固定化α-淀粉酶及活性测定

α–淀粉酶活力测定----目视碘比色法一实验目的1. 了解α–淀粉酶酶活力测定原理。

2．掌握α–淀粉酶酶活力测定的方法步骤。

二、实验原理比色法作为一种定量分析的方法，是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。

常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯比尔定律 (A＝kLC)为基础。

酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位（U）（active unit）表示。

1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”（IU）来表示酶的活力，规定为：在最适条件（25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位，即1IU = 1μmol /min。

这样酶的含量就可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示（U/g或U/ml）。

淀粉（紫蓝色，30分子以上）红色糊精（红棕色，7-30分子）无色糊精（7分子以下）、麦芽糖不显色。

通过测定酶促反应分解一定量淀粉的时间，以标准糊精（红色糊精）和碘反应的颜色作为终点指示（所给定的淀粉都已转化为糊精的时间）。

碘比色法酶活力规定：在60℃条件下，1小时转化1g 淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位。

三、实验操作1．取试管1支，加入1ml标准糊精和3ml 标准稀碘液。

2．取锥形瓶一个，加入2%淀粉20ml和Ph6.0的缓冲液5ml。

3．将锥形瓶置于60℃水浴中，保温5分钟。

4．在比色盘中加入比色碘液，每穴2滴。

5．在锥形瓶中加入淀粉酶溶液2 ml，摇匀，开始计时。

6．在反应的前4分钟，每隔1分钟从锥形瓶中取1滴液体，与比色稀碘液混合，而后，每隔30秒从锥形瓶中取1滴液体与稀碘液混合，直至呈色与终点色一致。

四、酶活性计算实验注意事项：（1）测定酶促反应在锥形瓶中进行，标准反应在试管中进行。

（2）比色盘第1号位加入标准糊精和2滴标准碘液。

（3）应时间大约在10-15分钟。

PART C 酶工程实验实验二十一固定化α-淀粉酶及活性测定一、实验目的和原理目的：学会交联法制备固定化酶的操作技术内容：制备固定化酶的方法很多，利用双功能试剂或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间，或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法称为交联法，本实验即采用这种方法。

交联剂为戊二醛，载体为甲壳素。

二、实验器材1．恒温水浴锅2．恒温振摇仪三、实验试剂1. 5%戊二醛2. 甲壳素3. 碘原液：称取碘1.1g。

碘化钾2.2g，置于小烧杯中，加10ml蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中。

再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至50ml。

摇均后放于棕色试管中备用。

4. 比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，再用蒸馏水定容至5000ml。

5. 2%淀粉溶液：称取2g可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。

然后在搅拌下注入沸腾的蒸馏水中，继续煮沸一分钟，冷却后加蒸馏水定容至100ml。

6. pH6磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液：称取磷酸二氢钠（Na2HPO4.12H2O）45.23g,柠檬酸（C6H8O7.H2O）8.07g,先在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定容至1000ml。

7. 标准终点色溶液，A液：精确称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2493g和重洛酸钾（K2GrO7）0.4878g，用蒸馏水定容至500ml.B液:：精确称取络黑T40mg，用蒸馏水定容至100ml.同时取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱中待用。

混合液在15天内使用有效。

四、实验操作（一）酶液的制备精确称取α-淀粉酶2g，先用少量40℃pH6的磷酸二氢钠——柠檬酸缓冲液溶解，溶解过程中轻轻用玻璃棒捣研。

将上层液小心倾入100ml容量瓶，沉渣部分再加入少量上述缓冲液，如此反复捣研3—4次。

最后，将溶液与残渣全部移入容量瓶中，用缓冲液先定容摇匀后，通过四层纱布过滤，溶液供测定使用。

中温α–淀粉酶酶活测定一、原理α–淀粉酶制剂能将淀粉链中的α-1，4-葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特性反应应逐渐消失，呈现棕红色，其颜色消失的速度与酶活性有关，据此可通过反应后的吸光度计算酶活力。

二、试剂和溶液1. 碘2. 碘化钾3. 原碘液：称取11.0g碘和22.0g碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500mL，贮存于棕色瓶中。

4. 稀碘液：吸取原碘液2.00mL，加20.0g碘化钾并定容至500mL，贮存于棕色瓶中。

5. 可溶性淀粉溶液（20g/L）:称取2.000g（精确至0.001g）可溶性淀粉（以绝干计）于烧杯中，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓缓加入70mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100mL。

溶液现配现用。

6. 磷酸缓冲液（pH=6.0）：称取45.23g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和8.07g柠檬酸（C6H8O7·H2O）,用水溶解并定容至1000mL。

用pH计校正后用。

7. 盐酸溶液[c（HCL）=0.1mol/L]：按GB/T601配制。

三、仪器1. 分光光度计。

2. 恒温水浴：控温精度±0.1℃。

3. 自动移液器。

4. 试管：25mm×200mm。

5. 秒表。

四、分析步骤1. 待测酶液的制备称取1g~2g酶粉（精确至0.0001g）或准备吸取酶液1.00mL，用少量磷酸缓冲液（2.6）充分溶解，将上清液小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液（2.6）充分研磨，最终样品全部移入定量瓶中，用磷酸缓冲液（2.6）定容至刻度，摇匀。

用四层纱布过滤，滤液待用。

注：待测中温α–淀粉酶酶液活力控制酶浓度在3.4u/Ml~4.5u/mL范围内，待耐高温α-淀粉活力控制酶浓度在60u/Ml~65u/mL范围内。

2. 测定---吸取20.0mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液5.00mL，摇匀后，置于60℃±0.2℃（耐高温α-淀粉酶制剂于70℃±0.2℃）恒温水浴中预热8min；---加入1.00mL稀释好的待测酶液，立即计时，摇匀，准确反应5min；---立即用自动移液吸取1.00mL反应液，加到预先盛有0.5mL盐酸溶液和5.00mL稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5mL盐酸溶液和5.00mL稀碘液为空白，于660nm波长下，用10mm比色皿迅速定其吸光度（A）.五、计算1. 根据吸光度查表A.1，求得测试酶液的浓度。

《α-淀粉酶的固定化与淀粉水解作用的检测》实验方案第二实验班一组组长：张金昌组员：胡建军、朱恩梅、石仙竹、谢娟丽、李昀奕、郭天天2013．10.15α-淀粉酶的固定化与淀粉水解作用的检测一、实验背景资料：1、酶：活细胞产生的具有催化作用的有机物，其中绝大多数酶是蛋白质；具有高效性、专一性，同时，也有高度不稳定性，因为绝大多数酶的本质是蛋白质，凡是能使蛋白质变性的因素，如高温、高压、强酸、强碱等都会使酶丧失活性。

2、酶促反应：指由酶作为催化剂进行催化的化学反应；3、α-淀粉酶：为枯草杆菌的α-淀粉酶，其作用的最适PH为5.5~7.5，最适温度为50~70℃。

广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。

此酶既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖；在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。

4、固定化酶：借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定的空间内并仍具有催化活性的酶制剂。

酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化。

吸附法是酶分子吸附于水不溶性的载体上，它的优点是操作简便，条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可以反复使用。

5、吸附剂：常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。

活性炭：活性炭是一种多孔性的含炭物质, 它具有高度发达的孔隙构造, 是一种极优良的吸附剂, 每克活性炭的吸附面积更相当于八个网球埸之多. 而其吸附作用是藉由物理性吸附力与化学性吸附力达成. 其組成物质除了炭元素外，尚含有少量的氢、氮、氧及灰份，其結构则为炭形成六环物堆积而成。

由于六环炭的不规则排列，造成了活性炭多微孔体积及高表面积的特性。

硅胶：硅胶是由硅酸凝胶mSiO2·nH2O适当脱水而成的颗粒大小不同的多孔物质。

具有开放的多孔结构，比表面（单位质量的表面积）很大，能吸附许多物质，是一种很好的干燥剂、吸附剂和催化剂载体。

PS-TEPA和PS-g-PEG 树脂固定化α-淀粉酶及其酶学研究王峰1*，梁力曼1，顾正彪2，崔正刚11江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡（214122）2江南大学食品学院，江苏无锡（214122）E-mail：peakwf@摘要：以接枝四乙烯五胺、聚乙二醇链的聚离子长链聚苯乙烯树脂作为载体固定化α淀粉酶。

经研究发现，聚苯乙烯四乙烯五胺树脂(PS-TEPA)对α淀粉酶的最大酶活吸附率在温度30℃、pH8.0、固定化时间为8小时的条件下达到83％；聚苯乙烯-g-聚乙二醇树脂(PS-g-PEG)的最大酶活吸附率在温度40℃，pH7.0，固定化时间为10.5小时的条件下达到60％。

戊二醛的参与未能提高酶的固定化量。

固定化后，酶催化反应的v max/K m比上升，维持稳定活力的温度和pH值范围拓宽。

酶失活半衰期t1/2延长。

关键词：PS-TEPA和PS-g-PEG；α-淀粉酶；固定化；催化；酶学与自由酶相比，固定化酶具有容易回收、可连续操作、后加工过程简化、酶稳定性增强等特点[1]。

基于这些优点，固定化酶已广泛应用于食品技术、生物工艺学、生物医学和分析化学等领域[2]。

酶固定化后催化反应发生的最适温度、最适pH值、最适底物浓度等条件的变化取决于酶和载体的种类，以及酶的固定化条件和方法[3]。

酶的固定化方法有吸附法、共价法、包埋法和交联法四大类。

吸附法的优势在于操作简单、反应条件温和、载体可反复使用，不足之处是酶易脱落。

主要原因有：一、载体的吸附力弱；二、与载体直接结合的酶蛋白分子会与载体的刚性表面发生碰撞，从而为酶蛋白分子维持正常(天然)构象造成困难[4]。

α-淀粉酶广泛应用于单糖、双糖和活性多糖的生产过程。

国内外报道的α-淀粉酶吸附固定化的载体有：壳聚糖[5]、磁性聚乙烯醇缩丁醛微球[6]、氧化锆和氧化铝吸附[7, 8]、超多孔纤维素[9]、中孔性的硅石[10]、离子交换树脂MB150[11]等。

α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测精品课件(一)α淀粉酶是一种催化淀粉分解的酶，具有广泛的应用价值，在食品工业、饲料工业、医药工业和纺织工业都有重要的应用。

对于α淀粉酶的固定化和淀粉水解作用的检测具有重要的研究价值。

本文将介绍α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测精品课件。

一、α淀粉酶的固定化1. 研究目的α淀粉酶固定化的目的是利用固定化技术提高酶的稳定性和活性，使其在工业应用中更加优越。

2. 固定化方法（1）吸附法：将酶直接吸附在固体载体表面上，如硅胶、纤维素等。

（2）共价结合法：通过化学反应将酶共价结合在载体上，如聚酰胺凝胶。

（3）交联法：利用交联剂将酶与载体交联，形成固定化酶。

3. 固定化效果α淀粉酶经过固定化后，具有更好的稳定性和活性，可以提高酶的使用寿命和效率。

二、淀粉水解作用的检测1. 研究目的淀粉水解作用的检测旨在测定酶水解淀粉的效率，评价酶的性能和应用价值。

2. 检测方法（1）碘酒法：将淀粉样品与酶一起加入反应体系中，加入碘酒滴定，在淀粉被水解完全后，碘酒滴定出现无色。

（2）比色法：将淀粉样品与酶一起加入反应体系中，加入糖色再经比色，根据测试淀粉的浓度，推算出酶的效率。

（3）电化学法：利用电化学技术测定反应体系中的还原电位，根据反应体系的电化学响应来测定淀粉水解的效率。

3. 检测效果通过淀粉水解作用的检测，可以评估α淀粉酶的性能和应用价值，指导其在工业应用中的使用。

综上所述，α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测是酶学研究领域中的重要课题。

本文介绍了α淀粉酶的固定化方法、效果，以及淀粉水解作用的检测方法和效果，对于淀粉酶及其应用研究人员具有重要的参考价值。

实验一α－淀粉酶活力‎的测定一、实验目的通过本实验‎，使学生掌握‎α-淀粉酶活力‎测定的基本‎原理、方法和操作‎技能。

二、实验原理α-淀粉酶能将‎淀粉分子链‎中的α-1,4葡萄糖苷‎键随机切断‎成长短不一‎的短链糊精‎、少量麦芽糖‎和葡萄糖，而使淀粉对‎碘呈蓝紫色‎的特异性反‎应逐渐消失‎，呈红棕色，其颜色消失‎的速度与酶‎活力有关，故可通过固‎定反应后的‎吸光度计算‎其酶活力。

三、实验试剂和‎仪器（一）试剂1. 原碘液称取碘（I2）11g，碘化钾（KI）22g，用少量水使‎碘完全溶解‎，然后定容至‎500mL‎，贮于棕色瓶‎中。

2. 稀碘液吸取原碘液‎2.00mL，加碘化钾2‎0g，用水溶解并‎定容至50‎0mL，贮于棕色瓶‎中。

3. 20g／L可溶性淀‎粉溶液称取可溶性‎淀粉（以绝干计）2 000g．精确至0.001g，用水调成浆‎状物．在搅动下缓‎缓倾入70‎m L沸水中‎。

然后，以30mL‎水分几次冲‎洗装淀粉的‎烧杯，洗液并入其‎中，加热至完全‎透明，冷却，定容至10‎0m L。

此溶液需要‎当天配制。

注：采用浙江菱‎湖食品化工‎联合公司生‎产的可溶性‎淀粉。

4. 磷酸缓冲液‎（pH6.0）称取磷酸氢‎二钠（Na2HP‎O4·12H2O‎）45.23g、柠檬酸（C6H8O‎7·H2O）8.07g，用水溶解并‎定容至1 000mL‎。

配好后用p‎H计校正。

（二）仪器1. 分光光度计‎应符合GB‎9721的‎有关规定2. 秒表3. 恒温水浴（60±0.2）℃4. 试管25m‎m×2000m‎m四、实验步骤1. 待测酶液的‎制备称取酶粉l‎-2g，精确至0.0002g‎（或吸取液体‎酶100m‎L），先用少量的‎磷酸缓冲液‎溶解，并用玻璃搅‎拌棒捣研，将上清液小‎心倾入容量‎瓶中，沉渣部分再‎加入少量缓‎冲液，如此捣研3‎-4次，最后全部移‎入容量瓶中‎，用缓冲液定‎容至刻度（将估计酶活‎力除以4，即酶活力应‎在3.7-5.6IU／mL范围内‎），摇匀。