α-淀粉酶的固定化及淀粉水解2
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实验6 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
【知识准备】
1．背景知识
1752年，法国物理学家列奥米尔用鹰作实验对象，让鹰吞下几个装有肉的小金属管，管壁上的小孔能使胃内的化学物质作用到肉上。
当鹰吐出这些管子的时候，管内的肉已部分分解了，管中有了一种淡黄色的液体。
1777年，苏格兰医生史蒂文斯从胃里分离一种液体（胃液），并证明了食物的分解过程可以在体外进行。
1834年，德国博物学家施旺把氯化汞加到胃液里，沉淀出一种白色粉末。
除去粉末中的汞化合物，把剩下的粉末溶解，得到了一种浓度非常高的消化液，他把这粉末叫作“胃蛋白酶”。
同时，两位法国化学家帕扬和佩索菲发现，麦芽提取物中有一种物质，能使淀粉变成糖，变化的速度超过了酸的作用，他们称这种物质为“淀粉酶制剂”.
酶是生物体内各种化学反应的催化剂，它有高度的专一性和高效性。
但酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。
为了解决这一问题,科学家进行了没得固定化研究.固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。
酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。
固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
酶是生物体内各种化学反应的催化剂，它有高度的专一性和高效性。
但酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。
固定化酶就是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。
酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。
便于运输和贮存，有利于自动化生产，但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间。
固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。
2．实验原理
本实验是采用吸附法制备固定化酶。
（1）使用的吸附剂是石英砂，石英砂是由天然矿石粉碎而成，它的化学成分是二氧化硅，其化学反应活性很低。
（2）使用的α-淀粉酶通常由枯草杆菌深层发酵制备，具有较强的液化淀粉的能力，可用
于制备糊精，其最适pH5.5～7.5，最适温度50℃～75℃。
3．各种淀粉酶水解淀粉的反应如下：
α-淀粉酶只将淀粉水解为糊精，淀粉溶液加入KI-I2指示溶液时显现蓝色，而转变成糊精后显现红色。
将吸附有α-淀粉酶的石英砂装柱，使淀粉溶液流过柱，若柱的流出液在加入KI-I2溶液时可看到溶液呈现红色，表明水解产物中有糊精。
α-淀粉酶制成不溶性的固定化酶后，酶的稳定性增加，包括酶对热的稳定性，对蛋白酶的抵抗能力、对各种试剂的稳定性都不同程度地增加。
由于稳定性增加，保存期也相应延长，数日内酶活力不减。
4．思考题
①为什么使用石英砂作为酶的吸附剂？
②如何证明α-淀粉酶已将淀粉水解？
③如何证明洗涤固定化酶的流出液中没有淀粉酶？
【实验目的】
1．制备固定化的α-淀粉酶
2．固定化的α-淀粉酶水解淀粉的测定
【材料用具】
α-淀粉酶溶液，0.5%淀粉溶液，石英砂，5mmol/L KI-I2溶液，蒸馏水
5ml层析柱 50mL烧杯， 250mL烧杯，滴管，玻璃棒，点样板
铁架台
【实验步骤】
一、新制淀粉固定化酶
1．用50ml小烧杯称取5g石英砂，加入2ml α–淀粉酶溶液，浸泡10分钟，使α–淀粉酶固定到石英砂上。
在等候期间可以先完成实验步骤“二”。
2．用10～15ml的蒸馏水清洗石英砂后，取清洗液2滴加到点样板上，同时滴加0.5%淀粉溶液混匀，再加入1滴KI-I2溶液，若溶液变为蓝色，说明未固定到石英砂上的α–淀粉酶已完全除去。
反之，需要重复这一步骤。
3．固定有α–淀粉酶的石英砂装入层析柱，将酶柱固定在铁架台上，用滴管加0.5 % 淀
粉溶液，使淀粉溶液约以10滴/ 分的流速过柱。
4．将5滴淀粉溶液加入1号点样孔，再滴加1滴KI-I2溶液，观察颜色变化（对照1）。
将5滴清水加入2号点样孔，再滴加1滴KI-I2溶液，观察颜色变化（对照2）。
5．将流出的反应液每5滴按顺序加在3-12号点样孔中，再加1滴KI-I2溶液，观察颜色变化（待测样品）。
记录实验结果。
6．实验后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤酶柱，放置在4℃冰箱中保存，几天后再重复上述实验，看是否有相同的结果。
二、检验其他班同学几天前制作的固定化酶的催化效果
【结果分析和实验结论】
1．本实验为什么要确定10滴/分的流速？加快流速是否能出现相同的结果？
2．石英砂是怎样固定α-淀粉酶的？你得出此结论的依据是什么？
3．本实验中对照1和对照2各有什么作用？
4．根据实验步骤二的结果，评价一下α-淀粉酶固定化酶的稳定性，并陈述你的理由。
实验结束时，请清理桌面。
不要清洗用于固定淀粉酶的烧杯。
凡是被发现水池中有石英砂的桌子，学号与该桌号相同的同学，将被扣减一定的分数。
