PART C 酶工程实验实验二十一固定化α-淀粉酶及活性测定一、实验目的和原理目的：学会交联法制备固定化酶的操作技术内容：制备固定化酶的方法很多，利用双功能试剂或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间，或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法称为交联法，本实验即采用这种方法。
交联剂为戊二醛，载体为甲壳素。
二、实验器材1．恒温水浴锅2．恒温振摇仪三、实验试剂1. 5%戊二醛2. 甲壳素3. 碘原液：称取碘1.1g。
碘化钾2.2g，置于小烧杯中，加10ml蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中。
再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至50ml。
摇均后放于棕色试管中备用。
4. 比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，再用蒸馏水定容至5000ml。
5. 2%淀粉溶液：称取2g可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。
然后在搅拌下注入沸腾的蒸馏水中，继续煮沸一分钟，冷却后加蒸馏水定容至100ml。
6. pH6磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液：称取磷酸二氢钠（Na2HPO4.12H2O）45.23g,柠檬酸（C6H8O7.H2O）8.07g,先在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定容至1000ml。
7. 标准终点色溶液，A液：精确称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2493g和重洛酸钾（K2GrO7）0.4878g，用蒸馏水定容至500ml.B液:：精确称取络黑T40mg，用蒸馏水定容至100ml.同时取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱中待用。
混合液在15天内使用有效。
四、实验操作（一）酶液的制备精确称取α-淀粉酶2g，先用少量40℃pH6的磷酸二氢钠——柠檬酸缓冲液溶解，溶解过程中轻轻用玻璃棒捣研。
将上层液小心倾入100ml容量瓶，沉渣部分再加入少量上述缓冲液，如此反复捣研3—4次。
最后，将溶液与残渣全部移入容量瓶中，用缓冲液先定容摇匀后，通过四层纱布过滤，溶液供测定使用。
《α-淀粉酶的固定化与淀粉水解作用的检测》实验方案第二实验班一组组长：张金昌组员：胡建军、朱恩梅、石仙竹、谢娟丽、李昀奕、郭天天2013．10.15α-淀粉酶的固定化与淀粉水解作用的检测一、实验背景资料：1、酶：活细胞产生的具有催化作用的有机物，其中绝大多数酶是蛋白质；具有高效性、专一性，同时，也有高度不稳定性，因为绝大多数酶的本质是蛋白质，凡是能使蛋白质变性的因素，如高温、高压、强酸、强碱等都会使酶丧失活性。
2、酶促反应：指由酶作为催化剂进行催化的化学反应；3、α-淀粉酶：为枯草杆菌的α-淀粉酶，其作用的最适PH为5.5~7.5，最适温度为50~70℃。
广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。
此酶既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖；在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。
4、固定化酶：借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定的空间内并仍具有催化活性的酶制剂。
酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化。
吸附法是酶分子吸附于水不溶性的载体上，它的优点是操作简便，条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可以反复使用。
5、吸附剂：常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。
活性炭：活性炭是一种多孔性的含炭物质, 它具有高度发达的孔隙构造, 是一种极优良的吸附剂, 每克活性炭的吸附面积更相当于八个网球埸之多. 而其吸附作用是藉由物理性吸附力与化学性吸附力达成. 其組成物质除了炭元素外，尚含有少量的氢、氮、氧及灰份，其結构则为炭形成六环物堆积而成。
由于六环炭的不规则排列，造成了活性炭多微孔体积及高表面积的特性。
硅胶：硅胶是由硅酸凝胶mSiO2·nH2O适当脱水而成的颗粒大小不同的多孔物质。
具有开放的多孔结构，比表面（单位质量的表面积）很大，能吸附许多物质，是一种很好的干燥剂、吸附剂和催化剂载体。
PS-TEPA和PS-g-PEG 树脂固定化α-淀粉酶及其酶学研究王峰1*，梁力曼1，顾正彪2，崔正刚11江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡（214122）2江南大学食品学院，江苏无锡（214122）E-mail：peakwf@摘要：以接枝四乙烯五胺、聚乙二醇链的聚离子长链聚苯乙烯树脂作为载体固定化α淀粉酶。
经研究发现，聚苯乙烯四乙烯五胺树脂(PS-TEPA)对α淀粉酶的最大酶活吸附率在温度30℃、pH8.0、固定化时间为8小时的条件下达到83％；聚苯乙烯-g-聚乙二醇树脂(PS-g-PEG)的最大酶活吸附率在温度40℃，pH7.0，固定化时间为10.5小时的条件下达到60％。
戊二醛的参与未能提高酶的固定化量。
固定化后，酶催化反应的v max/K m比上升，维持稳定活力的温度和pH值范围拓宽。
酶失活半衰期t1/2延长。
关键词：PS-TEPA和PS-g-PEG；α-淀粉酶；固定化；催化；酶学与自由酶相比，固定化酶具有容易回收、可连续操作、后加工过程简化、酶稳定性增强等特点[1]。
基于这些优点，固定化酶已广泛应用于食品技术、生物工艺学、生物医学和分析化学等领域[2]。
酶固定化后催化反应发生的最适温度、最适pH值、最适底物浓度等条件的变化取决于酶和载体的种类，以及酶的固定化条件和方法[3]。
酶的固定化方法有吸附法、共价法、包埋法和交联法四大类。
吸附法的优势在于操作简单、反应条件温和、载体可反复使用，不足之处是酶易脱落。
主要原因有：一、载体的吸附力弱；二、与载体直接结合的酶蛋白分子会与载体的刚性表面发生碰撞，从而为酶蛋白分子维持正常(天然)构象造成困难[4]。
α-淀粉酶广泛应用于单糖、双糖和活性多糖的生产过程。
国内外报道的α-淀粉酶吸附固定化的载体有：壳聚糖[5]、磁性聚乙烯醇缩丁醛微球[6]、氧化锆和氧化铝吸附[7, 8]、超多孔纤维素[9]、中孔性的硅石[10]、离子交换树脂MB150[11]等。
实验：α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用背景资料一、酶酶（enzyme）催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。
是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。
绝大多数酶的化学本质是蛋白质。
具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。
1．高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快；2．专一性：一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽；因此在食用酵素当今在功能上，主要有四种：高浓缩SOD酵素如复方天然酵素主要用于乳腺瘤、子宫肌瘤、卵巢囊肿等肿瘤方面；长生酵素直接补脾补肾补气血，全面调理；纤体酵素专门转化脂肪减肥；肠毒清酵素则专门清理肠皱褶的毒素。
3．多样性：酶的种类很多，大约有5000多种，其中可以通过食用补充的酵素达2000多种；形态上主要有三种：专业级酵素为酵素胶囊，其次为酵素粉，而液体酵素含量低、效价低、易腐败而安全性较差一些，食用风险较高。
4．温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的，因此，纯正酵素是中性的，温和的，不存在副作用，或“好转反应”。
对于有刺激性而必然存的“好转反应”，除了本身腐败以外，也有可能有药品的添加。
5．活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。
6.易变性：大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏；7.有些酶的催化性与辅助因子有关。
酶与无机催化剂的比较但酶易受环境影响而失活，包括温度、PH值等，例如一般来说动物体内的酶最适温度在35到40℃之间，植物体内的酶最适温度在40-50℃之间；细菌和真菌体内的酶最适温度差别较大，有的酶最适温度可高达70℃。
动物体内的酶最适PH大多在6.5-8.0之间，但也有例外，如胃蛋白酶的最适PH为1.8，植物体内的酶最适PH大多在4.5-6.5之间。
另外，反应中反应产物和酶的分工和回收困难等缺点限制了酶在工业上的广泛应用。
