病原体可行性很高,但如何生产出大规模具有生物相容性并且薄的量子点仍然是一个挑战.参考文献:[1] SYED M A,BOKHARI S.Gold Nanoparticle Based Microbial Detection and Identification[J].Journal of Biomedical Nanotechnology,2011,7(2):229-237.[2] BISSONNETTE L,BERGERON G.Multiparametric technologies for the diagnosis of syndromic infections[J].Clinical MicrobiologyNewsletter,2012,34(20):159-168.[3] DORIA G,CONDE J,VEIGAS B,et al.Noble metal nanoparticles for biosensing applications[J].Sensors,2012,12(2):1657-1687.[4] VALIZADEH A,MIKAEILI H,SAMIEI M,FARKHANI S M,et al.Quantum dots:Synthesis,bioapplications,and toxicity[J].Nanoscale ResearchLetters,2012,7(2):480-482.[5] JANS H,HUO Q.Gold nanoparticle-enabled biological and chemical detection and analysis[J].Chemical Society 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克罗诺杆菌主要毒力因子及致病机理研究进展费鹏; 杨同香; 陈曦; 向进乐; 赵胜娟; 徐云凤; 周莲昕; 郭鸰; 康怀彬【期刊名称】《《食品与机械》》【年(卷),期】2019(035)010【总页数】6页(P150-154,159)【关键词】克罗诺杆菌; 致病机理; 毒力因子; 研究进展【作者】费鹏; 杨同香; 陈曦; 向进乐; 赵胜娟; 徐云凤; 周莲昕; 郭鸰; 康怀彬【作者单位】河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳 471023; 东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室黑龙江哈尔滨 150030【正文语种】中文克罗诺杆菌属(Cronobacter spp.)原名阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)属，是食物中重要的条件致病菌之一[1]。

早期，阪崎肠杆菌一直被定义为黄色阴沟杆菌(Yellow-pigmented Enterobacter cloacae)，但之后的研究发现在系统发育关系上，黄色阴沟杆菌与阴沟杆菌(Enterobacter cloacae)之间存在一定的距离，且两种病原菌在生理生化特性和抗生素耐受性上也存在显著差异，因此Farmer等[2]将黄色阴沟杆菌重新命名为阪崎肠杆菌。

Iversen等[3]利用分子生物学分析手段对阪崎肠杆菌群体进行了多样性分析及DNA杂交分析，结果发现试验所用的阪崎肠杆菌的相似度只有50%以上，相似度小于分类标准中对“种”的定义，因此阪崎肠杆菌被定义为一个新的属，并命名为克罗诺杆菌属[4]，并被分为了7个种，分别为阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)、丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus)、苏黎世克罗诺杆菌(C.turicensis)、穆汀斯克罗诺杆菌(C.muytjensii)、都柏林克罗诺杆菌(C.dublinensis)、尤尼沃斯克罗诺杆菌(C.universalis)、康帝蒙提克克罗诺杆菌(C.condimenti)[5]。